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Medicine

피하 종양 모델에서 종양 침투 백혈구 하위 집합의 평가

doi: 10.3791/52657 Published: April 13, 2015

Abstract

종양 미세 환경에 침투 특수 면역 세포는 종양의 성장 및 생존을 조절한다. 악성 세포는 회피 또는 생존하고 번영하기 위해 항 종양 면역 반응을 파괴해야합니다. 종양 tolerogenic DC 모집, 면역 조절 T 세포 (Tregs), 및 세포 독성 항암 반응을 억제하는 골수 유래 억제 세포 (MDSC)를 포함한 면역 상이한 메커니즘 번호 "탈출"활용. 종양 억제에 참여할 수있는 모든 면역 자극 수지상 세포, 선천성 항 종양 면역 항구 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포 : 반대로, 항암 효과기 면역 세포는 악성 종양 성장 및 팽창을 늦출 수있다. 프로와 항 종양 백혈구 사이의 균형은 궁극적으로 행동과 형질 전환 된 세포의 운명을 결정한다 인간의 임상 연구의 군중이를 부담했다. 백혈구 하위 집합 따라서, 상세한 분석 내종양 미세 환경은 점점 더 중요 해지고있다. 여기서 우리는 마우스 종양 모델에서 종양 미세 환경에 존재하는 백혈구 침투하는 서브 세트를 분석하기위한 방법을 설명한다. B16 마우스 흑색 종 종양 세포는 C57BL / 6 마​​우스에서 피하 접종 하였다. 지정된 시간에, 종양 주위의 피부는 일괄하여 절제 한 후 유동 세포 계측법 멀티 색상 염색 단일 세포 현탁액으로 처리됩니다. 백혈구 집합 마커의 다양한 사용하여, 우리는 제어 및 chemerin 발현 종양 사이의 백혈구 하위 집합을 침투의 상대적 비율을 비교할 수 있었다. 연구자들은 면역 종양 미세 환경에 존재하고 종양 성장의 전통적인 캘리퍼 크기 측정과 결합 될 때, 잠재적으로 그것들이 종양 성장에 면역 조성의 변화에​​ 미치는 영향을 규명 할 수 공부 이러한 도구를 사용할 수있다. 이러한 기술은 모든 종양 모델에 적용 할 수있는 종양 미세 환경과의 C이 절제되고 처리 될 수있다.

Introduction

종양의 성장 및 홍보 및 회귀 사이의 균형은, 부분적으로 미세 1, 2에 존재하는 프로와 항 종양 침투 백혈구의 균형에 따라 달라집니다. (TME)를 종양 미세 환경을 연구 구체적 침투성 백혈구 아 집단을 식별하기 위해, 우리는 쥐 종양 모델에서 피하 종양의 평가 방법을 개발 하였다. 종양 미세 환경 연구의 중요성은 잘 알려져 있으며, 문헌에지지된다. 많은 연구 프로 및 항 종양 면역 세포 침윤의 밸런스가 마우스에서뿐만 아니라, (3,4-에서 검토) 인간 결합 연구뿐만 아니라, 종양 성장의 결과에 영향을 미칠 수 있음을 보여 주었다. 예를 들어, Curiel 등은. 난소 암 환자의 임상 결과는 종양 침윤 규제 CD4 + T 세포 (Tregs) (5)의 비율을 증가의 존재와 상관 관계가 있었다 악화 것으로 나타났다. 우리 자신의 작품 또한 아무런 효과를 보여 주었다또한, 상관 관계를 마우스 흑색 종 모델 6에 백혈구 아형의 비율 VEL 백혈구 화학 유인 물질은 종양 성장을 감소시켰다. 따라서, 종양 내의 백혈구의 서브 세트 상세한 분석은 더욱 광범위하게 인식되고 점차 중요.

백혈구 침투에 대한 종양 미세 환경을 평가하는 방법에는 여러 가지가 있습니다; 능력에 일부 - 예를 들어 그룹은 이미지 TME 7, 고전 면역 조직 화학 및 MRI, PET, 공 초점 현미경 9-11 등 다양한 이미징을 포함하여 보존 섹션 8의 면역을 위해 다양한 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 쥐를 설계했다 intravitally (10, 12) 모니터링 할 수 있습니다. 이러한 나노 입자 (13)이나 신규 한 조영제 면역 세포에 라벨 (14) 등의 각종 분자 조영제로 사용될 수있다. 우리의 방법은 유동 세포 계측법 기반 접근법이며, 몇 가지 장점을 갖는다.우선, 전체 종양 미세 환경이 샘플링 될 수있다; 분석시에, 전체 주변 피하 종양 주변부 절제 수술로 처리된다. 이는 단일 종양 내의 잠재적 샘플링 바이어스를 제거하고, 전체적으로 더 많은 종양 "글로벌"분석을 제공한다. 둘째, 백혈구 서브 세트를 분석하는 다색 유동 세포 계측법을 사용하여보다 구체적으로 침윤하는 백혈구의 표현형을 측정 할 수있게 해준다. 사용 된 색의 개수에 따라, 매우 특정한 서브 세트가 식별 될 수있다. 심지어 일반적인 서브 타입 분류 - - 종양의 운명을 결정하는데 잠재적으로 중요한 의미를 다른 기능을 갖는 여러 특정 백혈구 세포 유형 내에서 서브 세트가 있기 때문에 중요하다. 예를 들어, 형질 수지상 세포 (PDC)은 항 종양 면역 (15)에 연루되어있다. 그러나, PDCS의 CCR9 + 서브 세트 tolerogenic 16로 도시 한 BA를 이동 한이러한 서브 세트의 랜스는 종양 성장에 영향을 미칠 수있다.

우리의 방법은 피하 또는 일괄하여 절제 할 수있는 다른 종양에 적절하고 있습니다. 우리의 손에, 종양 균일 안락사시 절제 하였다. 일부 연구에서 수행 된 바와 그러나 피하 종양이 완전히 따라서 동물의 추가 평가를 허용 생존 수술 (17)에서 주변의 피부 절제하여 고정 될 수 있음을, 생각할 수있다. 분석 후, 절제된 종양에 대해 수행된다. 따라서, 상기 결과는 종양의 발달에 단일 평가시기를 나타낸다. 이 미세 환경에 대한 자세한 모습을 수 있지만, 그것은 또한 의심의 여지 역동적 인 과정이 무엇인지의 정적 사진입니다. 그러나, 절연 백혈구 (예를 통해 자기 분리 또는 밀도 구배) previ 한 이래로 후, 종양 상피 및 간질 별도로 분석, 또는 상기 표현형을 정의하는 다른 기능 분석에 사용될 수있다ously 18을 설명했다. 이 방법은, 그 후, 자연 투병 기간의 설정에서, 또는 특정한 치료 학적 섭동 후인지, 소정의 시점에서 종양 미세 환경 내의 백혈구의 조성을 이해에 관심이있는 연구자에 유용 할 것이다. 우리가 수행되어 있지 않지만,이 절차의 변형, 잠재적으로 격리에서 종양의 특정 부분을 분석하는데 사용될 수있다. 예를 들면, 종양의 크기가 주어진 주변부 구역 (들)은 연구자에게 종양 미세 환경의 공간적 분리 더 파악할 수 있도록 거리의 중앙 종양, 괴사 가능성 코어 해부 될 수있다.

종양 면역학의 급성장 필드에 의심의 여지가 생쥐 종양 모델에서 새로운 면역 조절제를 평가하는 연구의 기하 급수적으로 증가 수 없을 것이다. 몇몇 보고서 주연 EN 대 종양 내의 특정 백혈구 기능의 차이를 강조vironment. 예를 들어, 쉐이퍼 - 버 외는.들은 종양 미세 환경 (19)에 트래픽이 일단 항원 - 특이 T의 효과기 CD8 + 세포는, 주변부에서 활성 상태, CD8 + T 억제 세포로 형질 전환 된 마우스 모델에서 나타났다. 이 TGFβ에 의한 부분이었다, 그러나 다른 요인은 가능성뿐만 아니라 참여하고 있습니다. 따라서, 백혈구 아형 평가 - 숫자 및 비율뿐만 아니라 기능적 상태 - 종양 자체 내 것은 종양 운명에 특정 면역의 효과에 대한보다 정확한 표현을 제공한다.

우리의 방법은 종양의 상세한 분석이 가능하고 연구원 더욱 가깝게 접근 이전보다 백혈구 개체수의 변화를 식별 할 수있는 기회를 제공한다.

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Protocol

참고 : 모든 동물 실험은 승인 스탠포드, 팔로 알토 VA HCS, 보건 기관 AnimalCare 및 사용위원회 지침 국립 연구소에 따라 실시 하였다.

1. 샘플 수집 및 처리를위한 준비 (소요 시간 : ~ 10 ~ 15 분)

  1. 이전 6 설명한 바와 같이 쥐 B16F0 흑색 종 세포 피하이나 여성 C57BL / 6 마우스의 복부의 중앙선 근처 (0.5 × 10 6) 접종. 대안 적으로, (예를 들면 측면, 유방 지방 패드 등)을 추가로 해부 부위에서 종양 세포를 접종.
    주 : 종양의 임의의 수 (주입 또는 자발적인)이 프로토콜을 사용하여 평가할 수있다. 예를 들어, 다른 일반적 / 6 결장 선 MC38, 루이스 폐 암종 (LLC) 및 전립선 TRAMP-C2 선을 포함 C57BL 동계에서 종양을 사용 하였다. 면역 결핍 생쥐에 접종 인간 이종 이식편도 이러한 방식으로 평가 될 수 있지만, P는 것을 주목해야한다종양 침윤 백혈구 rofiles 반드시 호스트 마우스의 면역 결핍 상태에 따라서 변경 될 것이다.
    1. 전체 미디어 (예 : RPMI 10 % FBS 및 첨가제를 포함) 또는 다른 적절한 단백질 함유 버퍼 (예를 들어 HBSS 또는 PBS + 1 % FBS, 1 %의 BCS)를 사용합니다. 미디어를 진정 또는 이전 euthanization 4 ° C에 버퍼.
  2. 절제된 종양 수집 튜브 및 필터 설정; 얼음이 배치합니다.
    1. 종양 당 하나의 50 ML 원뿔 튜브를 사용하는 절제합니다. 각각의 40 ~ 70 μm의 세포 현탁액 필터를 삽입합니다. 또한, 금속 필터 메쉬 15 ML 원뿔 튜브를 사용합니다. 15ml의 튜브의 상단에 컵 형상의 필터를 생성하는 5 ㎖ 주사기 플런저 또는 두꺼운 펜을 사용한다.
  3. 절제 및 종양 처리를 위해 악기를 준비; 수술 집게와 절제하는 미세 가위 및 프로세스 종양을 사용합니다. 절제 / 종양 샘플 사이의 악기를 청소하는 70 % 에탄올을 사용합니다. 더 많은 수의 오의 경우샘플 F (예> 10), 우리는 종양 샘플 사이의 처리 시간에서 상당한 차이를 방지하기 위해 여러 연구자들에 의해 표본의 동시 처리를 권장합니다.

2. 종양 절제술 (소요 시간 : ~ 5 분 / 종양)

  1. 개별적 이산화탄소 또는 기타 승인 된 방법을 사용하여 B16의 담암 마우스를 안락사.
  2. 수술 단계에 마우스를 고정합니다. 70 % 에탄올로 종양 영역 스프레이 과잉 와이프 ​​오프; 이는 머리 존재의 확산을 방지하는 데 도움이됩니다. 필요에 따라 비 - 누드 마우스의 경우, 종래에 종양 절제 주위 피부 영역을 면도.
  3. 집게와 가위를 사용하여 상부를 포함하고 주변 피부, 일괄하여 피하 종양 절제. 촬영 "여유"피부의 양은 변화하지만, 전형적으로 피부 종양 약 2-3 mm로 절제 될 수있다.
    1. 이 시점에서 절제된 종양 (+/- 주변 피부) 무게. (PL) 내에 고정 필터에 절제 피부 / 종양 섹션을 배치ASTIC 원뿔 튜브.

3. 단일 세포 종양 서스펜션을 준비 (소요 시간 : ~ 5-7 분 / 종양)

  1. 사용 집게와 가위 종양 위에 놓여 / 주변 피부를 말하다. 조직의 모든 큰 부분 1 ~ 2 밀리미터 섹션으로 처리 될 때까지 가위를 사용하여 샘​​플을 말하다.
    참고 : 일반적으로, 전체 종양이 처리; 대안으로, 더 큰 종양, 종양의 대표 섹션 다진 및 처리 할 수​​있다.
  2. 일회용 5 또는 10 ㎖ 주사기의 플런저를 사용하여, 기계적으로 보호 된 필터에 대해 다진 종양 조직을 해리하는.
  3. 피펫을 사용하여, 감기 미디어 또는 버퍼의 5 ~ 10 MLS으로 처리 된 종양 조직을 씻는다. 이 필터를 통해 단일 ​​세포를 세척한다.
  4. 총 수 및 세척의 볼륨이 대략 비슷한 크기의 종양에 대해 동일 보장, 위의 두 단계를 여러 번 반복합니다.
    1. 처리 된 종양 조직을 세척 한 후, 관찰피부 및 / 또는 기타 결합 조직의 작은 조각은 필터에 남아있을 것이다.
    2. 대안 적으로, 콜라게나 제 및 / 또는 다른 효소 단독 기계적 세분화가 충분하지 않을 종양, 소화 종래 닦지 절차로 수행 될 수있다. 이것은 더욱 철저한 단일 세포 현탁액을 허용합니다. 그러나 소화 프로토콜 표면 항원 식 (20)에 영향을 미칠 수 있으므로주의가 이러한 결과를 해석 수행되어야한다는 것을 알 수있다.
  5. 씻고 버퍼 / 미디어를 추가하고 5 분 동안 4 ° C 500 XG에서 원심 분리하여 세포 펠렛.

단일 세포 현탁액의 4 FACS 염색 (소요 시간 : ~ 30 ~ 60 분)

  1. 차가운 얼음 FACS 버퍼에 재현 탁 세포 (PBS + 1 % FBS).
  2. 트리 판 블루와 hemacytometer, 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다.
  3. 볼륨 당 총 생균 수율을 결정합니다. 이 데이터를 외삽하는데 사용될 수있다FACS 데이타와 함께 종양 침윤 백혈구의 절대적 숫자.
  4. 결정 세포 수와 염색은 FACS로 분석한다. 이것은 여러 가지 요인 (예 : 종양 조직 학적 유형, 연령, 종양 크기, 백혈구 침윤의 평균 백분율 등)에 의해 영향을받을 것이다.
    주 : B16 흑색 종에서는 종양 침윤 백혈구 백분율 낮은 실측치 (TIL을 전형적으로 <5 %) 종양 세포에 비해. 따라서, 적어도 1 × 106 총 종양 (종양 침윤 백혈구 +) 세포는 일반적으로 분석을 위해 FACS를 통해 수집 하였다.
    1. 트리 판 - 얼룩진 계수 데이터를 이용하여, 계산 된 셀의 체적에 대한 FACS 염색한다. TIL은 일반적으로 전체 종양 세포의 5 %를 구성하는 경우, 예를 들어 (종양 세포의 많은 트리 판 얼룩 죽은 것), 단일 종양 세포 현탁액의 총 개수의 요인이 염색한다.
    2. 흔하지 백혈구 아형의 경우) + CCR9 예 : PDC (총 종양 세포를 더 많이 사용예 2-3에서는 단일 세포 현탁액 중의 이들 세포의 상대적인 저주파 주어진 FACS 염색 용) 10 X 6.
  5. FACS 용 단일 종양 세포 현탁액 얼룩.
    1. 라이브 / 죽은 차별를 들어, 고칠 얼룩 또는 비 고칠 얼룩 (예 : 프로피 디움 아이오다 이드) 사용할 수를 사용합니다. 셀 라이브 / 죽은 차별없이 염색하는 경우,주의 항체의 비 특이 적 결합의 가능성을 부여 통보해야합니다.
    2. 표준 FACS 염색 프로토콜을 사용하여 특정 서브 세트에 대한 백혈구 세포 현탁액 얼룩. 블록 세포는 PBS / 1 % FBS 쥐 혈청의 Fc 블록 항원 - 특이 적 항체로 염색하기 전에 10 분 동안 (항 CD16 / 32)를 함유하여 비특이적 결합 된 항체를 감소시킨다. 염색 특정 확인하기 위해 올바른 이소 제어 항체를 포함합니다.
    3. FACS 염색이 완료된 후이 시점에서, 4 % 포름 알데히드 또는 다른 유사한 고정 제와 함께 샘플을 고정한다. 다 4 ° C에서 보관 샘플RK 수집 및 분석의 시간이 될 때까지 (형광의 담금질을 피하기 위해).
      주 : 오랜 시간 동안 고정 된 샘플을 저장하는 것은 형광 물질 (21)의 신호 강도의 변화가 발생할 수 있습니다.
    4. 유량 계측기의 샘플을 수집합니다. 설정 사이토 최적의 흐름은 장비 및 레이저 / 검출기 설치 유형에 따라 달라질 수 있습니다.
      참고 : 또한, 심지어 같은 기계를 사용하는 경우 실험 사이에 변화가있을 수 있습니다. 따라서, FACS 수집 및 각 실험의 분석에 앞서 적절한 보정 설정을 보장하기 위해 (예 : 교정 구슬을 사용하여) 해당 기계 설치를 수행합니다.
  6. leukoctye 부분 집합의 분석
    1. , FACS 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. 라이브 / 죽은 얼룩의 경우, 죽은 세포를 게이팅에 의해 시작합니다. 살아있는 세포 내에서 백혈구를 식별하기 위해 백혈구 특정 마커 (예를 들면 항 CD45)에 대한 항체를 사용합니다.
      1. 이 후, 다양한 GATI를 사용NG 방식은 염색 프로토콜에 따라, 특정 서브 세트를 식별한다. 예를 들어, CD4 + T 세포를 식별 CD45 + 집단에서 SSC LO 영역을 선택하고 CD19-CD3 + 세포를 선택하는 단계; 이 CD4 + T 세포로부터 (22)를 식별 할 수있다.
    2. (즉, 서브 세트를 정량화 총 숫자, 백분율 또는 비율을 사용하는) 데이터를 분석하고 일관성을 보장 및 패턴 또는 트랜드를 식별하기 위해 다수의 다른 방법을 제시한다.
      참고 : 예를 들어, 우리는 수집 된 총 종양 세포 (도 1)의 비율로 총 살아있는 CD45 + 세포 보았다. 또한, 우리는 백혈구 종양 내의 각 서브 세트 (예를 들어, CD4 + T 세포)의 백분율을 계산하고, 제어 및 시험 그룹 (도 3) 사이의 비율을 비교하여 이들.

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Representative Results

우리의 결과는 과발현 쥐 B16 종양에 chemerin의 강제 종양 침투 백혈구 (TILS)의 비율을 증가 것으로 나타났다. 또한 chemerin 발현과 연관된 종양 미세 환경 내에서 표시되는 백혈구 아형의 상대적인 비율의 변화가 확인되었다. Pachynski 등. (6) 허가를 다시 인쇄 할 수 있습니다.

도 1은 17 일 절제된 종양의 FACS 분석에 의해 결정되는 바와 같이, 대조군과 비교 chemerin 발현 종양 내의 총 CD45 + 세포 (TILS)에서 현저한 증가가 있었다는 것을 보여준다. 스테인드 사용, B16 종양, 종양 면역에 의해 CD45 + 세포를 침투의 증가를 확인 하였다 (그림 2) 저온 절단.

FACS 데이터의 추가 분석 여기서 cheme 종양에서 NK 세포, T 세포의 평균에 대해 증가, 도시하고, 종래의 DC (린 B220-하는 CD11c +)제어 종양 (그림 3)에 비해 발현을 통해 린이었다. 억제하는 역할을하거나 면역 반응, 특히 골수 유래 억제 세포 (린-는 CD11b + GR1 +)와 PDC (선형 적 B220 +의 CD11c의 INT의 PDCA1의 +) 16,23을 억제 할 수있다 백혈구 부분 집합의 비율의 상대적 감소가 있었다 .

연구의 증가는 종양 성장의 관점과 임상 결과 4,24,25 모두에서 중요한 인자로 종양 미세 환경 내에서 백혈구 아형의 비율을 보여 주었다. 우리 FACS 데이터는 상기 T 세포 (CD3 + 총) 및 종양 세포 당 NK 세포의 수를 나타 내기 위해 분석 하였다; 이들 세포 유형은 점점 제어 (도 4)에 비해 chemerin 발현 종양으로 표현 하였다.

이펙터 (즉 NK와 T 세포) 및 억제 세포의 직접 비교 (예 MDSC 및 PDC) 종양 microenviron 내 인구 모두 종양 그룹에 대한 MENT했다 후 수행 하였다. 그림 5는 대조군과 비교 chemerin 발현 종양 내에서 억제 세포 인구에 이펙터의 비율이 크게 증가를 보여줍니다.

전반적으로, 대표적인 결과는 백혈구 하위 집단에 종양 미세 환경 내에서 식을 chemerin의 효과, 본 임상 적 이익에 부합하는 방식으로 이러한 인구 및 비율의 유리한 기울임은 보여줍니다.

그림 1
. 그림 1 : 하루 17 제어 대 chemerin 발현에서 절제 chemerin 발현 종양에서 증가 된 종양 침투 백혈구 종양은 유동 세포 계측법에 의해 CD45 + 백혈구 침윤 (가능한 세포의 %)에 대해 분석 하였다; * P <그룹 당 4 개 이상의 마우스와의 ± SEM을 의미 보여주는 두 개의 꼬리 학생의 t-test를 0.05.

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. 그림 2 : B16 흑색 종 TIL의 이미징 면역 형광 이미지 컨트롤에 CD45 + 세포 침윤 (흰색 화살표)을 설명하고 chemerin 발현 9 일에 절제 흑색 종을; 바는 25 μm의를 나타냅니다.

그림 3
. 그림 3 : chemerin 발현 종양에서 백혈구 부분 집합의 변경된 표현 FACS는 데이터를 분석 PDC를위한 제어 종양 대 표현 chemerin-에 TIL 부분 집합 주파수의 로그 2 비율로 전환되었다 (형질 DC, 선형 적하는 CD11c의 INT의 B220 + PDCA1 +), CDC (기존의 DC; 린의 CD11c 안녕 B220-), CD4 (CD3 + CD4 +) T 세포, CD8 (CD3 + CD8 +) T 세포, 총 T 세포 (CD3 + CD4 + 및 CD3 + CD8 +), NK 세포 (CD3-NK1. 1+), CD11b를 (린-는 CD11b +) 단핵구 / 대 식세포, MDSC (골수 유래 억제 세포, 린-는 CD11b + GR1 +) 및 CD19 + B 세포 (CD3-CD19 +).

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그림 4 :. 한 바와 같이 B16 종양 억제 백혈구에 이펙터의 비율이 변경된 날 17 B16 흑색 종 종양은 FACS로 분석 하였다. 개별 백혈구 집합 게이팅에 의해 확인되었다. NK 또는 각각의 종양 타입 MDSC 또는 PDC로 총 T 세포의 비율을 산출 하였다.

그림 5
.도 5 : B16 chemerin 발현 종양 또는 제어 chemerin 발현 종양에서 증가 된 이펙터 세포를 FACS로 분석 하였다. 총 10,000 종양 세포 당 T 및 NK 세포의 절대 수는 FACS를 이용하여 데이터를 계산 하였다. 결과는 대표적인 실험에서 있습니다.

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Discussion

종양 미세 환경의 상세한 분석을 수행하는 메커니즘과 면역의 효과를 결정하는데 중요하다. 종양 침투 백혈구에 이러한 에이전트의 영향을 이해하는 인간의 임상 영역에서 immunotherapeutics의 증가 존재와 그들의 작용 메커니즘을 정의하는 필수가되고있다. 인간에서 종종 이와 주연 면역 반응의 분석을 획득하고 백혈구 서브셋 분석 종양 조직을 분석 및 임상 및 / 또는 로지스틱 어려움이 존재는 종종 수행된다. 연구자가 동물 모델에서 임상 연구를 허용 수행하면 더욱 완벽하게하여 임상 결과에 영향을 미칠 수있는 메커니즘에 추가 통찰력을 제공, 종양 자체 내에서 면역 시스템의 면역 조절제의 영향을 탐구한다.

우리의 기술은 종양 침투 백혈구의 상세한 분석을 할 수 있습니다. 전체 종양 미세 환경이 할 수 있기 때문에샘플링, 종양 내 면역 존재 이상의 글로벌 뷰는 평가 될 수있다. 그리고, 최종적으로, 친 종양 억제 세포 및 항 종양 이펙터 세포의 균형이 종양 성장 및 임상 결과 (4)에 중대한 영향을 미칠 수있다. 따라서, 이러한 유형의 분석은 존재하는 특정 백혈구 하위 집합에 대한 자세한 정보 연구원 제공하는 가치가있다. 상세한 데이터는 상기 종양 내의 면역 메카니즘 해명 다른 기능 데이터와 함께 사용될 수있다.

프로토콜의 상대적인 단순성 한 그룹 내 가변성을 최소화하기 위해 더 큰 종양의 코호트를 평가할 수있다. 영상의 전형적인 유포 방식과 비교 (중 IHC 또는 면역 형광 염색), 우리의 기술은 멀티 컬러가 유동 세포 계측법 이용하여 매우 구체적인 백혈구 부분 집합의 식별을 할 수 있습니다. 샘플링하는 기능 중 하나 (외주 포함)의 전체 또는 종양 부종양은 샘플링과 분석의 관점에서 연구원 추가적인 유연성을 제공합니다. 따라서 이것은 또한 종양 미세 환경의보다 정확한 그림을주는 촬상하여 여러 조직 절편의 분석에 의하여 획득 될 수있는 것보다 훨씬 더 많은 백혈구 관련 데이터의 편집을 허용한다.

우리가 널리 종양 접종 측정 비교적 용이 주어진 마우스 모델에서 사용되는 피하 종양에이 기술을 이용했다. 따라서,이 프로토콜은 사용 종양 모델의 가능성이 대부분 적용될 수있다. 그러나, 기술은 또한 종양 절제 추가 단계이기는하지만, 소성 또는 자발적 종양 모델로부터 절제된 종양에 적용 할 수있다. B16 흑색 종의 단일 세포 현탁액을 수득 소화 효소를 필요로하지 않는 동안, 본 공정은 균일 수득 필요한 다양한 유형의 종양, 대표적인 단일 세포 현탁액이있을 수있다. 장점은 종양 섹션에 ì의 영상도 있습니다기능은 우리의 기술로 평가 될 수없는 제공한다. 예를 들어, 종양 미세 환경 내의 백혈구 지역화보다 구체적인 데이터 IHC / IF를 통해 얻어 질 수 있고, 이것은 종종 FACS 분석에 의해 제공되는 데이터에 유용한 부가 물이 될 수있다.

결론적으로, 종양 미세 환경 내의 백혈구의 서브 세트에 대한 우리의 평가 방법은 연구자가 비교적 간단한 프로토콜을 사용하여 면역 종양 내에 존재의 상세한 분석을 수행 할 수있다. 이 마우스 종양 모델의 대다수에 적용될 수 있고, 종양 내에 존재하는 백혈구 종류, 수 및 비율에 대한 중요한 정보를 명료하게 도울 수있다.

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Acknowledgments

이 작품은 보조금 R01-CA169354에 의해 지원되었다   및 R01-047822   국립 보건원 (National Institutes of Health)과 보훈 (ECB)에서 우수상에서. RKP는 NIH T32 CA009287-30A1, ASCO 젊은 연구자 상, 캘리포니아 유방암 연구 프로젝트 원정대, 그리고 미국 암 협회 (American Cancer Society) 가르 연구 학술 그랜트에 의해 지원되었다; BAZ는 NIH 보조금 AI079320에 의해 지원되었다. JM은 NIH T-32 훈련 보조금 T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 및 미국 암 학회 (American Cancer Society) 박사후 PF-12-052-01-CSM에서 연구비에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Cellgro 10-040 http://cellgro.com; keep on ice
FBS Cellgro 35-011-CV http://cellgro.com
50 ml conical tubes Falcon 14-432-22 fischersci.com
40 μm filter Falcon 08-771-1 fischersci.com
5 ml syringe BD 14-823-35 fischersci.com
surgical scissors/forceps Roboz RS-5910 roboz.com
PBS Cellgro MT-21-030-CM http://cellgro.com; keep on ice
trypan blue Cellgro MT-25-900-CI fischersci.com
hemacytometer Hausser Scientifice  02-671-54  fischersci.com
Live/Dead stain Life Technologies L34957 lieftechnologies.com
FlowJo software TreeStar, Inc flowjo.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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피하 종양 모델에서 종양 침투 백혈구 하위 집합의 평가
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Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. J. Vis. Exp. (98), e52657, doi:10.3791/52657 (2015).More

Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. J. Vis. Exp. (98), e52657, doi:10.3791/52657 (2015).

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