Summary

Zebra balığı Larva Görsel Tepki Elektroetinogram Analizi

Published: March 16, 2015
doi:

Summary

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Abstract

elektroretinogram (ERG) retina fonksiyonunu belirlemek için bir noninvaziv elektrofizyolojik yöntemdir. Kornea yüzeyi üzerinde bir elektrotun yerleşimi sayesinde, elektrik aktivitesi ölçülür ve in vivo olarak retina hücrelerinin faaliyetini değerlendirmek için kullanılabilen ışığa karşılık olarak oluşturdu. Bu makale zebrabalıkları görme fonksiyonu ölçmek için ERG kullanımını tarif eder. Balığı dolayı uzun morfolino oligonükleotitler ve farmakolojik manipülasyonu ile gen bastırma kolaylığı, omurgalı gelişimi için bir model olarak kullanılmıştır. 5-10 dpf'e, sadece konileri larva retinada işlevsel. Bu nedenle, zebra balığı ve diğer hayvanlarda farklı olarak, in vivo olarak koni görme fonksiyonu çalışma için güçlü bir model sistem. Bu protokol, standart anestezi, Mikromanipülasyondan ve zebra balığı araştırma yapmak laboratuvarlarda yaygın olan stereomikroskobi protokolleri kullanır. özetlenen yöntemler standart elektrofizyoloji eq faydalanmakuipment ve düşük ışık kamera larva kornea üzerine kayıt mikroelektrot yerleşimini rehberlik. Son olarak, ilk olarak farelerde kullanılmak üzere tasarlanmış bir ticari olarak temin edilebilir ERG uyarıcısı / kayıt cihazı kolayca zebrabalıkları ile kullanım için adapte edilebilir gösterilmektedir. Larva zebrabalıkları ERG bir morfolino oligonükleotid enjeksiyon ile tadil edilmiş olan hayvanlarda koni görme fonksiyonunu analiz etmek ve mükemmel bir yöntem olarak, örneğin çinko parmak Nükleaz (ZFNs) gibi daha yeni genom mühendislik teknikleri içerir, transkripsiyon aktivatör-gibi efektör Nükleaz (TALENS) ve Düzenli kümelenmiş interspaced Kısa yineleyen tekrarlar (CRISPR) / büyük ölçüde verimlilik ve zebrafish gen hedefleme etkinliğini artırmıştır hepsi Cas9. Ayrıca, biz photoresponse katkıda moleküler bileşenleri değerlendirmek için Zebra balığı larva nüfuz farmakolojik ajanların yeteneği yararlanmak. Bu protokol modifiye ve araştırmacılar tarafından kullanılabilecek bir kurulum özetliyorÇeşitli deneysel gol ile.

Introduction

elektroretinogram (ERG), insanlarda retina fonksiyonunu belirlemek için klinikte yaygın olarak kullanılan bir invazif olmayan elektrofizyolojik bir yöntemdir. Bir ışık uyarısına tepki olarak elektrik aktivitesi korneanın dış yüzeyi üzerinde kayıt elektrotları yerleştirilmesiyle ölçülür. uyarıcı paradigması ve tepki dalga özellikleri yanıt katkıda retina nöronlar tanımlar. Bu yöntem, fareler ve zebrabalıkları de dahil olmak üzere, hayvan modellerinde bir çok kullanım için adapte edilmiştir. Tipik omurgalı ERG tepki dört ana bileşeni vardır: fotoreseptör hücre aktivitesi türetilmiş bir kornea negatif potansiyel bir-dalga; b-dalgası, bipolar hücrelerden AÇIK türetilmiş bir kornea-pozitif potansiyeli; D-dalgası, KAPALI bipolar hücrelerin aktivitesi olarak yorumlanır bir kornea-pozitif potansiyeli; b-dalga sonra birkaç saniye içinde gerçekleştiğini ve c-dalga, Müller glia ve ret aktivite yansıtırinal pigment epiteli 1-4. İnsanlarda ve hayvanlarda modeli ERG analiz tarihini ve ilkelerini anlamak için Ek başvurular gibi İlkeleri ve Vizyon 4, 5 Klinik Elektrofizyoloji Uygulama olarak Utah ve metinlerin Üniversitesi'nden çevrimiçi ders kitabı, Webvision vardır.

Danio rerio (zebra balığı) uzun nedeniyle organ sistemlerinin, davranışsal testlerin noninvaziv morfolojik analiz ve ileri hem geri ve genetik ekranlar (inceleme için, Fadool ve görmek için izin veren hızlı olgunlaşma ve şeffaflık için, omurgalı gelişimi için bir model olarak tercih edilmiştir Dowling 6). Zebra balığı larvaları, yüksek doğurganlık ile birleştiğinde, onları yüksek verimli biyolojik analizler için mükemmel bir hayvan modeli yapmak genetik ve farmakolojik manipülasyon, son derece müsait. Larva zebrabalıkları çubuklara koni yüksek oranı – yaklaşık 1: 1 farelerinde (~% 3 koni ile karşılaştırıldığındalar) – koni fonksiyonu 7-9 çalışma için özellikle kullanışlı olmasını sağlar.

Gözdeki, koni çubuklar 10 önce gelişir. İlginç bir şekilde, zebra balığı koniler Bu aşamada 6, 11,12 koni seçici elektrofizyolojik analizine izin veren erken 4 dpf olarak işlemektedir. Buna karşılık, çubuklar ERG yanıtları 11 ve 21, 13 dpf'e arasında görünür. Bu nedenle, 4-7 de Zebra balığı larvaları dpf'e bir all-koni retina gibi fonksiyonel hizmet vermektedir. Ancak, 4-7 dpf larvaları yerli Fotopik ERG tepki b-dalgası hakimdir. (+) – – 2-amino-4-fosfono-butirik asit (L-AP4), metabotropik glutamat için bir agonist iki kutuplu hücreler üzerindeki tarafından ifade edilen (mGluR6) reseptörü, etkili bir şekilde bloke nesil L gibi farmakolojik ajanların uygulanması b-dalga ve izole koni reseptör potansiyeli kitle, ("a-dalgası") 14-17 ortaya koymaktadır.

Burada basit ve reliabl tarifzebra balığı larvası ile kullanım için adapte edilmiş fareler ile kullanım için tasarlanmış ticari olarak temin ERG ekipman kullanılarak ERG analizi e yöntemi. Bu sistem, görsel duyarlılık ve adaptasyona 16 katkı sinyal yollarının tanımlanması araştırmacılar yardımcı olmak için, bir genetik arka değişen, hem de farmakolojik maddeler ile tedavi gibi bir zebra balığı larva üzerinde kullanılabilir. Bu protokolde belirtilen deneysel prosedürler vizyona ilgili biyolojik soruları çeşitli cevap ERG analiz kullanımı araştırmacıları rehberlik ve esnek bir ERG kurulum inşaatı gösterecektir.

Protocol

Hayvan bakım ve deneysel protokolleri Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Laboratuar Hayvan Refahı NIH Ofisi ve Değerlendirme ve Laboratuar Hayvan Bakımı International Akreditasyon Derneği tüm gereksinimlerini karşılamak bulundu. NOT: Standart Zebra balığı yetiştiriciliği ve bakım için ERG analizi için larvaları elde etmek için, yayınlanmış protokoller 18 kullanılmıştır. Larva doğal yetiştirme yoluyla elde e…

Representative Results

Tipik olarak, ERGler bir dizi çalışma bu aşamada 9, 16,20 ile ERG kayıtları yayınlandı beri, 5 dpf'e Zebra balığı larvaları kaydedilir. Larva tepkiler beyaz LED ışık 20 msn uyaran kullanarak arka plan aydınlatma ile karanlık adapte koşullar altında ölçüldü. Biz bir Ganzfeld ışık uyarıcısı ve bilgisayar denetleyici / kaydedici oluşan piyasada mevcut ERG sistemi kullanılmaktadır. stimülatör arka plan ve flaş uyaran hem de parlaklığı kontrol etmek için sıkı bir şekil…

Discussion

Bu protokol larva zebrafish ERG kayıtları için basit bir prosedür ayrıntılı. Akılda tutulmalıdır prosedür boyunca birçok kritik adımlar Bu prosedür görsel function.There hızlı ve kapsamlı bir tahlil için izin verir vardır. Deney potansiyel ilaç tedavileri sırasında ölümleri önlemek ve ERG kayıtları sırasında uzun süreli geçimini sağlamak için önce Zebra balığı larvaları sağlıklı olmalıdır. Buna ek olarak, bu deneylerde kullanılan larva yakın yaş uyumlu olması önemlidir. B…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

Materials

Name of the Material/Equipment Company Catalog Number Comments/ Description (optional)
Faraday cage 80/20 Inc custom Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework
PVA sponge Amazon B000ZOWG1C Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae
150 ml Sterile Filter systems Corning 431154 Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
Espion E2 Diagnosys, LLC contact Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com
Colordome Diagnosys, LLC contact Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com
Micromanipulator Drummond 3-000-024-R Holding and positioning the recording microelectrode
Magnetic ring stand Drummond 3-000-025-MB Holding and positioning of the camera and refrence electrode
Lead extensions Grass Technologies F-LX Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor Grass Technologies DF-215/10 Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins
Window screen frame (metal) and spline Lowes or Home Depot various For attaching copper mesh to Faraday cage framework
Steriflip 50 ml filters Millipore SCGP00525 Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
BNC adaptor Monoprice 4127 Connecting camera to BNC cable
BNC cable Monoprice 626 Connecting camera to video adaptor
Camera lens Navitar 1582232 Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Camera coupler Navitar 1501149 Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Luna BNC to VGA + HDMI Converter Sewell SW-29297-PRO BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor
APB Sigma A1910 mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential
Borosilicate glass Sutter BF-150-86-10 Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) 
P97 Flaming/Brown puller Sutter P97 For pulling glass micropipettes
Sorbothane sheet Thorlabs SB12A Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size
Breadboard Thorlabs B2436F Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen
Passive Isolation Mounts Thorlabs PWA074 Provides vibration isolation to breadboard
Copper mesh TWP 022X022C0150W36T To line Faraday Cage
Pipette pump VWR 53502-233 Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae
Pasteur pipettes VWR 14672-608 Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae
Camera Watec WAT-902B Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Tricaine (MS-222) Western Chemical Tricaine-S Pharmaceutical-grade anesthetic,
Micro-fil WPI MF28G-5 Filling microelectrode holder and microelectrode glass
Microelectrode holder WPI MEH2SW15 Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment
Reference Electrode WPI DRIREF-5SH Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode
Reference Electrode (alternative) WPI EP1 Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead
Low-noise cable for Microelectrode holder WPI 13620 Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard

References

  1. Dowling, J. E. . The retina: an approachable part of the brain. , (1987).
  2. Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
  3. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).
  4. Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
  5. Perlman, I., Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
  6. Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).
  7. Doerre, G., Malicki, J. Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina. Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).
  8. Brockerhoff, S. E., et al. Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof. J Neurosci. 23, 470-480 (2003).
  9. Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
  10. Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye. Genes Dev. 21, 367-378 (2007).
  11. Branchek, T. The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function. J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).
  12. Schmitt, E. A., Dowling, J. E. Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses. J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).
  13. Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).
  14. Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio. I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).
  15. Nelson, R. F., Singla, N. A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram. Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).
  16. Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors. J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).
  17. Gurevich, L., Slaughter, M. M. Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram. Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).
  18. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , (2007).
  19. Kim, D. Y., Jung, C. S. Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level. Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).
  20. Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. Zebrafish retinal mutants. Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).
  21. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 536-555 (1966).
  22. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 587-599 (1966).
  23. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).
  24. Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).
  25. Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. CSH protocols. , (2008).
  26. Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).
  27. Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness. J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).
  28. Lewis, A., et al. Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina. PLoS. genetics. 7, e1002239 (2011).

Play Video

Cite This Article
Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52662, doi:10.3791/52662 (2015).

View Video