Summary

Electroretinogram Analyse van de Visual Response in zebravis Larven

Published: March 16, 2015
doi:

Summary

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Abstract

De electroretinogram (ERG) is een niet-invasieve elektrofysiologische methode voor het bepalen van retinale functie. Door het plaatsen van een elektrode op het oppervlak van de cornea, elektrische activiteit gegenereerd in reactie op licht kan worden gemeten en gebruikt om de activiteit van retinale cellen in vivo te evalueren. Dit manuscript beschrijft het gebruik van de ERG om de visuele functie te meten in de zebravis. Zebravis zijn al lange tijd gebruikt als een model voor gewervelde ontwikkeling als gevolg van het gemak van het gen onderdrukking door morfolino- oligonucleotiden en farmacologische manipulatie. 5-10 dpf, alleen kegels zijn functioneel in de larvale retina. Daarom is de zebravis, in tegenstelling tot andere dieren, is een krachtig model voor de studie van kegel visuele functie in vivo. Dit protocol maakt gebruik van standaard anesthesie, micromanipulatie en stereomicroscopie protocollen die gangbaar zijn in de laboratoria die de zebravis onderzoek uit te voeren. De geschetste methoden maken gebruik van standaard elektrofysiologie equipment en een weinig licht camera om de plaatsing van de opname micro-elektrode te begeleiden op de larvale hoornvlies. Tenslotte tonen we hoe een commercieel verkrijgbaar ERG stimulator / recorder oorspronkelijk ontworpen voor gebruik met muizen gemakkelijk worden aangepast voor gebruik bij zebravis. ERG van larvale zebravis biedt een uitstekende methode voor het bepalen van kegel visuele functie bij dieren die zijn gewijzigd door morfolino- oligonucleotide injectie, alsook nieuwere genoom engineering-technieken zoals Zinc Finger Nucleasen (ZFNs), transcriptie Activator-Like Effectorcellen Nucleasen (Talens), en Regelmatig Gegroepeerde afgewisseld met korte Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9, die allemaal sterk verhoogde de efficiëntie en effectiviteit van gen targeting in zebravis. Bovendien benutten we het vermogen van farmacologische middelen aan zebravis larven de moleculaire componenten die bijdragen aan de photoresponse evalueren dringen. Dit protocol beschrijft een opstelling die kan worden gemodificeerd en gebruikt door onderzoekersmet diverse experimentele doelen.

Introduction

De elektroretinogram (ERG) is een niet-invasieve elektrofysiologische werkwijze die uitgebreid is gebruikt in de kliniek voor de bepaling van de functie van de retina bij de mens. De elektrische activiteit in reactie op een stimulus licht wordt gemeten door opname elektroden op het buitenoppervlak van de cornea. De kenmerken van de stimulus paradigma en de respons golfvorm hier de retinale neuronen bijdragen aan de respons. Deze werkwijze is aangepast voor gebruik met een aantal diermodellen zoals muizen en zebravissen. De typische gewervelde ERG response vier hoofdcomponenten: de a-golf, een cornea-negatieve potentiaal afkomstig van fotoreceptorcellen celactiviteit; de b-golf, een hoornvlies-positieve potentiële afgeleid van de ON bipolaire cellen; de d-golf, een cornea-positieve potentiaal geïnterpreteerd als de activiteit van de UIT bipolaire cellen; en de C-golf, die enkele seconden plaatsvindt na de B-golf weerspiegelt activiteit Müller glia en retinal pigment epitheel 1-4. Extra referenties voor het begrijpen van de geschiedenis en beginselen van ERG analyse bij de mens en het model dieren zijn de online leerboek, WebVision, van de Universiteit van Utah en teksten zoals de Principles and Practice of Clinical Electrofysiologie van Vision 4, 5.

Danio rerio (zebravis) is al lang favoriet als een model voor gewervelde ontwikkeling, vanwege de snelle rijping en transparantie, die het mogelijk maakt voor niet-invasieve morfologische analyse van orgaansystemen, gedrags-assays en zowel vooruit als achteruit genetische screens (voor een overzicht, zie Fadool en Dowling 6). Zebravis larven zijn zeer vatbaar voor genetische en farmacologische manipulatie, die, in combinatie met hun hoge vruchtbaarheid, maken ze een uitstekend diermodel voor high-throughput biologische analyses. De hogere verhouding kegels te staven larvale zebravis – ongeveer 1: 1 in vergelijking met muizen (~ 3% cones) – hen bijzonder bruikbaar voor de studie van conus functie 7-9.

In de gewervelde netvlies, kegeltjes ontwikkelen voordat staven 10. Interessant, zebravis kegels zijn werkzaam zo vroeg als 4 dpf, waardoor voor selectieve elektrofysiologische analyse van kegels in die fase 6, 11,12. Daarentegen ERG reacties in staven staan ​​tussen 11 en 21 dpf 13. Daarom zebravis larven op 4-7 dpf dienen functioneel als een all-conus netvlies. Echter, de inheemse photopic ERG reactie van 4-7 DPF larven gedomineerd door de b-golf. Toepassing van farmacologische middelen, zoals L – (+) – 2-amino-4-fosfono-boterzuur (L-AP4), een agonist voor de metabotrope glutamaat (mGluR6) receptor door expressie ON bipolaire cellen blokkeert effectief de generatie van de b-golf en onthult de geïsoleerde kegel massa receptor potential, (de "a-wave") 14-17.

Hier beschrijven we een eenvoudige en reliable werkwijze voor ERG analyse met behulp van commercieel verkrijgbaar ERG materiaal bestemd voor gebruik met muizen die zijn aangepast voor gebruik met zebravis larven. Dit systeem kan worden gebruikt op zebravis larven van verschillende genetische achtergronden, evenals die behandeld met farmacologische middelen, onderzoekers helpen bij de identificatie van signaalroutes die bijdragen aan de visuele gevoeligheid en lichte aanpassing 16. De experimentele procedures die in dit protocol onderzoekers begeleiden bij het gebruik van ERG analyse van verschillende biologische vragen over visie beantwoorden, en tonen de constructie van een flexibele ERG setup.

Protocol

Dierlijke onderhoud en experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comités van de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill, en voldoen aan alle eisen van de NIH Bureau van Laboratory Animal Welfare en de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care International. OPMERKING: Om larven voor ERG analyse te verkrijgen, gepubliceerde protocollen voor standaard zebravis veeteelt en onderhoud in dienst waren 18. Larven worden verkregen door middel van na…

Representative Results

Gewoonlijk ERG worden geregistreerd van zebravis larven 5 dpf, aangezien een aantal studies ERG opnames gepubliceerd in dit stadium 9, 16,20. Larvale reacties werden gemeten onder donker aangepaste voorwaarden zonder achtergrond verlichting met behulp van een 20 msec stimulans van wit LED licht. We gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbaar ERG systeem dat bestaat uit een Ganzfeld licht stimulator en computer controller / recorder. De stimulator gebruikt een strak eigen pulsbreedtemodulatie (PWM) syste…

Discussion

In dit protocol een eenvoudige procedure voor ERG opnames van larvale zebravis is gedetailleerd. Deze procedure zorgt voor een snelle en uitgebreide analyse van de visuele function.There zijn verschillende kritische stappen tijdens de hele procedure die moet in gedachten worden gehouden. De zebravis larven moeten gezond zijn voor het experiment te overlijden tijdens potentiële behandelingen met medicijnen te voorkomen en te zorgen voor langdurige levensonderhoud tijdens de ERG opnames. Bovendien is het belangrijk dat d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

Materials

Name of the Material/Equipment Company Catalog Number Comments/ Description (optional)
Faraday cage 80/20 Inc custom Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework
PVA sponge Amazon B000ZOWG1C Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae
150 ml Sterile Filter systems Corning 431154 Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
Espion E2 Diagnosys, LLC contact Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com
Colordome Diagnosys, LLC contact Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com
Micromanipulator Drummond 3-000-024-R Holding and positioning the recording microelectrode
Magnetic ring stand Drummond 3-000-025-MB Holding and positioning of the camera and refrence electrode
Lead extensions Grass Technologies F-LX Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor Grass Technologies DF-215/10 Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins
Window screen frame (metal) and spline Lowes or Home Depot various For attaching copper mesh to Faraday cage framework
Steriflip 50 ml filters Millipore SCGP00525 Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
BNC adaptor Monoprice 4127 Connecting camera to BNC cable
BNC cable Monoprice 626 Connecting camera to video adaptor
Camera lens Navitar 1582232 Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Camera coupler Navitar 1501149 Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Luna BNC to VGA + HDMI Converter Sewell SW-29297-PRO BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor
APB Sigma A1910 mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential
Borosilicate glass Sutter BF-150-86-10 Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) 
P97 Flaming/Brown puller Sutter P97 For pulling glass micropipettes
Sorbothane sheet Thorlabs SB12A Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size
Breadboard Thorlabs B2436F Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen
Passive Isolation Mounts Thorlabs PWA074 Provides vibration isolation to breadboard
Copper mesh TWP 022X022C0150W36T To line Faraday Cage
Pipette pump VWR 53502-233 Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae
Pasteur pipettes VWR 14672-608 Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae
Camera Watec WAT-902B Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Tricaine (MS-222) Western Chemical Tricaine-S Pharmaceutical-grade anesthetic,
Micro-fil WPI MF28G-5 Filling microelectrode holder and microelectrode glass
Microelectrode holder WPI MEH2SW15 Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment
Reference Electrode WPI DRIREF-5SH Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode
Reference Electrode (alternative) WPI EP1 Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead
Low-noise cable for Microelectrode holder WPI 13620 Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard

References

  1. Dowling, J. E. . The retina: an approachable part of the brain. , (1987).
  2. Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
  3. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).
  4. Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
  5. Perlman, I., Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
  6. Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).
  7. Doerre, G., Malicki, J. Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina. Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).
  8. Brockerhoff, S. E., et al. Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof. J Neurosci. 23, 470-480 (2003).
  9. Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
  10. Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye. Genes Dev. 21, 367-378 (2007).
  11. Branchek, T. The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function. J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).
  12. Schmitt, E. A., Dowling, J. E. Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses. J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).
  13. Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).
  14. Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio. I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).
  15. Nelson, R. F., Singla, N. A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram. Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).
  16. Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors. J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).
  17. Gurevich, L., Slaughter, M. M. Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram. Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).
  18. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , (2007).
  19. Kim, D. Y., Jung, C. S. Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level. Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).
  20. Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. Zebrafish retinal mutants. Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).
  21. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 536-555 (1966).
  22. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 587-599 (1966).
  23. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).
  24. Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).
  25. Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. CSH protocols. , (2008).
  26. Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).
  27. Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness. J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).
  28. Lewis, A., et al. Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina. PLoS. genetics. 7, e1002239 (2011).

Play Video

Cite This Article
Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52662, doi:10.3791/52662 (2015).

View Video