Protocol
1. Coleta de Água e Filtração
- Coletar amostras de água doce de vários sites (Figura 1). Passe amostras através de uma série de filtros: filtro de 1 um, 0,2 um filtro, e de 30 kDa de corte de filtro de fluxo tangencial para sistematicamente eucariótica separada, partículas de tamanho bacterianas e virais, respectivamente.
Nota: Apenas a purificação e análise do material recuperado nos filtros de 0,2 um (bactérias de vida livre) é descrito neste relatório, mas estratégias semelhantes podem ser usadas para outras partículas recuperadas a partir dos filtros.
2. Concentração bacteriana, ADN Extracção e Purificação
- Remover o filtro de membrana de 0,2 um (s) a partir do sistema de filtração de água (diagrama esquemático, Figura 2). Dobre o filtro de 0,2 um disco ao meio e coloque-o em um tubo de 50 ml com o lado aberto para cima. Adicionar 5 ml de solução tamponada com fosfato (PBS 1x) e 0,01% de Tween, pH 7,4 emo tubo. Se mais do que um filtro é utilizado durante o processo de empregar um tubo diferente por filtro. Tubo (s) de loja com filtro a 4 ° C até serem processadas. Caso contrário, vá para o passo 2.2.
- Remover o filtro de membrana de 0,2 um a partir do tubo de 50 ml com uma pinça estéril. Ponto de filtro (s) em uma placa de Petri (deixar o tampão PBS no tubo).
- Com uma pinça estéril e tesoura estéril, cortou o filtro em pequenas tiras (1 cm x 1 cm). Desinfetar pinça e tesouras por imersão em 70% isopropanol, limpando com uma superfície descontaminante DNA e enxaguar com água ultrapura do tipo 1 entre as diferentes amostras.
- Colocar o filtro de corte em tiras de volta para o mesmo tubo de 50 ml. Adicionar 10 ml de 1x PBS e 0,01% de Tween, pH 7,4 para o filtro, de modo que há um total de 15 mL de tampão no tubo de 50 ml.
- Adicione 6 esferas de tungstênio limpo (3 mm de diâmetro) para cada tubo de 50 ml, cobrir o tubo com Parafilm e vortex vigorosamente durante 20 min (use 50 ml tubos adaptador vortex). Se multiple filtros são processados a partir de uma amostra, e transferência da piscina todo o homogeneizado para um tubo limpo de 50 ml. Centrifugar os tubos a 3300 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Ressuspender o sedimento de células bacterianas e alíquotas (~ 1 ml) em aliquotas de 1,7 ml tubos de microcentrífuga. Note-se que haverá cinco microtubos por amostra.
- Girar os tubos de microcentrífuga a 10000 xg durante 10 min, e remover a maior parte do sobrenadante para baixo de ~ 200 ul marca.
- Armazenar as amostras a -80 ° C, ou prosseguir para extrair ADN bacteriano usando um kit de isolamento de ADN comercialmente disponíveis de acordo com as instruções do fabricante. Durante a utilização de bactérias de extracção de ADN PBS ou água como um controlo negativo de extracção, e E. coli como controlo positivo extracção.
- Como o DNA de vários tubos estão a ser extraídos, piscina sub-alíquotas paralelas a partir de uma mesma amostra em um tubo de 2 ml. Em seguida, conduzir uma precipitação S / N usando uma solução composta por 0,1volumes de acetato de sódio 3M, 2 volumes de etanol a 100%, e 5 uL de 5 ug / ul acrilamida linear. Misturar bem e armazenar amostras a -80 ° C.
- Centrifuga-se a velocidade máxima (17000 xg) durante 30 min a 4 ° C. Lavar pelete com 1 ml de etanol a 70% arrefecido com gelo, ar seco numa câmara de biosegurança para não mais do que 5 minutos e ressuspender o sedimento de ADN em 34 ul de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
Nota: acrilamida linear irá ajudar a visualizar sedimento de DNA após a precipitação S / N. - Determinar a quantidade de ADN e de qualidade utilizando uma alta sensibilidade do ensaio de quantificação de ácidos nucleicos fluorescente e um espectrofotómetro microvolume, respectivamente, seguindo as instruções do fabricante (ver o quadro de Materiais).
Nota: Se várias amostras são preparadas na hora, um ensaio nucleico fluorescente ultrasensitive ácido para quantificar dsDNA e baseado em placa fluorometer / espectrofotômetro pode ser usado em seu lugar.
3. Preparação de ADN da biblioteca
- Enzimaticamente fragmento de um nanograma de ADN bacteriano usando um método baseado em transposões (tagmentation). Adicionar sequências de adaptador e de índice para DNA fragmentado seguindo as instruções do fabricante. Objecto tagmented amostras a 12 ciclos de PCR, como indicado nas instruções do fabricante, no ponto em que os índices de sequenciação são incorporados.
4. Automated Gel Seleção Tamanho
- Ir padrão pós-PCR passo de limpeza descrito nas instruções do fabricante (Ver Tabela de Materiais). Tamanho selecione amostras pós-PCR diretamente usando uma plataforma automatizada de seleção de tamanho com base em gel.
- Adicionar 3,5 uL de tampão de carga para cada amostra.
- Seguindo o protocolo do fabricante, carregar as amostras para a estação de trabalho electroforese, especificando um tamanho alvo-selecção de 500-800 pb, num extracto de 300 uldo volume de iões, utilizando um pré-moldado de 1,5% de agarose a cassete.
- Concentra-se o material resultante em bruto (300 uL) para baixo para 25 ul por precipitação com etanol.
Nota: Como alternativa, use a estação de trabalho de eletroforese para automatizar concentração para um maior número de amostras através de placa de filtro e tubo de vácuo.- Precipitar o volume de eluição em bruto utilizando 0,1 volumes de acetato de sódio 3M, 2 volumes de etanol a 100% e 5 uL de 5 ug / ul acrilamida linear. Misture bem, coloque as amostras a -80 ° CO / N. Centrifugar as amostras a 17.000 xg durante 30 min.
- Rejeitar sobrenadante e prosseguir a lavagem sedimento de DNA com 1 mL de etanol gelado a 70%.
- Centrifugar as amostras novamente a 17.000 xg durante 30 min, os sobrenadantes descartar, ar seco, e finalmente ressuspender pelota de ADN em 25 ul de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
- (Opcional) Use 1 ml de tamanho bibliotecas de DNA selecionado com a plataforma de seleção de tamanho de gel automatizado para fazer um cincodiluição -fold usando uma solução tampão de Tris-EDTA, pH 8,0. Analisar bibliotecas utilizando um instrumento de eletroforese capilar baseada em chip para analisar a qualidade de dsDNA de acordo com as instruções do fabricante.
5. Biblioteca Normalização e Sequencing
- Prossiga para normalizar amostras utilizando contas de normalização de biblioteca (incluído no kit de preparação biblioteca baseada transposon), conforme descrito no guia de preparação do fabricante.
- Alternativamente, bibliotecas de dsDNA medir utilizando um ensaio de quantificação de ácido nucleico de alta sensibilidade fluorescente, seguido por agrupamento em proporções equimolares até atingir uma concentração final de 2 nM dsDNA. Avance para desnaturar bibliotecas utilizando 10 ul de bibliotecas reunidas e 10 ul de NaOH 0,2 N, incubar durante 5 min à TA. Diluir bibliotecas desnaturados utilizando tampão de hibridação (incluída com o kit de preparação à base de transposão) para um volume final de 1 ml e a concentração de 23:05.
- Amostra de cargas em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração, seguindo os protocolos de seqüenciamento padrão do fabricante.
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Representative Results
Concentração DNA, e Avaliação da Qualidade
As concentrações de DNA bacterianas, variou de 0,01-0,11 ng / ml por amostra de água dos diferentes sítios de bacias (Tabela 1). O ADN isolado a partir de uma fracção bacteriana teve 260/280 e 260/230 A rácios de 1,4 a 1,8 e 0,3 a 1,6, respectivamente. Enquanto alguns dos rácios Um 260/230 foram relativamente baixos, não foi observada inibição aparente na biblioteca preparada e outras aplicações a jusante. Estas aplicações incluídas PCR e qPCR testa alvo rRNA 16S e cpn 60, e subsequente sequenciação amplicão (dados não mostrados).
Ranger Tecnologia
Bibliotecas de ADN preparadas com um método e um tamanho de gel à base de transposão seleccionado com uma plataforma de alto rendimento automatizado produziu uma gama apertada de fragmentos de ADN entre 500-800 pb (Figura 3). Esta pr alternativaotocol originou concentrações que variam 0,3-3,4 ng / mL (Tabela 1). Utilizando uma média de cerca de 650 pb de tamanho do fragmento de DNA, a concentração média para esta biblioteca foi 3,81 nM de material de entrada. Bibliotecas foram consistentemente tamanho selecionado em todas as bibliotecas de DNA preparados a partir de vários locais da bacia hidrográfica.
Parâmetros DNA Sequencing QC
A sequenciação de ADN desta biblioteca no Ilumina MiSeq gerada uma densidade de aglomerado de 1198 K / mm 2. A porcentagem de filtros de passagem de cluster foi de 84,2%, com um rendimento estimado de 9,2 Gb. Além disso, 7,4 Gb ou 82,8% das leituras tinha um índice de qualidade ≥30. A utilização de uma plataforma automatizada seleção de tamanho de gel consistentemente resultou em rendimentos adequados e minimizou a aglomeração de fragmentos indesejáveis abaixo de 200 pb.
<br /> Figura 1. As amostras de água foram coletadas de áreas urbanas (A) e agricultura (B) bacias hidrográficas influenciaram.
Figura 2. Representação esquemática dos métodos utilizados para gerar bibliotecas de DNA à base de transposon a partir de amostras de água doce. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.
Figura 3. Os electroferogramas das bibliotecas de ADN gerados a partir de amostras de água doce: (A) bibliotecas pós-PCR de ADN anteriores para selecção de tamanho e dimensão (B), bibliotecas de DNA seleccionada usando o automatizadotamanho gel (faixa-alvo: 500-800 pb), plataforma de seleção. Todas as amostras foram diluídas cinco vezes com tampão TE.
| Amostra ambiental | Concentração de ADN bacteriano (Ng / ml) * | A 260/280 | A 260/230 | Concentração de DNA (ng / mL) antes de seleção de tamanho, o volume: 25 ul | Concentração de DNA (ng / mL), após seleção de tamanho, o volume: 25 ul |
| 1 | 0,11 (0,16) | 1,8 | 1.4 | 27 | 1.2 |
| 2 | 0.11 (0.20) | 1,8 | 1.3 | 27.4 | 3.3 |
| 3 | 0,10 (0,37) | 1,8 | 1.6 | 19.5 | 3.4 |
| 4 | <td> 0,04 (0,04)1,5 | 0,5 | 24.4 | 1.6 | |
| 5 | 0,11 (0,13) | 1,7 | 1.0 | 26.1 | 1.1 |
| 6 | 0,05 (0,03) | 1,5 | 0,7 | 15.2 | 0,4 |
| 7 | 0,01 (0,01) | 1.4 | 0,3 | 15.1 | 0,3 |
| 8 | 0,03 (0,05) | 1.6 | 0,7 | 17 | 0,9 |
| * Os valores indicam a concentração de dsDNA usando um ensaio de quantificação de ácidos nucleicos fluorescente de alta sensibilidade. Número entre parênteses representa concentração, utilizando um espectrofotômetro microvolume. | |||||
Tabela 1. A qualidade e a avaliação da quantidade de ADN extraído de amostras de água doce ambientais, e as bibliotecas à base de transposões, antes e depoisseleção de tamanho de gel automatizado.
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Discussion
A presença de dímeros de adaptador e aglomeração de pequenas dimensões de inserção preferencialmente sendo sequenciados em plataformas atuais representam uma diminuição nos rendimentos utilizáveis e subutilização da capacidade do equipamento 15. A utilização de métodos de batimento grânulos combinados com uma abordagem baseada no transposão para preparar bibliotecas podem resultar em mais de cisalhamento de ADN em comparação com os outros métodos de extracção de 4,5. No entanto, todos os métodos de extracção e preparação da biblioteca potencialmente introduzir desvios para a distribuição de sequenciação lê 8,16. As observações experimentais utilizando uma plataforma de extracção de ácido nucleico automatizado, combinada com um método de ligação à base, não parecem remover o excesso de dimeros de adaptador de bibliotecas de espingarda (dados não mostrados). O estudo utilizou um protocolo modificado para preparar bibliotecas de amostras ambientais por fragmentos de DNA de selecção do tamanho dentro de uma gama muito específica, minimizando, assim, a transição de dímeros de adaptadores ou pequenoOs fragmentos de ADN. O uso de uma plataforma automatizada de selecção do tamanho de gel gerado vestígios reprodutíveis de bibliotecas de ADN dentro de um intervalo específico de 500-800 pb (Figura 3). Embora um grande número de leituras em bruto (~ 1,5 milhão) foram obtidos utilizando o tratamento padrão (esferas paramagnéticas em relação 0,5x) em comparação com outras limpezas (isto é, duas vezes a relação de 0,5x) e o protocolo modificado aqui descrito, apenas 55% de as leituras por amostra foram superiores a 225 pb. A percentagem de leituras por amostra utilizando o protocolo modificado gerado, pelo menos, 75% de leituras superior a 225 pb. No tratamento padrão, o grande número de leituras indicadas sobre uma representação de curto lê na biblioteca. O tamanho dos fragmentos seleccionados com esferas paramagnéticas (padrão) de tratamento ter sido relatada a ser variável em relação à selecção do tamanho de gel 17 se aproxima. Este protocolo modificado gerado mais informativos do que lê esferas paramagnéticas. A utilização de selecção em gel para construir bibliotecas tem umlso indicou uma redução na incidência de quimeras de ~ 5% para 0,02% 9.
As etapas críticas no presente protocolo incluem considerações para a normalização do DNA de entrada, quantidade de DNA nas bibliotecas, e da química da mistura principal PCR. Dependendo da concentração inicial de ADN de entrada, pode ser para medir e diluir o ADN para baixo para uma quantidade de 1 ng exigido pelo método à base de transposão usado aqui e abordagens baseadas em esferas, assim, mais rapidamente automatizáveis para normalizar a entrada de ADN pode também demorado ser considerados na preparação da amostra inicial 18. Seguindo tagmentation e incorporação de índices, as amostras foram directamente seleccionadas utilizando o tamanho da estação de trabalho electroforese descrito neste estudo. Um passo crítico neste procedimento é a quantidade de ADN carregado para o sistema. A concentração mínima da amostra de DNA para detecção óptica depende da natureza da amostra (amplicão contra shotgun de sequenciação). Rendimentos de recuperação ter sido intrínsecasmostrado a realizar-se com amostras de baixo investimento e eficiência de recuperação> 75%. A quantidade menor de ADN que pode ser detectado pelo sistema de selecção de tamanho de gel automatizado aqui descrito é 1,5 ng de DNA total (Nesbitt, M. e Slodoban, J., 2014, dados não publicados). No entanto, a detecção óptica da amostra, não é necessária a realização de selecção de tamanho, como marcadores duplos de corante são usadas para determinar onde o tamanho seleccionar um alvo específico. Antes de bibliotecas preparadas a partir de amostras ambientais foram carregados na plataforma, a concentração de ADN foi quantificado usando um fluorómetro. A faixa relativamente estreita de concentrações de DNA foi detectada em amostras de pós-PCR (Tabela 1). Embora estas amostras continham uma mistura de sais, dímeros, polimerase de ADN, o ADN amplificado do ambiente, e os reagentes não divulgados 19, estas concentrações representadas, pelo menos, 252 vezes mais elevada do que a menor quantidade de DNA relatadas detectáveis por electroforese a estação de trabalho. Normalmente, a seleção de tamanho de frag DNAtos seriam realizados numa solução tampão em vez da mistura principal de PCR. Embora a informação sobre PCR master mix utilizado neste protocolo foi divulgada a partir do fabricante, foram realizados testes preliminares para localizar a migração de marcadores duplos de corante na mistura (dados não mostrados). Um tampão de elevada força iónica na mistura principal de PCR irá alterar a mobilidade electroforética da amostra, e assim, esta variável deve ser acomodada. A plataforma de gel de selecção automatizada descrita neste estudo expõe uma opção para indicar se uma amostra é em força iónica elevada. Quando esta opção for usada, as curvas de mobilidade eletroforética então alterados e parâmetros de rastreamento banda atrasadas são empregadas. Portanto, é possível que a química da mistura de PCR terá um impacto sobre o tampão de carga e marcadores, e afecta a migração de fragmentos de ADN no gel.
Existem alguns sistemas comercialmente disponíveis para selecção automatizada ou semi-automatizada tamanho gel. Estesinstrumentos também fornecer separação, recuperação e documentação em menos de 1 hora. No entanto, existem limitações quando se trata de número de amostras que podem lidar com estes sistemas, e os custos associados com consumíveis 17,20. Neste contexto, a técnica aqui descrita trabalha com aspectos tanto de selecção de tamanho em gel de agarose e análise. Até 96 amostras podem ser tamanho selecionado em uma única corrida, enquanto que até 192 amostras podem ser caracterizadas com eletroforese de alta resolução. Além disso, o instrumento também pode completar as tarefas de manuseio de líquidos genéricos os usuários esperam de uma estação de trabalho automatizado.
Volume de eluição bruto deste protocolo de 100 a 400 ul, dependendo do intervalo alvo (25 pb a 40 kb). Embora este aspecto do instrumento pode ser percebido como uma limitação, deve notar-se que as bibliotecas de ADN eluídos com um volume de 300 ul teria uma concentração média de 301 pM (dados não mostrados). Este valor resultante repreresenta uma 26 vezes maior do que a concentração necessária final para sequenciação em uma plataforma MiSeq (~ 23:05). No presente estudo, precipitação com etanol, representou um passo adicional em termos de tempo utilizados na preparação de biblioteca. Atualmente, o volume de eluição pode ser ainda mais reduzido pelo uso de uma etapa de filtração on-deck vácuo que utiliza uma placa de filtro comercial e um tubo de vácuo que se encaixa no deck (upgrade). Usando esta instalação, o volume de eluição em bruto é transferido para a placa de filtração, concentrou-se e em seguida ressuspenso em 25 ul (Slodoban, J., 2014, comunicação pessoal). Para este estudo, a precipitação de ADN foi realizada para manter o fluxo de trabalho de acordo com o volume de entrada necessário para a normalização da amostra passo como descrito no kit à base de transposão.
Esta técnica de modificação pode ser aplicável a bibliotecas de ADN ou de ADNc preparadas a partir de outras amostras ambientais, tais como água do mar, ETAR, sedimentos, solo, ou materiais microbianos. O autogel acoplado plataforma seleção tamanho relatado aqui pode ser aplicada com modificações mínimas, não só para as plataformas de sequenciamento Illumina, mas também para outras plataformas de sequenciamento de próxima geração, incluindo Roche 454, Life Technologies, e BioSciences Pacífico. Considerações especiais para se adaptar essa tecnologia para outras plataformas incluem a carga de capacidade bem (até 51 ul), referências de dimensionamento ou marcadores, e percentual de cassete em gel de agarose (dependente fração da meta). Este gel automatizado técnica de seleção de tamanho de alto rendimento é uma forma de discriminação de purificação e é adequada para baixo custo caracterizações eletroforéticos. Outras aplicações que podem se beneficiar desta tecnologia incluem projetos de RNA-Seq, seqüenciamento fragmento de comprimento (incluindo metagenomics funcionais), síntese de genes, par companheiro de construção da biblioteca, de novo e complexo sequenciação do genoma, restrição digerir análise e genotipagem.
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Disclosures
Jared R. Slobodan e Matthew J. Nesbitt tanto deter ações da Coastal Genomics, uma empresa British Columbia propriedade privada oferecendo a tecnologia Ranger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic pump Masterflex P/S 1400 Series | Thermo Scientific | 1400-1620 | |
| 0.2 µm Supor Membrane | VWR | CA28143-969 | Pall Corporation, Ann Harbor, MI |
| Tungsten carbide beads 3 mm (200) | Qiagen | 69997 | |
| Isopropyl alcohol 70% | Jedmon Products | 825751 | Healthcare Plus |
| DNA away | VWR | 7010 | Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA |
| Milli-Q water purification system | Fisher Scientific | ZMQS6VF0Y | Merck Millipore. This system has been discontinued. |
| 20x PBS pH 7.5 | VWR | E703-1L | Amresco, Inc., Solon, OH |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | Fisher chemicals |
| Vortex adapter for 2 (50 ml) tubes | VWR | 13000-V1-50 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex-Genie 2, 120 V (Model G560) | VWR | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. |
| Beckman Centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd | Model J-6B | |
| PowerLyzer Powersoil DNA isolation kit | VWR | 12855-100 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex adapter for 24 (1.5-2 ml) tubes | VWR | 13000-V1-24 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Microfuge 18 centrifuge | Beckman Coulter | 367160 | |
| Nimbus Select workstation with Ranger Technology | Hamilton Robotics | 92720-01 | Includes the liquid handling workstation and integrated Ranger Tech (electrophoresis hardware) |
| Ranger reagent kit | Coastal Genomics | CG-10600-150-12-21 | Includes loading buffer and cassettes |
| Ethyl alcohol (anhydrous) | Commercial Alcohols | P016EAAN | Greenfield Ethanol |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| Linear acrylamide (5 mg/ml) | Life Technologies | AM9520 | Ambion |
| Eppendorf refrigerated centrifuge | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. | 5417R | |
| Buffer EB (250 ml) | Qiagen | 19086 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q32857 | Invitrogen. This product has been discontinued. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Life Technologies | Q32854 | Invitrogen |
| High sensitivity DNA reagent | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| High sensitivity DNA chips | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent 2011 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| Nextera XT DNA sample preparation kit | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT index kit | Illumina | FC-131-1001 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500-cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Miseq system | Illumina | SY-410-1003 |
References
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