We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.
Elektroretinogrammet (ERG) er en ikke-invasiv elektrofysiologisk metode for å bestemme netthinnefunksjon. Gjennom plassering av en elektrode på overflaten av hornhinnen, som genereres elektrisk aktivitet som svar på lys som kan måles og brukes for å vurdere aktiviteten av retinale celler in vivo. Dette manuskriptet beskriver bruken av ERG å måle synsfunksjon i sebrafisk. Sebrafisk har lenge vært anvendt som en modell for vertebrate utvikling på grunn av den enkle gensuppresjon ved morfolino oligonukleotider og farmakologisk manipulasjon. På 5-10 dpf, bare kjegler er funksjonelle i larvenetthinnen. Derfor, sebrafisk, i motsetning til andre dyr, er en kraftig modellsystem for studier av kjeglen visuell funksjon in vivo. Denne protokollen bruker standard anestesi, micromanipulation og stereomikros protokoller som er vanlig i laboratorier som utfører sebrafisk forskning. De skisserte metoder gjør bruk av standard elektro equipment og en lav lys-kamera for å lede plasseringen av opptaks microelectrode på larve hornhinne. Til slutt viser vi hvordan en kommersielt tilgjengelig ERG stimulator / opptaker opprinnelig utviklet for bruk med mus kan lett tilpasses for bruk med sebrafisk. ERG av larvesebrafisk gir en utmerket metode for å analysere kjegle visuell funksjon i dyr som har blitt modifisert av morfolino- oligonukleotid injeksjon samt nyere genom engineering teknikker som sink Finger nukleaser (ZFNs), transkripsjon Activator-Like Effector nukleaser (Talens), og Gruppert regelmessig interspaced Korte palindromisk Gjentar (CRISPR) / Cas9, som alle har betydelig økt effektivitet og effekt av genet målretting i sebrafisk. I tillegg tar vi nytte av muligheten for farmakologiske midler til å trenge sebrafisk larver å evaluere de molekylære komponenter som bidrar til photoresponse. Denne protokollen skisserer et oppsett som kan endres og brukes av forskeremed ulike eksperimentelle mål.
Elektroretinogrammet (ERG) er en ikke-invasiv elektrofysiologisk metode som har vært brukt i stor utstrekning i klinikken for å bestemme funksjonen av retina hos mennesker. Den elektriske aktivitet som svar på en lett stimulus måles ved å plassere opptakselektroder på den ytre overflaten av hornhinnen. Det karakteristiske ved stimulus paradigmet og responsen bølgeform definerer de retinale nevroner som bidrar til reaksjonen. Denne metode er blitt tilpasset for bruk med en rekke dyremodeller, inkludert mus og sebrafisk. Den typiske vertebrate ERG respons har fire hovedkomponenter: en bølge, som er en hornhinne-negativt potensial avledet fra fotoreseptoren celleaktivitet; b-bølge, en hornhinne-positive potensial avledet fra ON bipolare celler; d-bølge, en hornhinne-positive potensial tolket som aktiviteten av de av bipolare celler; og c-bølge, som forekommer i flere sekunder etter at b-bølgen og viser aktivitet i Müller gliaceller og retInal pigment epitel 1-4. Andre referanser for å forstå historien og prinsipper av ERG analyse hos mennesker og modell dyr er den elektroniske lærebok, Webvision, fra University of Utah og tekster som prinsipper og praksis for klinisk Elektro av Vision 4, 5.
Danio rerio (sebrafisk) har lenge vært foretrukket som en modell for virveldyr utvikling, på grunn av sin raske modning og åpenhet, som gjør det mulig for ikke-invasiv morfologisk analyse av organsystemer, atferdsanalyser og både framover og bakover genetiske skjermer (for oversikt, se Fadool og Dowling 6). Sebrafisk larver er svært mottagelig for genetisk manipulasjon og farmakologisk, som, når kombinert med deres høye fruktbarhet, gjør dem til et utmerket dyremodell for high-throughput biologiske analyser. Jo høyere forholdet mellom kjegler til stenger i larvesebrafisk – omtrent 1: 1 i forhold til mus (~ 3% kjeglee) – gjør dem særlig anvendelige for studium av kjeglen funksjon 7-9.
I virveldyr netthinnen, kjegler utvikle før stenger 10. Interessant, sebrafisk kjegler er operative så tidlig som 4 dpf, noe som åpner for selektiv elektrofysiologisk analyse av kjegler på det stadiet 6, 11,12. I kontrast, ERG responser i stenger vises mellom 11 og 21 dpf 13. Derfor, sebrafisk larver 4-7 dpf tjene funksjonelt som en all-cone netthinnen. Imidlertid er den native photopic ERG respons på 4-7 dpf larver dominert av b-bølge. Anvendelse av farmakologiske midler, så som L – (+) – 2-amino-4-fosfono-smørsyre (L-AP4), en agonist for metabotropic glutamat (mGluR6) reseptoren uttrykkes ved ON bipolare celler, effektivt blokkerer dannelsen av b-bølgen og avslører den isolerte membran masse reseptor potensial, ("a-bølge") 14-17.
Her beskriver vi en enkel og reliable metode for ERG analyse ved hjelp av kommersielt tilgjengelig ERG utstyr utformet for bruk med mus som har blitt tilpasset for bruk med sebrafisk larver. Dette systemet kan utnyttes på sebrafisk larver av varierende genetiske bakgrunn, så vel som de som ble behandlet med legemidler som er, for å hjelpe forskere i identifisering av signalveier som bidrar til visuell følsomhet og lys tilpasning 16. De eksperimentelle prosedyrer som er skissert i denne protokollen vil lede etterforskerne i bruk av ERG analyse for å besvare en rekke biologiske spørsmål knyttet til syn, og demonstrere bygging av en fleksibel ERG oppsett.
I denne protokollen en enkel prosedyre for ERG opptak av larvesebrafisk er detaljert. Denne prosedyren gir en rask og omfattende analyse av visuell function.There er flere kritiske trinn i hele prosedyren som bør holdes i bakhodet. Sebrafisk larver bør være frisk før forsøket å forhindre død under potensielle medikamentelle behandlinger og sikre langvarig levebrød under ERG opptak. I tillegg er det viktig at larvene benyttet i eksperimentene er tett alder-matchet. Dette er på grunn av den raske utviklingen av n…
The authors have nothing to disclose.
We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
Faraday cage | 80/20 Inc | custom | Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework |
PVA sponge | Amazon | B000ZOWG1C | Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae |
150 ml Sterile Filter systems | Corning | 431154 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
Espion E2 | Diagnosys, LLC | contact | Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com |
Colordome | Diagnosys, LLC | contact | Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com |
Micromanipulator | Drummond | 3-000-024-R | Holding and positioning the recording microelectrode |
Magnetic ring stand | Drummond | 3-000-025-MB | Holding and positioning of the camera and refrence electrode |
Lead extensions | Grass Technologies | F-LX | Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes |
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor | Grass Technologies | DF-215/10 | Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins |
Window screen frame (metal) and spline | Lowes or Home Depot | various | For attaching copper mesh to Faraday cage framework |
Steriflip 50 ml filters | Millipore | SCGP00525 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
BNC adaptor | Monoprice | 4127 | Connecting camera to BNC cable |
BNC cable | Monoprice | 626 | Connecting camera to video adaptor |
Camera lens | Navitar | 1582232 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
Camera coupler | Navitar | 1501149 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
Luna BNC to VGA + HDMI Converter | Sewell | SW-29297-PRO | BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor |
APB | Sigma | A1910 | mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential |
Borosilicate glass | Sutter | BF-150-86-10 | Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) |
P97 Flaming/Brown puller | Sutter | P97 | For pulling glass micropipettes |
Sorbothane sheet | Thorlabs | SB12A | Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size |
Breadboard | Thorlabs | B2436F | Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen |
Passive Isolation Mounts | Thorlabs | PWA074 | Provides vibration isolation to breadboard |
Copper mesh | TWP | 022X022C0150W36T | To line Faraday Cage |
Pipette pump | VWR | 53502-233 | Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae |
Pasteur pipettes | VWR | 14672-608 | Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae |
Camera | Watec | WAT-902B | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
Tricaine (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | Pharmaceutical-grade anesthetic, |
Micro-fil | WPI | MF28G-5 | Filling microelectrode holder and microelectrode glass |
Microelectrode holder | WPI | MEH2SW15 | Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment |
Reference Electrode | WPI | DRIREF-5SH | Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode |
Reference Electrode (alternative) | WPI | EP1 | Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead |
Low-noise cable for Microelectrode holder | WPI | 13620 | Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard |