Summary

Evaluering af tumorinfiltrerende leukocytundergrupper i en subkutan Tumor Model

Published: April 13, 2015
doi:

Summary

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Abstract

Specialized immunceller, der infiltrerer tumormikromiljøet regulere væksten og overlevelsen af ​​neoplasi. Maligne celler skal undvige eller undergrave anti-tumor immunrespons for at overleve og trives. Tumorer drage fordel af en række forskellige mekanismer immun "escape" herunder rekruttering af tolerogenisk DC, immunosuppressive regulatoriske T-celler (tregs) og myeloide afledte suppressorceller (MDSC), som inhiberer cytotoksiske anti-tumor respons. Omvendt kan anti-tumor effektor immunceller langsom vækst og ekspansion af maligniteter: immunstimulerende dendritiske celler, naturlige dræberceller, som huser medfødte anti-tumor immunitet, og cytotoksiske T-celler alle kan deltage i tumor suppression. Balancen mellem pro- og anti-tumor leukocytter i sidste ende afgør opførsel og skæbne for transformerede celler; et væld af humane kliniske undersøgelser har båret dette ud. Således detaljeret analyse af leukocytundergrupper indentumormikromiljøet er blevet stadig vigtigere. Her beskriver vi en fremgangsmåde til analyse af infiltrerende leukocytundergrupper stede i tumormikromiljøet i en mus tumormodel. Mouse B16 melanoma-tumorceller blev inokuleret subkutant i C57BL / 6-mus. På et bestemt tidspunkt, blev tumorer og omgivende hud reseceret en bloc og forarbejdet til enkeltcelle-suspensioner, som derefter blev farvet for flerfarvede flowcytometri. Ved hjælp af en bred vifte af leukocyt delmængde markører, var vi i stand til at sammenligne de relative procentdele af infiltrerende leukocytundergrupper mellem kontrol og chemerin-udtrykkende tumorer. Efterforskere kan bruge sådan et værktøj til at studere immun tilstedeværelse i tumormikromiljøet og når det kombineres med traditionelle skydelære størrelse målinger af tumorvækst, potentielt vil give dem mulighed for at belyse effekten af ​​ændringer i immun sammensætning på tumorvækst. En sådan teknik kan anvendes på en hvilken som helst tumor model, hvor tumoren og dens mikromiljø Cen skal resekteres og behandles.

Introduction

Balancen mellem tumorvækst og fremme og regression er delvist afhængig af balancen mellem pro- og anti-tumor infiltrerende leukocytter til stede i mikromiljø 1,2. For at undersøge tumormikromiljøet (TME) og specifikt at identificere de infiltrerende leukocytunderpopulationer, har vi udviklet en metode til vurdering af subkutane tumorer i en murin tumormodel. Vigtigheden af ​​at studere tumormikromiljøet er velkendt og støttet i litteraturen. Talrige undersøgelser har vist, at balancen i pro- og anti-tumor infiltrerende immunceller kan påvirke resultaterne af tumorvækst, ikke kun i mus, men også humane undersøgelser (oversigt i 3,4). For eksempel Curiel et al., Viste, at forværret kliniske resultater i ovariecancerpatienter blev korreleret med tilstedeværelse af stigende procentdele af tumor-infiltrerende regulatoriske CD4 + T-celler (tregs) 5. Vores eget arbejde viste også virkningen af ​​et ikkeVel leukocyt kemoattraktant på forholdet mellem leukocytundergrupper i en mus melanom model 6, som også korreleret med nedsat tumorvækst. Således de detaljerede analyser af leukocytundergrupper inden for en tumor er nu mere bredt anerkendt og stadig vigtigere.

Der er mange måder at evaluere tumormikromiljøet for infiltrerende leukocytter; for eksempel grupper har udviklet transgene mus til at udtrykke forskellige fluorescerende proteiner med henblik på at afbilde TME 7 klassisk immunhistokemi og immunofluorescens af konserverede afsnit 8, herunder forskellige afbildningsmodaliteter såsom MRI, PET, konfokal mikroskopi 9-11 – nogle med evnen til at overvåge intravitally 10,12. Disse kan anvendes med forskellige molekylære imagografimidler, såsom nanopartikler 13 eller hidtil ukendte kontrastmidler 14 mærket immunceller. Vores metode er en flowcytometri tilgang og har flere fordele.For det første kan tages prøver hele tumormikromiljøet; på tidspunktet for analysen, er hele subkutan tumor og omkringliggende periferien kirurgisk reseceret til forarbejdning. Dette eliminerer enhver potentielt prøveudtagning forspænding inden for en enkelt tumor, og giver en mere "global" analyse af tumoren som helhed. For det andet, ved hjælp af flerfarvet flowcytometri at analysere leukocytundergrupper giver os mulighed for mere specifikt at måle fænotypen af ​​infiltrerende leukocytter. Afhængig af antallet af anvendte farver, kan identificeres meget specifikke delmængder. Dette er vigtigt, da der er flere leukocytundergrupper inden for en bestemt celletype – eller endda i en generel subtype klassificering – som har forskellige funktioner, som er potentielt betydning for, skæbne tumoren. For eksempel har plasmacytoide dendritiske celler (PDC) været impliceret i anti-tumor immunitet 15. CCR9 + delmængde af pdCs har imidlertid vist sig at være tolerogen 16 og flytte balanse af sådan en delmængde kan have en indvirkning på tumorvækst.

Vores metode er egnet til subkutan eller andre tumorer, der kan resektion en bloc. I vores hænder blev tumorer ensartet resekteret på tidspunktet for eutanasi. Det er imidlertid tænkeligt, som er blevet gjort i nogle undersøgelser, at en subkutan tumor kunne resektion med lukning af den omgivende hud i en overlevelse kirurgi 17, således at yderligere vurdering af dyret. Analysen udføres derefter på den resekterede tumor. Således repræsenterer resultaterne en enkelt tidspunkterne i tumoren udvikling. Mens dette giver et detaljeret indblik i mikromiljøet, er det også et statisk billede af, hvad der er ingen tvivl om en dynamisk proces. Imidlertid isolerede leukocytter (fx via magnetisk separation eller densitetsgradient) kan derefter analyseres separat fra tumoren epitel og stroma eller anvendes i andre, funktionelle assays til yderligere at definere deres fænotype, som det har været tidli-gere beskrevet 18. Denne metode ville så være nyttig for alle forskere interesseret i at forstå sammensætningen af ​​leukocytterne i tumormikromiljøet på et givet tidspunkt, enten i indstillingen af ​​det naturlige sygdomsforløb, eller efter en bestemt terapeutisk perturbation. Selvom det ikke er gjort af os, variationer af denne procedure kan også potentielt anvendes til at analysere specifikke dele af en tumor i isolation. For eksempel, givet størrelsen af ​​tumoren, den perifere zone (r) kan dissekeres væk fra den centrale, eventuelt nekrotisk kerne af tumoren for at give forskeren en mere rumligt adskilt visning af tumormikromiljøet.

I den spirende området tumor immunologi, vil der uden tvivl være en eksponentielt stigende antal studier, der evaluerer nye immunmodulerende midler i murine tumormodeller. Adskillige rapporter har understreget forskellene i specifik leukocyt funktion i tumoren versus den perifere enjø. For eksempel Shafer-Weaver et al. Viste i en musemodel som antigen-specifik T-effektorceller CD8 + celler, medens aktiv i periferien, blev transformeret ind i CD8 + T-suppressor-celler, når de solgt til tumormikromiljøet 19. Dette var til dels på grund TGFp, men andre faktorer er sandsynligvis involveret. Således evaluering leukocytundergrupper – tal og forhold, samt funktionelle status – vil i tumoren selv give en mere nøjagtig gengivelse af effekten af ​​en særlig immunmodulation på tumor skæbne.

Vores teknik gør det muligt detaljeret analyse af tumor og giver forskeren mulighed for at tættere finde ændringer i leukocytpopulationer end tidligere metoder.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med godkendte Stanford, Palo Alto VA HCS, og National Institutes of Health Institutionelle AnimalCare og brug udvalgets retningslinjer. 1. Forberedelse til prøvetagning og Processing (Tidsforbrug: ~ 10-15 min) Podes murine B16F0 melanomceller (0,5-1 x 10 6) subkutant på eller nær midterlinien af maven i C57BL / 6-mus som beskrevet tidligere 6. Alternativt pode tumorceller på ekstra anatomiske stede…

Representative Results

Vores resultater viste, at tvungen overekspression af chemerin i murine B16 tumorer augmented procentdelen af ​​tumorinfiltrerende leukocytter (TIL'er). Derudover blev identificeret ændringer i relative forhold mellem leukocytundergrupper repræsenteret i tumormikromiljøet forbundet med chemerin ekspression. Re-print med tilladelse fra Pachynski et al. 6. Figur 1 viser, at der var en betydelig stigning i de samlede CD45 + celler (tils) inden i tum…

Discussion

Udførelse detaljeret analyse af tumormikromiljøet, er afgørende for de mekanismer og effekter af immunmodulering. Med den stigende forekomst af ImmunoTherapeutics i den humane kliniske rige, forstå virkningen af ​​disse midler på tumorinfiltrerende leukocytter bliver nødvendige i at definere deres virkningsmekanisme. Hos mennesker ofte findes der kliniske og / eller logistiske problemer med at opnå og analysere tumorvæv for leukocyt delmængde analyse, og dermed analyse af svaret perifere immun udføres ofte…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af tilskud R01-CA169354   og R01-047822   fra National Institutes of Health og en Merit Award fra Institut for Veterans Affairs (ECB). RKP blev støttet af NIH T32 CA009287-30A1, en ASCO Young Investigator Award, Californien Breast Cancer Research Project Fellowship, og en American Cancer Society mentored Research Scholar Grant; BAZ blev støttet af NIH tilskud AI079320. JM blev støttet af stipendier fra NIH T-32 uddannelse tilskud T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 og American Cancer Society ph.d.-stipendium PF-12-052-01-CSM.

Materials

Name of the Material/Equipment Company Catalog Number Comments/Description
RPMI Cellgro 10-040 http://cellgro.com; keep on ice
FBS Cellgro 35-011-CV http://cellgro.com
50 ml conical tubes Falcon 14-432-22 fischersci.com
40 micron filter Falcon 08-771-1 fischersci.com
5 ml syringe BD 14-823-35 fischersci.com
surgical scissors/forceps Roboz RS-5910 roboz.com
PBS Cellgro MT-21-030-CM http://cellgro.com; keep on ice
trypan blue Cellgro MT-25-900-CI fischersci.com
hemacytometer Hausser Scientifice  02-671-54  fischersci.com
Live/Dead stain Life Technologies L34957 lieftechnologies.com
FlowJo software TreeStar, Inc flowjo.com

References

  1. Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
  2. Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
  3. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  4. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  5. Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
  6. Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
  7. Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
  8. Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
  9. Serres, S., O’Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
  10. Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
  11. Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
  12. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
  13. Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
  14. Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
  15. Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
  16. Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
  17. McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
  18. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
  19. Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
  20. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  21. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
  22. Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
  23. Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
  24. Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
  25. Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).

Play Video

Cite This Article
Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. J. Vis. Exp. (98), e52657, doi:10.3791/52657 (2015).

View Video