Summary

ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים

Published: March 16, 2015
doi:

Summary

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Abstract

Electroretinogram (ERG) הוא שיטה לא פולשנית אלקטרו לקביעת תפקוד רשתית. באמצעות המיקום של האלקטרודה על פני השטח של הקרנית, פעילות חשמלית שנוצרה בתגובה לאור ניתן למדוד ומשמש להערכת הפעילות של תאים ברשתית in vivo. כתב יד זה מתאר את השימוש של ERG למדוד תפקוד ראייה של דג הזברה. דג הזברה ארוכה כבר נוצל כמודל לפיתוח חוליות בשל הקלות של דיכוי גן על ידי oligonucleotides morpholino ומניפולציה תרופתית. ב5-10 DPF, רק קונוסים הם פונקציונליים ברשתית הזחל. לכן, דג הזברה, בניגוד לבעלי חיים אחרים, היא מערכת מודל עוצמה לחקר תפקוד הראייה קונוס in vivo. פרוטוקול זה משתמש הרדמה סטנדרטית, מיקרומניפולציה ופרוטוקולי stereomicroscopy כי הם נפוצים במעבדות המבצעות מחקר דג הזברה. שיטות שתוארו לעשות שימוש בEQ אלקטרופיזיולוגיה הסטנדרטיuipment ומצלמה אור נמוך כדי להנחות את המיקום של microelectrode ההקלטה על גבי קרנית הזחל. לבסוף, אנו מדגימים כיצד ממריץ / מקליט ERG זמין מסחרי שנועד במקור לשימוש עם עכברים יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם דג הזברה. ERG של דג הזברה זחל מספק שיטה מצוינת שלו מנסה לאמוד פונקציה חזותית חרוט בבעלי חיים ששונו על ידי הזרקת oligonucleotide morpholino כמו גם בשיטות של הנדסה גנטית חדשות יותר כגון אצבע nucleases (ZFNs) האבץ, תמלול Activator-כמו מפעיל nucleases (TALENs), ו חזרות התקבצו באופן קבוע Interspaced הקצר Palindromic (CRISPR) / Cas9, אשר כולם בצורה ניכרת את היעילות והיעילות של גן המיקוד בדג זברה. בנוסף, אנו מנצלים את היכולת של סוכנים תרופתיים לחדור זחלי דג הזברה להעריך את המרכיבים המולקולריים התורמים לphotoresponse. פרוטוקול זה מתאר התקנה שיכולה להיות משונית ושימוש על ידי חוקריםעם מטרות ניסוי שונות.

Introduction

Electroretinogram (ERG) הוא שיטה לא פולשנית אלקטרו שכבר נעשה שימוש נרחב במרפאת לקביעת התפקוד של הרשתית בבני אדם. הפעילות החשמלית בתגובה לגירוי אור נמדדת על ידי הנחת אלקטרודות הקלטה על פני השטח החיצוניים של הקרנית. המאפיינים של הפרדיגמה הגירוי וצורת גל התגובה להגדיר את תאי העצב ברשתית תורמים לתגובה. שיטה זו הותאמה לשימוש עם מספר המודלים של בעלי חיים, כולל עכברים ודג זברה. יש תגובת ERG חוליות הטיפוסית ארבעה מרכיבים עיקריים: א-גל, שהוא פוטנציאל קרנית-שלילית הנגזר מפעילות תאי קולטי אור; ב-הגל, פוטנציאל קרנית-חיובית הנגזר מON תאים דו קוטביים; ד-הגל, פוטנציאל קרנית-חיובית להתפרש כפעילות של התאים דו קוטביים OFF; וג-הגל, אשר מתרחש כמה שניות לאחר b-הגל ומשקף פעילות בגליה מולר והמילאפיתל הפיגמנט INAL 1-4. אזכור נוסף להבנת ההיסטוריה והעקרונות של ניתוח ERG בבני אדם ובעלי חיים מודל הוא ספר הלימוד המקוון, Webvision, מאוניברסיטת יוטה וטקסטים כגון עקרונות ותרגול של אלקטרופיזיולוגיה הקלינית של 4 Vision, 5.

rerio Danio (דג הזברה) כבר העדיף ארוך כמודל לפיתוח חוליות, בשל ההבשלה המהירה שלה ושקיפות, אשר מאפשרת ניתוח לא חודרני המורפולוגי של מערכות איברים, מבחני התנהגות והן קדימה לאחור מסכי גנטיים (לסקירה, ראה Fadool ו דאולינג 6). זחלי דג הזברה הם נוחים מאוד למניפולציה גנטית ותרופתית, אשר, כאשר יחד עם הפוריות הגבוהה שלהם, לגרום להם מודל חיה מצוין לניתוחים ביולוגיים תפוקה גבוהה. היחס גבוה יותר של קונוסים למוטות בדג הזברה זחל – בערך 1: 1 בהשוואה לעכברים (~ קונוס 3%ים) – להפוך אותם שימושי במיוחד ללימוד הפונקציה חרוט 7-9.

ברשתית החוליות, קונוסים לפתח לפני מוטות 10. מעניין, קונוסים דג הזברה הם אופרטיביים מוקדם ככל 4 DPF, המאפשרים ניתוח אלקטרו סלקטיבית של קונוסים בשלב זה 6, 11,12. בניגוד לכך, תגובות ERG במוטות מופיעות בין 11 ל 21 DPF 13. לכן, זחלי דג הזברה ב4-7 DPF לשרת תפקודי כרשתית כל-קונוס. עם זאת, תגובת ERG photopic יליד 4-7 זחלי DPF נשלט על ידי b-הגל. יישום של סוכנים תרופתיים, כגון L – (+) – 2-אמינו-4-phosphono-butyric חומצה (L-AP4), אגוניסט לגלוטמט metabotropic קולט (mGluR6) בא לידי ביטוי בON תאים דו קוטביים, חוסם ביעילות את הדור של ב-הגל ומגלה את הפוטנציאל המבודד ההמוני קונוס קולט, ("גל") 14-17.

כאן אנו מתארים פשוטים וreliablשיטת דואר לניתוח ERG באמצעות ציוד ERG זמין מסחרי מיועד לשימוש עם עכברים שהותאמו לשימוש עם זחלי דג הזברה. מערכת זו יכולה להיות מנוצלת על זחלי דג הזברה של משתנה רקע גנטי, כמו גם אלו שטופלו בסוכנים תרופתיים, כדי לסייע לחוקרים בזיהוי של מסלולי איתות שתורמים לרגישות חזותית והסתגלות אור 16. הפרוצדורות מפורטות בפרוטוקול זה תדריך את החוקרים בשימוש בניתוח ERG כדי לענות על מגוון של שאלות ביולוגיות הנוגעות לראייה, ומדגימות את הבנייה של התקנת ERG גמישה.

Protocol

אחזקת בעלי חיים ופרוטוקולי ניסוי אושרו על ידי ועדות הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל, ולעמוד בכל הדרישות של משרד NIH של בעלי חיים במעבדת רווחה והאגודה להערכה והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים בינלאומיים. הערה: פרוטוקולים כדי להשיג זחל…

Representative Results

בדרך כלל, ERGs נרשמים מזחלי דג הזברה בשעה 5 DPF, מאז מספר מחקרים שפורסמו הקלטות ERG בשלב זה 9, 16,20. תגובות הזחל נמדדו בתנאים כהים מותאם ללא תאורת רקע באמצעות גירוי msec 20 אור LED הלבן. אנו מנוצלים מערכת זמינה מסחרי בהיקף של ERG ממריץ Ganzfeld אור ובקר / צורב במחשב. ממריץ משתמש אפנו?…

Discussion

בפרוטוקול זה הליך פשוט להקלטות ERG של דג הזברה זחל מפורט. הליך זה מאפשר לassay מהיר והמקיף של function.There החזותי מספר שלבים קריטיים בכל ההליך שצריך להיות כל הזמן בראש. זחלי דג הזברה צריכים להיות בריאים לפני הניסוי למניעת מוות בטיפולים תרופתיים פוטנציאליים ולהבטיח פרנסה ממוש…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

Materials

Name of the Material/Equipment Company Catalog Number Comments/ Description (optional)
Faraday cage 80/20 Inc custom Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework
PVA sponge Amazon B000ZOWG1C Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae
150 ml Sterile Filter systems Corning 431154 Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
Espion E2 Diagnosys, LLC contact Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com
Colordome Diagnosys, LLC contact Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com
Micromanipulator Drummond 3-000-024-R Holding and positioning the recording microelectrode
Magnetic ring stand Drummond 3-000-025-MB Holding and positioning of the camera and refrence electrode
Lead extensions Grass Technologies F-LX Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor Grass Technologies DF-215/10 Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins
Window screen frame (metal) and spline Lowes or Home Depot various For attaching copper mesh to Faraday cage framework
Steriflip 50 ml filters Millipore SCGP00525 Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
BNC adaptor Monoprice 4127 Connecting camera to BNC cable
BNC cable Monoprice 626 Connecting camera to video adaptor
Camera lens Navitar 1582232 Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Camera coupler Navitar 1501149 Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Luna BNC to VGA + HDMI Converter Sewell SW-29297-PRO BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor
APB Sigma A1910 mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential
Borosilicate glass Sutter BF-150-86-10 Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) 
P97 Flaming/Brown puller Sutter P97 For pulling glass micropipettes
Sorbothane sheet Thorlabs SB12A Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size
Breadboard Thorlabs B2436F Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen
Passive Isolation Mounts Thorlabs PWA074 Provides vibration isolation to breadboard
Copper mesh TWP 022X022C0150W36T To line Faraday Cage
Pipette pump VWR 53502-233 Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae
Pasteur pipettes VWR 14672-608 Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae
Camera Watec WAT-902B Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Tricaine (MS-222) Western Chemical Tricaine-S Pharmaceutical-grade anesthetic,
Micro-fil WPI MF28G-5 Filling microelectrode holder and microelectrode glass
Microelectrode holder WPI MEH2SW15 Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment
Reference Electrode WPI DRIREF-5SH Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode
Reference Electrode (alternative) WPI EP1 Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead
Low-noise cable for Microelectrode holder WPI 13620 Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard

References

  1. Dowling, J. E. . The retina: an approachable part of the brain. , (1987).
  2. Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
  3. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).
  4. Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
  5. Perlman, I., Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
  6. Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).
  7. Doerre, G., Malicki, J. Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina. Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).
  8. Brockerhoff, S. E., et al. Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof. J Neurosci. 23, 470-480 (2003).
  9. Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
  10. Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye. Genes Dev. 21, 367-378 (2007).
  11. Branchek, T. The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function. J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).
  12. Schmitt, E. A., Dowling, J. E. Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses. J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).
  13. Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).
  14. Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio. I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).
  15. Nelson, R. F., Singla, N. A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram. Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).
  16. Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors. J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).
  17. Gurevich, L., Slaughter, M. M. Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram. Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).
  18. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , (2007).
  19. Kim, D. Y., Jung, C. S. Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level. Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).
  20. Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. Zebrafish retinal mutants. Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).
  21. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 536-555 (1966).
  22. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 587-599 (1966).
  23. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).
  24. Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).
  25. Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. CSH protocols. , (2008).
  26. Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).
  27. Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness. J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).
  28. Lewis, A., et al. Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina. PLoS. genetics. 7, e1002239 (2011).

Play Video

Cite This Article
Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52662, doi:10.3791/52662 (2015).

View Video