Summary

Elektroretinogrammet Analyse af Visual respons i zebrafisk Larver

Published: March 16, 2015
doi:

Summary

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Abstract

Elektroretinogrammet (ERG) er en noninvasiv elektrofysiologisk metode til bestemmelse af retinal funktion. Gennem anbringelse af en elektrode på overfladen af hornhinden, elektriske aktivitet genereret som reaktion på lys kan måles og anvendes til at vurdere aktiviteten af retinale celler in vivo. Dette håndskrift beskriver anvendelsen af ​​ERG at måle visuel funktion i zebrafisk. Zebrafisk har længe været anvendt som en model for hvirveldyr udvikling på grund af den lette gensuppression med morpholino oligonukleotider og farmakologisk manipulation. 5-10 dpf kun kegler er funktionelle i larvernes retina. Derfor zebrafisk, i modsætning til andre dyr, er en kraftfuld modelsystem til undersøgelse af kegle visuel funktion in vivo. Denne protokol anvender standard anæstesi, mikromanipulering og stereomikroskopi protokoller, der er almindelige i laboratorier, som udfører zebrafisk forskning. De skitserede metoder gør brug af standard elektrofysiologi eqUDSTYR og en lav lys kamera til at styre placeringen af ​​optagelsen mikroelektrode på larvernes hornhinden. Endelig demonstrere vi, hvordan en kommercielt tilgængelig ERG stimulator / recorder oprindeligt designet til brug med mus kan let tilpasses til anvendelse med zebrafisk. ERG af larver zebrafisk giver en fremragende metode til analyse kegle synsfunktionen hos dyr, der er blevet modificeret ved morpholino oligonukleotid injektion samt nyere genom teknikker såsom zink Finger nukleaser (ZFNs), Transskription Activator-Like Effector Nucleaser (Talens), og Clustered Regelmæssigt indbyrdes afstand Short palindromisk gentagelser (CRISPR) / Cas9, som alle i høj grad har øget effektiviteten og effekten af ​​genmålretning i zebrafisk. Desuden, vi drage fordel af evnen af ​​farmakologiske midler til at trænge zebrafisk larver at evaluere de molekylære bestanddele, der bidrager til photoresponse. Denne protokol beskriver en opsætning, der kan ændres og bruges af forskeremed forskellige eksperimentelle mål.

Introduction

Elektroretinogrammet (ERG) er en non-invasiv elektrofysiologisk metode, der har været anvendt i udstrakt grad i klinikken til at bestemme funktionen af ​​nethinden hos mennesker. Den elektriske aktivitet som respons på en lys-stimulering måles ved at placere optagelse elektroder på den ydre overflade af hornhinden. Kendetegnene for stimulus paradigme og svaret bølgeform definerer de retinale neuroner, der bidrager til svaret. Denne fremgangsmåde er blevet tilpasset til anvendelse med en række dyremodeller, herunder mus og zebrafisk. Den typiske hvirveldyr ERG respons har fire hovedkomponenter: a-bølge, som er en hornhinde-negative potentiale afledt fra fotoreceptor celleaktivitet; b-bølge, en hornhinde-positivt potentiale afledt af ON bipolare celler; d-bølge, en hornhinde-positive potentiale tolkes som aktiviteten af ​​OFF bipolære celler; og c-bølge, som forekommer flere sekunder efter b-bølge og afspejler aktivitet i Müller glia og RETginal pigment epitel 1-4. Yderligere referencer for at forstå historien og principperne for ERG analyse hos mennesker og dyremodeller er online lærebog, WebVision, fra University of Utah og tekster såsom principperne og praksis for Klinisk Elektrofysiologi af Vision 4, 5.

Danio rerio (zebrafisk) har længe været begunstiget som en model for hvirveldyr udvikling, på grund af sin hurtige modning og gennemsigtighed, som giver mulighed for noninvasiv morfologisk analyse af organsystemer, adfærdsmæssige analyser og fremadgående og tilbagegående genetiske skærme (til gennemgang, se Fadool og Dowling 6). Zebrafisk larver er meget modtagelige for genetisk og farmakologisk manipulation, som, når kombineret med deres høje frugtbarhed, gør dem en fremragende dyremodel for højt gennemløb biologiske analyser. Jo højere forholdet mellem kegler til stænger i larvernes zebrafisk – ca. 1: 1 i forhold til mus (~ 3% kegles) – gør dem særligt anvendelige til undersøgelse af kegle funktion 7-9.

I hvirveldyr nethinden, kegler udvikle før stængerne 10. Interessant, zebrafisk kegler er operative så tidligt som 4 dpf, der giver mulighed for selektiv elektrofysiologisk analyse af kegler på det tidspunkt 6, 11,12. I modsætning hertil ERG respons i stænger vises mellem 11 og 21 dpf 13. Derfor zebrafisk larver på 4-7 dpf tjene funktionelt som en all-kegle nethinden. Imidlertid er det native fotopiske ERG respons på 4-7 dpf larver domineret af b-bølgen. Anvendelse af farmakologiske midler, såsom L – (+) – 2-amino-4-phosphono-smørsyre (L-AP4) en agonist for metabotrope glutamatreceptorer (mGluR6) receptor ved den udtrykkes på bipolære celler, effektivt blokerer generation af b-bølge og afslører den isolerede kegle masse receptor potentiale ("a-bølge") 14-17.

Her beskriver vi en enkel og reliable fremgangsmåde til ERG analyse under anvendelse af kommercielt tilgængelige ERG udstyr beregnet til brug med mus, der er blevet tilpasset til brug med zebrafisk larver. Dette system kan anvendes på zebrafisk larver af varierende genetiske baggrunde, såvel som dem behandlet med farmakologiske midler, for at hjælpe forskerne i identifikationen af signalveje, der bidrager til visuel følsomhed og let tilpasning 16. De eksperimentelle procedurer i denne protokol vil guide efterforskere i brugen af ​​ERG analyse til at besvare en række biologiske spørgsmål vedrørende visioner, og demonstrere opbygningen af ​​en fleksibel ERG setup.

Protocol

Animal vedligeholdelse og forsøgsprotokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og Brug udvalg University of North Carolina i Chapel Hill, og opfylder alle krav i NIH Office of Laboratory Animal Welfare og Foreningen for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care International. Bemærk: For at få larver for ERG analyse offentliggjort protokoller for standard zebrafisk dyrehold og vedligeholdelse var ansat 18. Larverne opnås gennem naturlig avl og opstaldet under en 14 timers lys / 10 timer mørke cyklu…

Representative Results

Typisk ERG'er optaget fra zebrafisk larver ved 5 dpf, da en række undersøgelser har publiceret ERG optagelser på nuværende tidspunkt 9, 16,20. Larval responser blev målt under mørke-tilpassede betingelser uden baggrundsbelysning ved hjælp af en 20 ms stimulus af hvid LED lys. Vi udnyttede en kommercielt tilgængelig ERG system bestående af en Ganzfeld lys stimulator og computer controller / optager. Stimulatoren bruger en tæt kontrolleret proprietær pulsbreddemodulation (PWM) til at styre lumina…

Discussion

I denne protokol en enkel procedure for ERG optagelser af larver zebrafisk er detaljeret. Denne procedure giver mulighed for en hurtig og omfattende analyse af visuel function.There er flere kritiske trin hele proceduren, der bør holdes for øje. Zebrafisken larver skal være sundt før forsøget for at forhindre dødsfald i løbet af potentielle lægemiddelbehandlinger og sikre langvarig udkomme i løbet af ERG optagelser. Desuden er det vigtigt, at den anvendes i eksperimenter larver er tæt aldersmatchning. Dette sk…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

Materials

Name of the Material/Equipment Company Catalog Number Comments/ Description (optional)
Faraday cage 80/20 Inc custom Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework
PVA sponge Amazon B000ZOWG1C Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae
150 ml Sterile Filter systems Corning 431154 Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
Espion E2 Diagnosys, LLC contact Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com
Colordome Diagnosys, LLC contact Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com
Micromanipulator Drummond 3-000-024-R Holding and positioning the recording microelectrode
Magnetic ring stand Drummond 3-000-025-MB Holding and positioning of the camera and refrence electrode
Lead extensions Grass Technologies F-LX Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor Grass Technologies DF-215/10 Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins
Window screen frame (metal) and spline Lowes or Home Depot various For attaching copper mesh to Faraday cage framework
Steriflip 50 ml filters Millipore SCGP00525 Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
BNC adaptor Monoprice 4127 Connecting camera to BNC cable
BNC cable Monoprice 626 Connecting camera to video adaptor
Camera lens Navitar 1582232 Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Camera coupler Navitar 1501149 Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Luna BNC to VGA + HDMI Converter Sewell SW-29297-PRO BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor
APB Sigma A1910 mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential
Borosilicate glass Sutter BF-150-86-10 Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) 
P97 Flaming/Brown puller Sutter P97 For pulling glass micropipettes
Sorbothane sheet Thorlabs SB12A Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size
Breadboard Thorlabs B2436F Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen
Passive Isolation Mounts Thorlabs PWA074 Provides vibration isolation to breadboard
Copper mesh TWP 022X022C0150W36T To line Faraday Cage
Pipette pump VWR 53502-233 Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae
Pasteur pipettes VWR 14672-608 Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae
Camera Watec WAT-902B Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Tricaine (MS-222) Western Chemical Tricaine-S Pharmaceutical-grade anesthetic,
Micro-fil WPI MF28G-5 Filling microelectrode holder and microelectrode glass
Microelectrode holder WPI MEH2SW15 Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment
Reference Electrode WPI DRIREF-5SH Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode
Reference Electrode (alternative) WPI EP1 Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead
Low-noise cable for Microelectrode holder WPI 13620 Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard

References

  1. Dowling, J. E. . The retina: an approachable part of the brain. , (1987).
  2. Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
  3. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).
  4. Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
  5. Perlman, I., Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
  6. Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).
  7. Doerre, G., Malicki, J. Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina. Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).
  8. Brockerhoff, S. E., et al. Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof. J Neurosci. 23, 470-480 (2003).
  9. Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
  10. Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye. Genes Dev. 21, 367-378 (2007).
  11. Branchek, T. The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function. J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).
  12. Schmitt, E. A., Dowling, J. E. Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses. J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).
  13. Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).
  14. Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio. I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).
  15. Nelson, R. F., Singla, N. A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram. Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).
  16. Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors. J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).
  17. Gurevich, L., Slaughter, M. M. Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram. Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).
  18. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , (2007).
  19. Kim, D. Y., Jung, C. S. Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level. Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).
  20. Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. Zebrafish retinal mutants. Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).
  21. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 536-555 (1966).
  22. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 587-599 (1966).
  23. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).
  24. Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).
  25. Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. CSH protocols. , (2008).
  26. Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).
  27. Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness. J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).
  28. Lewis, A., et al. Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina. PLoS. genetics. 7, e1002239 (2011).

Play Video

Cite This Article
Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52662, doi:10.3791/52662 (2015).

View Video