Summary

Generatie Lymfatische micropartikels en Detectie van hun proapoptotische Effect op epitheelcellen

Published: February 20, 2015
doi:

Summary

Celhuid werpen microdeeltjes (MPs) actief biologische blaasjes die kunnen worden geïsoleerd en de pathofysiologische effecten onderzocht in verschillende modellen. Hier beschrijven we een werkwijze voor het genereren MPs afgeleid van T-lymfocyten (LMPs) en voor het aantonen van hun pro-apoptotische effect op epitheelcellen.

Abstract

De belangstelling voor de biologische rol van cel-membraan afgeleide blaasjes in cel-cel communicatie is de afgelopen jaren toegenomen. Microdeeltjes (MPs) zijn een dergelijk type van vesicles, variërend in diameter van 0,1 urn tot 1 urn, en kenmerkend schuur van het plasmamembraan van eukaryote cellen die activering of apoptose. Hier beschrijven we de generering van T-lymfocyten afkomstige microdeeltjes (LMPs) van apoptotische CEM T-cellen gestimuleerd met actinomycine D. LMPs worden geïsoleerd door een meerstaps proces differentiële centrifugatie en gekarakteriseerd met behulp van flowcytometrie. Het protocol stelt ook een in situ celdood detectiemethode voor aantonen van de pro-apoptotische effect van LMPs op bronchiale epitheelcellen afkomstig uit muizen primaire luchtwegen bronchiale weefselexplantaten. Hierin beschreven werkwijzen verschaffen een reproduceerbare werkwijze voor het isoleren overvloedige hoeveelheden LMPs van apoptotische lymfocyten in vitro. LMPs afgeleidop deze wijze kan worden gebruikt om de kenmerken van diverse ziektemodellen evalueren en farmacologie en toxicologie getest. Aangezien het luchtwegepitheel biedt een beschermende fysieke en functionele barrière tussen de buitenomgeving en het onderliggende weefsel, gebruik van bronchiale weefselexplantaten plaats geïmmortaliseerde epitheliale cellijnen een effectief model voor het onderzoek ter luchtwegen luchtwegweefsel.

Introduction

Microparticles (MPs) are biologically active submicron membrane vesicles released following cell activation or apoptosis. MPs are derived from both healthy and damaged cells and are implicated in many physiological and pathological processes.1 MPs have been detected not only in human plasma, but also in inflammatory and apoptotic tissue. The biological utility of cell membrane–derived MPs has been demonstrated in various settings, including cell signalling models and as pharmacological tools.2,3 We previously demonstrated that LMPs derived from T lymphocytes following actinomycin D stimulation (to induce apoptosis) suppress angiogenesis and inhibit endothelial cell survival and proliferation.4,5 The antiangiogenic effects of LMPs may vary significantly depending on the stimuli used to activate T lymphocytes in vitro.6

The airway epithelium functions as a protective physical and functional barrier. Increased numbers of T lymphocytes in the airway can contribute to cell damage and airway inflammation.7 We have shown that LMPs induce apoptosis of human bronchial epithelial cells,8 which indicated LMPs may change barrier function of bronchial epithelium in vivo. Apoptotic cells can be identified using the TUNEL method, which detects in situ DNA fragmentation.

The overall goal of this protocol is to illustrate the in vitro production of LMPs from a T lymphocyte cell line, and to demonstrate their proapoptotic effect on airway epithelial cells. In situ cell death detection demonstrated that LMPs strongly induce airway bronchial epithelial cell death, suggesting that LMPs-mediated injury to the airway epithelium may impact barrier function of the damaged epithelium.

Protocol

OPMERKING: Man C57BL / 6 muizen (5-7 weken oud) zijn van Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canada.) En gemanipuleerd volgens de protocollen door de CHU Sainte-Justine Animal Care Comité is goedgekeurd. Mouse bronchiale weefselexplantaten een goede bron van primaire bronchiale epitheelcellen onderzoeken van de pro-apoptotische effecten van LMPs op epitheelcellen. Dit protocol beschrijft de in vitro generatie van LMPs, alsmede een werkwijze voor het detecteren van apoptotische …

Representative Results

LMPs werden gekenmerkt met annexine V-kleuring 10 door fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) analyse en gated met behulp van 1 micrometer kralen, waarin 97% van de parlementsleden (≤1 micrometer) waren annexine-V-Cy5 positief (figuur 1A en 1B). Typisch, ongeveer 2,5 mg LMPs werden verkregen na dit protocol. Bronchiale weefselexplantaten van C57BL / 6 muizen werden blootgesteld aan het voertuig en LMPs behandeling. Histopathologische analyse van bronchiale secties toonde het effect…

Discussion

Kamerleden zijn actieve bemiddelaars van intercellulaire overspraak en hun studie is veelbelovend in veel gebieden van de wetenschap. 11 Deze studie presenteerde een gedetailleerd protocol voor in vitro grootschalige opwekking van LMPs afgeleid van een apoptotische T-cellijn. Deze Kamerleden drukken een groot repertoire van lymfocyten moleculen en zijn biologisch betrokken bij de regulatie van de cellulaire en weefselhomeostase. Echter, LMPs afkomstig van verschillende bronnen kunnen biologisch versc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Canadese Institutes of Health Research (178.918), Fonds de recherche en santé du Québec – Vision Health Research Network.

Materials

LMPs production and characterization
CEM T cells  ATCC  CCL-119
X-VIVO 15 medium  Cambrex, Walkersville 04-744Q
Flask T75 Sarstedt 83.1813.502
Flask T175 Sarstedt 83.1812.502
Actinomycin D  Sigma Chemical Co. A9415-2mg
PBS Lifetechnologies 14190-144
0.22µm filter Sarstedt 83.1826.001
Annexin-VCy5 BD Pharmagen  559933
FACS flow solution BD Bio-sciences 342003
Fluorescent microbeads (1 um) Molecular Probes  T8880
Polysterene counting beads (7 um) Bangs laboratories PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes Falcon 352058
1 ml pipet Fisher 13-678-11B
5 ml pipet Falcon 357543
25 ml pipet Ultident DL-357551
1,5 ml conical polypropylene micro tube Sarstedt 72.690
15 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.554.205
50 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube Nalgene 3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle Beckman 356011
Protein assay (Bradford assay) Bio-Rad Laboratories 500-0006
Protein assay standard II Bio-Rad Laboratories 500-0007
Test tube 16×100 VWR 47729-576
Test tube 12×75 Ultident 170-14100005B
Cell incubator  Mandel Heracell 150
Low speed centrifuge IEC Centra8R
High speed centrifuge Beckman Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle Beckman JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube Beckman JA30.50
Fow cytometry  BD Bio-sciences FACS Calibur
Spectrophotometer Beckman Series 600
Bronchial tissue explants and sections 
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)   Charles River Laboratories, Inc. 
Mouse Airway PrimaCell™ System: CHI Scientific, Inc. 2-82001
 Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades Becton Dickinson AcuteCare 371310 #10
Scalpel Handle Fine Science Tools Inc.  10003-12 #7
phase-contrast inverted microscope Olympus Optical CO., LTD.    CK2
high O2 gas mixture  VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber Billups-Rothenberg Inc. MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker Barnstead Lab-Line,  SHKA4000-7
12-well tissue culture plate Becton Dickinson and Company 353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm) Sarstedt, Inc. 83.1802
Surgical scissors Fine Science Tools Inc.  14060-09 Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps Fine Science Tools Inc.  11052-10
humidified CO2 incubator Mandel Scientific Company Inc.  SVH-51023421
 Histopathological examination 
formalin formaldehyde Sigma-Aldrich, Inc.  HT5011
paraffin Fisher scientific  International, Inc. T555
ethyl alcohol Merck KGaA, Darmstadt EX0278-1
 glutaraldehyde  Sigma-Aldrich, Inc.  G6403
Cacodylate Sigma-Aldrich, Inc.  31533
microscope slides VWR Scientific Inc.  48300-025 25x75mm
Xylene Fisher scientific  International, Inc. X5-4
Mayer's hematoxylin Sigma-Aldrich, Inc.  MHS16 Funnel with filter paper  
HCl  Fisher scientific  International, Inc.   A144s-500
eosin  Sigma-Aldrich, Inc.  HT110116 Funnel with filter paper  
Permount™ Mounting Medium Thermo Fisher Scientific Inc.  SP15-100
glass coverslip surgipath medical industries, Inc. 84503 24×24 #1 
TUNEL detection kit In Situ Cell Death Detection, POD 11 684 817 910
oven Despatch Industries Inc. LEB-1-20
rotary Microtome Leica Microsystems Inc. RM2145
filter paper Whatman International Ltd. 1003150 #3
Microscope Nikon Imaging Japan Inc. E800
staining dish complete Wheaton Industries, Inc. 900200 including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube Sarstedt Inc.  72.69 39x10mm
Orbital and Reciprocating Water Bath ExpotechUSA ORS200
phosphate buffered saline   GIBCO 14190-144
fume hood Nicram RD Service 3707E

References

  1. Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).
  2. Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R. Microparticles: targets and tools in cardiovascular disease. Trends Pharmacol Sci. 32 (11), 659-665 (2011).
  3. Benameur, T., Andriantsitohaina, R., Martinez, M. C. Therapeutic potential of plasma membrane-derived microparticles. Pharmacol Rep. 61 (1), 49-57 (2009).
  4. Yang, C., et al. Lymphocytic microparticles inhibit angiogenesis by stimulating oxidative stress and negatively regulating VEGF-induced pathways. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 294 (2), 467-476 (2008).
  5. Yang, C., Gagnon, C., Hou, X., Hardy, P. Low density lipoprotein receptor mediates anti-VEGF effect of lymphocyte T-derived microparticles in Lewis lung carcinoma cells. Cancer Biol Ther. 10 (5), 448-456 (2010).
  6. Angelillo-Scherrer, A. Leukocyte-derived microparticles in vascular homeostasis. Circ Res. 110 (2), 356-369 (2012).
  7. Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. J Immunol. 178 (12), 8090-8096 (2007).
  8. Qiu, Q., Xiong, W., Yang, C., Gagnon, C., Hardy, P. Lymphocyte-derived microparticles induce bronchial epithelial cells’ pro-inflammatory cytokine production and apoptosis. Mol Immunol. 55 (3-4), 220-230 (2013).
  9. Martin, S., et al. Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression. Circulation. 109 (13), 1653-1659 (2004).
  10. Shet, A. S., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
  11. Mause, S. F., Weber, C. Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange. Circ Res. 107 (9), 1047-1057 (2010).
  12. Yang, C., et al. Anti-proliferative and anti-tumour effects of lymphocyte-derived microparticles are neither species- nor tumour-type specific. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  13. Soleti, R., et al. Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors. Carcinogenesis. 30 (4), 580-588 (2009).

Play Video

Cite This Article
Yang, C., Xiong, W., Qiu, Q., Tahiri, H., Gagnon, C., Liu, G., Hardy, P. Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (96), e52651, doi:10.3791/52651 (2015).

View Video