Summary

Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve

Published: March 16, 2015
doi:

Summary

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Abstract

L'elettroretinogramma (ERG) è un metodo non invasivo per determinare elettrofisiologico funzione retinica. Attraverso il posizionamento di un elettrodo sulla superficie della cornea, attività elettrica generata in risposta alla luce può essere misurato e utilizzato per valutare l'attività di cellule retiniche in vivo. Questo manoscritto descrive l'uso della ERG per misurare la funzione visiva in zebrafish. Zebrafish sono stati a lungo utilizzato come modello per lo sviluppo vertebrato a causa della facilità di soppressione genica mediante oligonucleotidi morfolino e manipolazione farmacologica. A 5-10 dpf, solo coni sono funzionali nella retina larvale. Pertanto, il zebrafish, a differenza di altri animali, è un potente sistema modello per lo studio della funzione visiva cono in vivo. Questo protocollo utilizza l'anestesia standard micromanipolazione e protocolli stereomicroscopia che sono comuni nei laboratori che eseguono la ricerca zebrafish. I metodi di cui fanno uso di eq elettrofisiologia normaAZIONE e una telecamera a bassa luce per guidare il posizionamento della microelettrodo di registrazione sulla cornea larvale. Infine, si dimostra come un disponibile in commercio ERG stimolatore / registratore originariamente progettato per l'uso con i topi possono essere facilmente adattato per l'uso con zebrafish. ERG di zebrafish larvale fornisce un metodo eccellente per saggiare cono funzione visiva in animali che sono stati modificati da morpholino iniezione oligonucleotide nonché nuove tecniche di ingegneria del genoma come zinco Finger nucleasi (ZFNs), Trascrizione Activator-Like Effector nucleasi (Talens), e cluster regolarmente intervallate brevi palindromo Ripete (CRISPR) / Cas9, i quali hanno notevolmente aumentato l'efficienza e l'efficacia del gene targeting in zebrafish. Inoltre, abbiamo approfittato della capacità di agenti farmacologici di penetrare larve zebrafish per valutare le componenti molecolari che contribuiscono alla fotorisposta. Questo protocollo delinea una configurazione che può essere modificato e utilizzato dai ricercatoricon diversi obiettivi sperimentali.

Introduction

L'elettroretinogramma (ERG) è un metodo elettrofisiologico invasivo che è stato ampiamente utilizzato in clinica per determinare la funzione della retina nell'uomo. L'attività elettrica in risposta ad uno stimolo luce viene misurata ponendo elettrodi di registrazione sulla superficie esterna della cornea. Le caratteristiche del paradigma stimolo e la forma d'onda di risposta definiscono i neuroni retinici contribuiscono alla risposta. Questo metodo è stato adattato per l'uso con un certo numero di modelli animali tra cui topi e zebrafish. La tipica risposta vertebrati ERG ha quattro componenti principali: l'a-onda, che è un potenziale cornea-negative derivanti dall'attività cellule fotorecettori; la b-wave, un potenziale positivo cornea derivato dal ON cellule bipolari; d-onda, un potenziale positivo cornea interpretato come l'attività delle cellule bipolari OFF; e il c-onda, che si verifica alcuni secondi dopo la b-wave e riflette l'attività in Müller glia e il retinale pigmento epitelio 1-4. Ulteriori riferimenti per la comprensione della storia e dei principi di analisi ERG negli esseri umani e modelli animali sono il libro di testo on line, WebVision, presso la University of Utah e testi, come i Principi e Pratica di Elettrofisiologia clinica di Vision 4, 5.

Danio rerio (zebrafish) è stato a lungo favorita come un modello di sviluppo dei vertebrati, a causa della sua rapida maturazione e trasparenza, che permette l'analisi morfologica non invasiva dei sistemi d'organo, test comportamentali e sia in avanti e retromarcia schermi genetici (per la revisione, vedi Fadool e Dowling 6). Larve Zebrafish sono altamente suscettibili di manipolazione genetica e farmacologica, che, accoppiato con la loro alta fecondità, loro un ottimo modello animale per le analisi biologiche high-throughput fare. Il più alto rapporto di coni di canne in zebrafish larvale – circa 1: 1 rispetto ai topi (~ 3% a conos) – renderli particolarmente utile per lo studio della funzione cono 7-9.

Nella retina dei vertebrati, coni sviluppano prima di aste 10. È interessante notare che, coni zebrafish sono operativi già dal 4 dpf, consentendo selettiva analisi elettrofisiologiche di coni in quella fase 6, 11,12. Al contrario, le risposte ERG a barre compaiono tra 11 e 21 dpf 13. Pertanto, larve di zebrafish 4-7 dpf servire funzionalmente come retina all-cono. Tuttavia, il nativo fotopico risposta ERG di 4-7 dpf larve è dominato dalla b-wave. Applicazione di agenti farmacologici, quali L – (+) – 2-ammino-4-fosfono-butirrico (L-AP4), un agonista per il glutammato metabotropici (mGluR6) recettore espresso dalla ON cellule bipolari, blocca efficacemente la generazione del B-wave e rivela il potenziale isolato massa cono recettore, (la "a-wave") 14-17.

Qui si descrive un semplice e reliablMetodo e per l'analisi ERG utilizzando disponibili in commercio apparecchiature ERG progettato per l'utilizzo con i topi che sono stati concepiti per essere utilizzati con le larve di zebrafish. Questo sistema può essere utilizzato su larve zebrafish di varia background genetici, così come quelli trattati con agenti farmacologici, per aiutare i ricercatori nella identificazione di vie di segnalazione che contribuiscono alla sensibilità visiva e adattamento alla luce 16. Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo guideranno gli investigatori in uso dell'analisi ERG per rispondere a una serie di domande biologiche relative alla visione, e dimostrare la costruzione di una configurazione flessibile, ERG.

Protocol

Mantenimento degli animali e protocolli sperimentali sono stati approvati dalla cura e utilizzo dei Comitati animali istituzionale della University of North Carolina a Chapel Hill, e soddisfano tutte le esigenze dell'Ufficio NIH di laboratorio Animal Welfare e l'Associazione per la valutazione e l'accreditamento del laboratorio Animal Care International. NOTA: Per ottenere le larve di analisi ERG, pubblicato protocolli per la zootecnia zebrafish norma e manutenzione sono stati impiegati 18. Le larve sono ottenu…

Representative Results

Tipicamente, ERG sono registrati da larve di zebrafish a 5 dpf, dal momento che un certo numero di studi hanno pubblicato le registrazioni ERG in questa fase 9, 16,20. Risposte larvali sono stati misurati in condizioni di oscurità adattato senza retroilluminazione utilizzando uno stimolo 20 msec di luce LED bianca. Abbiamo utilizzato un sistema di ERG disponibile in commercio costituito da uno stimolatore luce Ganzfeld e computer di controller / registratore. Lo stimolatore utilizza un sistema di modulazione…

Discussion

In questo protocollo una procedura semplice per ERG registrazioni di zebrafish larvale è dettagliata. Questa procedura consente una analisi rapida e completa di function.There visiva sono diversi passaggi critici della procedura che dovrebbe essere tenuto in considerazione. Le larve zebrafish deve essere in buona salute prima dell'esperimento per evitare la morte durante i potenziali trattamenti farmacologici e garantire il sostentamento prolungata durante le registrazioni ERG. Inoltre, è importante che le larve u…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

Materials

Name of the Material/Equipment Company Catalog Number Comments/ Description (optional)
Faraday cage 80/20 Inc custom Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework
PVA sponge Amazon B000ZOWG1C Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae
150 ml Sterile Filter systems Corning 431154 Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
Espion E2 Diagnosys, LLC contact Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com
Colordome Diagnosys, LLC contact Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com
Micromanipulator Drummond 3-000-024-R Holding and positioning the recording microelectrode
Magnetic ring stand Drummond 3-000-025-MB Holding and positioning of the camera and refrence electrode
Lead extensions Grass Technologies F-LX Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor Grass Technologies DF-215/10 Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins
Window screen frame (metal) and spline Lowes or Home Depot various For attaching copper mesh to Faraday cage framework
Steriflip 50 ml filters Millipore SCGP00525 Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
BNC adaptor Monoprice 4127 Connecting camera to BNC cable
BNC cable Monoprice 626 Connecting camera to video adaptor
Camera lens Navitar 1582232 Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Camera coupler Navitar 1501149 Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Luna BNC to VGA + HDMI Converter Sewell SW-29297-PRO BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor
APB Sigma A1910 mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential
Borosilicate glass Sutter BF-150-86-10 Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) 
P97 Flaming/Brown puller Sutter P97 For pulling glass micropipettes
Sorbothane sheet Thorlabs SB12A Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size
Breadboard Thorlabs B2436F Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen
Passive Isolation Mounts Thorlabs PWA074 Provides vibration isolation to breadboard
Copper mesh TWP 022X022C0150W36T To line Faraday Cage
Pipette pump VWR 53502-233 Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae
Pasteur pipettes VWR 14672-608 Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae
Camera Watec WAT-902B Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Tricaine (MS-222) Western Chemical Tricaine-S Pharmaceutical-grade anesthetic,
Micro-fil WPI MF28G-5 Filling microelectrode holder and microelectrode glass
Microelectrode holder WPI MEH2SW15 Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment
Reference Electrode WPI DRIREF-5SH Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode
Reference Electrode (alternative) WPI EP1 Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead
Low-noise cable for Microelectrode holder WPI 13620 Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard

References

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Cite This Article
Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52662, doi:10.3791/52662 (2015).

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