Summary
このプロトコルの目的は、培養細胞または動物組織からのDNAにおけるHPLC-EDによるDNA酸化のマーカー、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン（8-オキソdGuo）の検出です。
Abstract
酸化ストレスは、DNAなどの生体高分子の酸化につながる、多くの生理学的および病理学的プロセス、ならびに生体異物代謝に関連しています。そのため、DNAの酸化の効率的な検出は、医学と毒物学などの研究分野、各種のために重要です。酸化的損傷を受けたDNAの一般的なバイオマーカーは、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン（8-オキソdGuoあるしばしば誤っと称される8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン（8-OH-dGuoまたは8 - オキソ - dGの））。電気化学検出（HPLC-ED）と、高圧液体クロマトグラフィーにより8-オキソdGuo測定するためのいくつかのプロトコルが記載されています。しかし、これらは主に酸化促進剤で処理された精製されたDNAに適用しました。また、原因の研究室間の方法論の違いに、主に分析機器の違いによる、HPLC-EDによる8-オキソdGuoの検出のための公表された方法の採用は、各研究室によって慎重な最適化を必要とします。 Aこのような最適化処理を説明する包括的なプロトコルは、不足しています。ここでは、詳細なプロトコールは、培養細胞または動物組織からのDNAにおいて、HPLC-EDによって8-オキソdGuoの検出のために記載されています。これは、DNA試料の調製を容易かつ迅速に試料調製の間に発生することが望ましくないDNAの酸化を最小にするように最適化することができる方法を示します。このプロトコルは、酸化剤KBrO 3で処理した培養ヒト歯槽腺癌細胞（ すなわち 、A549細胞）における、および多環式芳香族炭化水素ジベンゾ（DEF、P）クリセンに曝露されたマウスの脾臓から8-オキソdGuoを検出する方法を示しています（DBC、旧ジベンゾとして知られている（L）ピレン、DalP）。全体的に、この作品は、HPLC-EDの方法論は容易に生物学的サンプル中の8-オキソdGuoの検出のために最適化することができる方法を示しています。
Introduction
その定常状態レベルの酸化的DNA損傷の頻度の増加に寄与し、多くの病的状態とxenotoxic代謝中に増加させることができる反応性酸素種（ROS）。いくつかの可能な核酸塩基の酸化物の中でも、酸化的DNA損傷を容易に '2の酸化形態の一つである安定したマーカー8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン（8-オキソdGuo）を用いて測定することができます-deoxyguanosine（dGuo）1。 8-オキソdGuoは最も豊富なDNA損傷2であり、したがって、複数のDNAの酸化生成物3の存在にもかかわらず、DNA酸化のバイオマーカーとして、より詳細に検討されています。ヒトでは、この損傷は8-オキソグアニングリコシラーゼ1（hOGG1）4によって塩基除去修復を経て修復することができます。未修復のままにすると、8-オキソdGuoが塩基対置換変異の形成（ すなわち 、Gは転換をTに）に貢献することができる4。重要なことは、8-オキソdGuoは、確立されたマーカーのFOです開始と発癌2の促進に関連するr個のDNA損傷。したがって、8-オキソdGuoの正確な定量は、酸化的DNA損傷5の有用なバイオマーカーであると望ましいです。
さらに広まっ2デオキシグアノシンの酸化的損傷を受けた形態のための正しい名前に関する文献における混乱と、日常的に酸化的DNA損傷6のバイオマーカーとして測定した化合物（複数可）の正しい名前があります。 8-オキソdGuo（ 図1に示す）の6,8-ジケトおよび6エノール、8-ケト互変異性型は、文献5,7で説明した2つの最も顕著な互変異性体です。 6,8-ジケトフォーム7.4の生理的pHで最も顕著な形態であり、そして最も顕著なDNAの酸化生成物7です。したがって、8-オキソdGuoはなく8-ヒドロキシdGuoこの酸化生成物6のための最も適切な名前です。むしろnucleobより、2 - デオキシグアノシン（dGuo）ことに注意することも重要ですアーゼのグアニン（グア）またはリボグアノシン（郭）が、それぞれ、最も方法6により検出されます。
DNAサンプルの消化i）においてばらつき、試料調製中に発生する可能性がある8-オキソdGuoにdGuoのii）の不定酸化、 およびiii）必要性：8-オキソdGuoの正確な検出および定量化が原因に困難です分析HPLC-ED法8の効果的な検証のため。 III）を部分的にのみを含めることによって対処している間にこのプロトコルでは、封入金属キレート剤とキレート剤処理されたソリューションと特殊なDNA単離試薬によって、我々は完全なDNA消化のための有利な条件を提供することにより、）私を達成することを目的とし、II）ポジティブコントロールは、したがって、本方法は、生物学的試料中の8-オキソdGuoを検出することができることを提供します。さらなる検証はこの論文の範囲を超えています。しかし、このプロトコルは将来のを助けると確信していますユーザーは、彼らが正式にその目的に応じて、プロトコルを検証する必要がどの程度を決定します。メソッドの仮の検証に必要な手順のリストがさらに提供されます。 8-オキソdGuo検出のための方法の開発と展開の間に、公表された方法を検討し、併合されました。したがって、この方法は、8-オキソdGuoの検出および定量のための方法がうまく採用されている場合にも、検査の迅速かつ簡単な手段を提供しながら、多くの場合、重要な実験の詳細を欠いている、いくつかの公開されたソースから情報を収集する必要がなくなります。この適応方法は、正常培養細胞およびマウス組織からDNAサンプルを分析するために使用しました。このビデオの記事は、HPLC-EDによる8-オキソdGuoを確実に検出および定量化のための効果的な方法を確立する他のグループを支援します。
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Protocol
ことを確認し、すべての畜産、住宅、取り扱いおよび実験は、ローカルルールと規制に準拠し、その実験プロトコルは、任意の研究を開始する前に承認されています。記載された実験では、動物のケア、処理、および治療はカナダ保健省の動物管理委員会によって承認されました。サプライヤーの詳細については、「試薬テーブル」を参照してください。
1.生物学的サンプルを収集
- 細胞または動物組織
- 10％ウシ胎児血清、ペニシリン100単位/ ml及びストレプトマイシン100μg/ mlを含むF12-K培地でヒト肺胞腺癌A549細胞を成長させます。
- 10 cmのプレートあたり約100万個の細胞でシード細胞。各実験について、酵素消化及びHPLC分析のために十分なDNA（80μgの）を提供するために、合計12プレート（X 4用量つの生物学的複製ごとに3つのプレート）のセットを使用します。
- 細胞密度はおよそより大きくなるとimatelyプレートの表面積の70％は、培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水4mlの（PBS）、pH7.4で細胞を2回洗浄します。
- 動物培養細胞については、陽性対照としてKBrO 3を使用しています。
注：KBrO 3濃度と8-オキソdGuo周波数と正の直線関係は、文献9で報告されています。 - PBSでKBrO 3を溶解します。細胞培養培地中の最終濃度は未露光細胞に8-オキソdGuoの相対的で統計的に有意な増加を得ることが1mm以上であることを確認してください。シリーズ（ 例えば 、12 10 cmのプレート）の各プレートにKBrO 3の同じ濃度を追加します。
- 37℃で3時間培養します。メディアを取り出し、PBSで1回洗浄。
- （ストック濃度2.5グラム/ ml）のトリプシン溶液1mlを加え、37℃で3分間インキュベートします。
- 4ミリリットルのPBSで洗浄し、各単一50ミリリットルに設定円錐polystyrから細胞を採取エン遠心管、および4℃で5分間1,000×gで遠心します。
- PBSを除去し、さらなる分析まで-80℃で細胞ペレットを保存します。他の箇所10記載の人工DNAの酸化は、さらに、核の単離によって最小化することができます。
- 動物組織
- 必要に応じて動物を用量。このプロトコルでは、成人（9週齢）オリーブオイルに溶解し20 mgのDBC / kg体重当たり一日で3日間連続して毎日の経口胃管栄養法により男性の牟田マウスを治療します。
注：このトランスジェニック動物の港に操作されたE.からλバクテリオファージおよび変異レポーター遺伝子のlacZ コリ 11は、トランスジェニックげっ歯類突然変異試験12に使用されます。 - 例えば 、動物の剖検を行い、マウスはイソフルランを使用してできて麻酔した後、胸腔の開口部に続いて頸椎脱臼を介して安楽死させました。直ちに液体窒素中で凍結組織を点滅。分析まで-80℃で保存した組織。
注：処理後の安楽死の時期はもう一つの重要な変数（例えば、DNAの酸化はラットの脳と肝臓13における騒音暴露後72時間で最大であった）であってもよいです。
- 必要に応じて動物を用量。このプロトコルでは、成人（9週齢）オリーブオイルに溶解し20 mgのDBC / kg体重当たり一日で3日間連続して毎日の経口胃管栄養法により男性の牟田マウスを治療します。
2. DNA抽出、沈殿および洗浄（組織を2.2に直接進むために）
- 例えば、DNAzolとしてDNA単離剤1mlを50mlコニカルポリスチレン遠心管中に回収した細胞をホモジナイズします。溶液が均一になるまで、細胞ペレットを分散させるために千μlのピペットチップを使用してください。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブにホモジネートを転送します。 10〜20分間氷上でインキュベートします。 2.3に進みます。
- 500μlのDNAの隔離剤を含む1ミリリットルハンドヘルドテフロン加工のガラスホモジナイザーで組織の15〜20 mgの均質化します。ゆっくり上げ、約1分間の下ホモジナイザー;より柔軟な組織が少ない時間を必要とします。穏やかな治療法は、DNAの少ないせん断を保証します。約10〜20分間、氷上でホモジネートを保管してください。
- ペレット1.5ミリリットルの円錐形マイクロチューブ10,000×gで、4℃で10分間遠心分離によりホモジネート。
- 慎重にペレットを接触させることを避けるために細心の注意を払って新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移します。
- ホモジネートを1ml当たり0.5ミリリットルの100％エタノールを添加することによってホモジネートからDNAを沈殿させます。単離試薬を確実にするために、チューブを10回反転し、EtOHで十分に混合されています。
- この時点で、DNAの沈殿を（200μlの最大保持容量で、 例えば ）プラスチックピペットチップにそれをスプールしてから、新しい1.5ミリリットルの円錐形のマイクロチューブに移し、粘性です。
注：クイック遠心分離は、単離されたDNAから残りの溶解物を除去するために使用することができます。
（DNA洗浄と可溶化） - 単離されたDNAは75％エタノールを1ml加えます。チューブを10回反転させて徹底的にDNAペレットを一時停止します。
- 慎重にチューブからエタノールをデカント。その目を確認してくださいEのDNAペレットをチューブの側面に付着します。 1-2分間垂直にチューブを保存し、チューブの底から余分なエタノールを除去するために、ピペットを使用しています。
- もう一度洗浄し、そしてC（数ヶ月のための安定した）-20℃でエタノール中のサンプルを保存したり、すぐに消化に進むのいずれかのDNAを繰り返します。
- 消化緩衝液中でDNA（以下に記載）を溶解した後、（ すなわち 、260nmにおける吸光度を分光光度計を使用して）標準的な分光法を用いて定量化します。
3.酵素消化
- 適切な量を組み合わせることにより、「消化緩衝液」を調製一塩基リン酸Na、50mMの二塩基リン酸Na（2.0のKCl、1.0ミリモルのデスフェラール（DFO）と200のMgCl 2を含む）50mmの（サンプル数に応じて消化し ます） （また、2.0のKCl、1.0mMのDFOおよび200のMgCl 2を含みます）。各サンプルは、4.0μlの一塩基および17.0μlの二塩基性リン酸塩溶液を必要とします。 <LI>チューブの底から残りのエタノールを除去し、約5分間、空気乾燥サンプル。 DNAが完全に乾燥しないことを確認してください。
- 消化緩衝液の21.0μlのDNAを抽出した80μgのを溶解、私は消化バッファーの2.0μLに溶解したDNアーゼの1単位を追加します。
- ボルテックス軽く完全な混合を達成し、37℃で1.5時間インキュベートします。
- インキュベーション期間の終わりに、2.0ミリモルのKCl、1.0mMのDFOおよび200 mMのMgCl 2を含有する50mMの二塩基性リン酸ナトリウム溶液216.4μLを加えます。
- 二塩基の9巻、50 mMのリン酸Na（2.0 mMのKClを含む、1.0 mMのDFOおよび200のMgCl 2）で消化緩衝液の一冊を組み合わせることにより、「消化緩衝液-2」を準備します。
- 私は消化緩衝-2の16.3μlの酵素ホスホジエステラーゼの0.025単位（PDE）を追加します。数秒間上下にピペットし、軽くボルテックス十分な混合を達成し、37℃で1.5時間インキュベートします。
- 0を追加します。消化緩衝液-2の8.0μlのアルカリホスファターゼ（AP）の0.4単位。数秒間上下にピペットし、軽くボルテックス十分な混合を達成し、37℃で1.5時間インキュベートします。 33.0μlのHPLCグレードメタノールを追加します。
- 酸化を最小限にするために使用するまで-80℃ですぐに、以下に記載またはストアとして、HPLCで消化されたDNAサンプルを実行します。注：ここで提案1.5時間の消化ステップは、そのような間隔に基づいて他の場所9と同様のプロトコルは、完全なDNA消化9を達成することを発見に提案しました。したがって、完全な消化を達成するための唯一の制限因子は、時間であり、この酵素の阻害は、試料の不均一性が無視できたと仮定しました。
4. HPLCを実行します：移動相の調製、計測のセットアップとメンテナンス
- すべての緩衝液を調製するために超純水を使用し、高い結合強度樹脂（ 例えば 、キレックス100で処理した：スチレンdivinylbeイミノジ酢酸とnzene共重合体は、高い親和性を有するキレート化遷移金属）は、試料調製中に金属汚染及びDNAの酸化を最小限に抑えるために、そのイオン。
- 250mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.2を準備します。リン酸ナトリウム（FW = 119.98グラム/モル）を一塩基ために第二リン酸ナトリウム（FW = 177.99グラム/モル）の3.6957：1の比率を使用してください。
例：したがって、3 L原液のために、一塩基性の70.81グラムと二塩基粉末の28.43グラムを組み合わせ、例えばまで2.8 Lを、水を追加し、溶液のpHが6.2であることを確認します。濃縮された酸または塩基によって個別にではなく、準備250mMのモノまたは二塩基性リン酸ナトリウム溶液とのpHを調整します。 10のKClの濃度を得るために、塩化カリウム2.24gのを追加します。 - - HPLCグレードのメタノール、溶剤 - Bの超純水、溶媒C - リン酸緩衝液のステップ4.2から溶媒Bを：含む、3本、少なくとも1 Lごとに移動相を準備します。ボトルにHPLC移動相供給チューブを挿入します。 remainiNGチューブはまた、ボトルの一つ（ 例えば、溶液C）中に浸漬し、それらが混合のために必要とされていない場合でも発動を促す必要があります。
- 実行中、2.0mMのKClを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.2）、6％のMeOHの最終溶液を達成するために、6％溶媒A、74％溶媒Bから20％溶媒Cとしての移動相溶液を混合。
- 、電気化学検出器から電極を外し、それと電極洗浄液できれいに参照電極と作用電極とメーカーが推奨する研磨ディスクを分解。 、超純水で洗浄された表面を洗浄し、穏やかに水を拭き取り、検出器は、システムをオンにする前に乾燥していることを確認します。
- 検出器を組み立て直して電極に移動相入口を接続します。流れをオンにして、移動相が流出移動相チューブを取り付ける前に電極を埋めることができます。最適化を開始する前に新しい列をインストールします。インストールが適切な方向およびfであることを確認してくださいすべてのメーカーの推奨をollows。
- かなり前（ 例えば、1時間）、サンプルのHLPC計器をオンにすると、平衡化を可能にするために、ベースラインノイズを低減するために分析します。推奨設定については、表1を参照してください。背圧力限界は、カラムの損傷を避けるために、3,000 PSIに設定してください。脱気装置の電源をオンにします。ポンプをプライミングし、溶媒勾配を設定するに進みます。
- ドライプライム製造業者の指示に従ってポンプ。移動相が交換されたか、チューブの入口が空気にさらされている行を濡らすためにこれを行います。
- プライミングディスクを見つけて、そこに10〜15ミリリットルのプラスチックシリンジを挿入します。注射器が完全にラインを開く前に挿入されていることを確認します。回線を開くには、単に一回転するディスクを反時計回りに回します。
- 適切なHPLCインターフェースの選択と素数を開始します。静かラインに流体を描画するために注射器を引き出します。流体が流れているしたら、首相は完了です。プログラムができるようにします実行を終了します。すべての行（楽器に応じて、通常は4）を繰り返します。
- 代わりに、行がすでに以前のドライプライムから濡れるウェットプライム（下記参照）。
注：多くの時間が使用する（ 例えば 、2週間以上）との間に経過すると、ドライ素数をお勧めします。 - HPLCユーザインタフェースを使用して25％のそれぞれの移動相溶媒成分の組成を変更します。インターフェースから、その後、「ダイレクト機能」オプションを選択し、「ウェットプライム」オプションを選択します。これは同時にプライム全てのラインになります。
- すべての空気が、それは廃棄物容器に入ると、ウェットプライムラインを観察することによって、システムの外にあることを確認してください。良いプライム後、気泡が一列に残っていないことを確認してください。泡が持続する場合、プライミングを繰り返します。
- ポンプがプライミングされると、HPLC移動相の移動を開始します。手動で6％のメタノール（溶媒A）および94％の移動相の組成を変更するためにHPLCを使用して、インターフェイス水（溶媒B）、0.9 ml /分の流速を選択します。 5分は、カラム洗浄工程から任意のメタノールをクリアすることができます。
- 5分後、6％のメタノール（溶媒A）、74％の水（溶媒B）、20％の緩衝液（溶媒C）の組成を変化1.0mL /分の流量を増加させます。 表1に要約し、カラムの損傷を回避するために、3,000 psiのに背圧の上限を設定するなどの他のパラメータを設定します。
注：HPLCセットアップの潜在的な問題が漂うベースライン、スプリットピークと減少し、信号強度が含まれます。これらは通常、各使用後に頻繁な電極クリーニングカラムを洗浄し、緩衝液（ 例えば 、粒子状物質または微生物増殖）汚染のないことを保証することによって克服することができます。 - 安定したベースライン信号を達成するために、約1〜1.5時間、移動相を実行します。
- 機器のソフトウェアインタフェースを使用して、 表1に示され、15分の時間を実行したように、選択パラメータ。 SAMを注入PLE。複雑なサンプルのために増加した実行時間を使用します（15分間隔を超えてピークの有無を観察することによって、経験的にこれを決定します）。
注：インストゥルメントソフトウェアは、自動サンプリング用のサンプル実行条件のプログラミングとセットアップを可能にします。 - 実行が完了した後、検出器のインターフェースを使用して検出器セルをオフにします。これは、不適切な取り扱いやシャットダウンなどの検出器は、機器に損傷を与える可能性がパワーダウンに関するメーカーの推奨に従うことが重要です。これは、機器が故障することがあり、検出器の背面を切り替えることにより、セルの電源を切らないでください。
- 手動6％メタノールおよび94％の水を移動相の組成を変更します。 5分間実行します。
- 手動ですぐに0.7 ml /分の流速を低下させる、50％MeOHおよび50％の水に組成物を変更します。少なくとも20分間実行します。推奨される時間のためにこのステップを実行しないと、カラム、検出器に損傷を与える可能性があります。 、流れの電源を切りその後、脱気装置の電源をオフにdが。
標準の5準備
- 上記の手順4.1から4.3に概説されるように移動相バッファを準備します。これは、試料注入の後に異なる溶液の混合に起因するピークを避けるために、標準の製造のためのHPLC移動相を使用することが重要です。
- 使用前に超純水で5に、この解決策1を希釈し、最終的な解決策は、6％のメタノールを含んでいなければなりません。
- dGuoスタンダード
NOTE：dGuoの検出に必要な高い酸化電位は、電気干渉化合物の測定のリスクを高めることができます。これは、例えば、検証260nmでdGuoのUV検出の標準曲線及びECの検出を使用して作成した標準曲線と比較することができます。両方がよく整列している場合（ 例えば 、 補足図1）は 、サンプルマトリクス効果が考慮されており、一つはむしろECの検出よりも、260nmのUVによってdGuo検出に進むことができます。- 高速でボルテックスdGuoが完全に溶解するまで。これは主要な株式です。数週間のために-20℃で保存します。
- 二dGuoストック（0.5 mm）を作成するには、HPLC移動相の857μlの一次dGuo株式の143μLを希釈します。使用するまで氷上で保存し、新鮮な毎日を準備します。
- 標準曲線を作成するために、さらに希釈液を作る（ 例えば 、 表2）。ストアソリューション氷上で、新鮮な毎日を準備します。実験試料と直列に基準を実行します。
- 実行する前に、最適な電圧を見つけるために、株式の最高濃度を用いて、検出器電圧を変化させます。
- 8-オキソdGuo標準
- 1.5ミリリットルマイクロチューブに8-オキソdGuo 1.0mgのを測定します。 0.1ミリリットルHPLCグレードのメタノールを追加します。高速の渦8-オキソdGuoが完全に溶解するまで。これは、8オキソdGuoの主要株式です。 SEVのため-20℃で保存ERAL週間。
- 別のチューブでは、一次株式およびHPLC移動相バッファ、渦の997.1μLの2.9μLを兼ね備えています。これは、二次株式（10,000 nm）で。
- 標準曲線（250 nM）をするための実用的なソリューションを作成するには、二次株式の24.4μlを、移動相緩衝液の975.6μLを兼ね備えています。
- 標準曲線を作成するために必要なソリューションを提供するためのさらなる希釈を行って（ 例えば 、 表3）。ストアソリューション氷上で、新鮮な毎日を準備します。実験試料と標準を実行します。
- 定量化
- （HPLC-コンピュータインタフェースの一部として、 補足図2A参照 ）、標準的なソフトウェアを使用して、8-オキソdGuoとdGuoの両方の曲線下面積を統合します。
- 、標準曲線の式を用いて標準曲線（曲線（ 補足図2B）の下の面積対各分析物の既知の濃度を構築し、8-ための比率を計算します各サンプルのオキソdGuo / dGuo。
6.アガロースゲル電気泳動
注：アガロースゲル電気泳動は、DNAの消化の完全性を検証するために行ってもよいです。
- 750ミリリットル超純水で242グラムトリス塩基（FW = 121.14）を溶解することにより、50×トリス - 酢酸-EDTA（TAE）バッファを準備します。 、そしてRTで1 L.店の最終体積に超純水を加え; 57.1ミリリットルを氷酢酸および0.5 100mlのM EDTAを加え（溶液のpHは、例えばで8.0に調整した場合EDTAが完全に溶解し、NaOHでpH8.0）に使用前に、このソリューションの50倍に希釈。
- アガロース1gを秤量し、100mlの1×TAE緩衝液中でそれを溶解し、1〜2分間電子レンジで加熱。アガロースを沸騰との接触を避けるために、ゴーグルと保護具を着用します。
- （：変異原注意）、アガロースゲル走行装置にそれを注ぐ約50℃まで溶液を冷却、5μlの臭化エチジウムを追加します。コームを挿入します。
- （;典型的には、DNAサンプルの10〜20μlのがロードされ、6X実行染料と混合して視覚化し、ロードを容易にするために、ボリュームが櫛サイズに依存）の溶液が固化するまで待って、ゲル上でTAE緩衝液を注ぎ、サンプルをロードします。
- 色素がゲル（150 Vで、例えば 、45分）の約2/3の長さを移行するまで、ゲルを実行します。 UV光下でDNAバンドを可視化します。
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Representative Results
dGuoは8-オキソdGuoが約6.4分（ 図2AおよびB）の保持時間を有していたのに対し、4.7分の保持時間を有することが観察されました。 図2Cに見られるように、2つの分析物のピーク高さの約1000倍の差が存在します。 8-オキソdGuoとdGuoためボルタモグラムは8-オキソdGuoのための最適な作動電位が+ 0.5Vであることが決定された0.2から1.1 Vの範囲で作動電位で基準を実行することによって得られ、0.9ましたdGuoのためのV（ 図3）。これらの電位は、文献14,15に記載されている他のガラス状炭素電極と一致しています。検出および8-オキソdGuoとdGuo電気化学的検出のダイナミックレンジの限界は、それぞれ8,9、フェムトモルとナノモル範囲であることが報告されています。 dGuoと8-オキソdGuoのための標準曲線は、適切な濃度範囲にわたって線形検出を確実にするために、毎日実行し、適切な実行する必要があります楽器のンス（ 図4）。標準曲線は、1つの標準曲線から生成された方程式からのサンプル中の分析物の濃度を計算することを可能にする既知の被検体濃度（ 補足図2）の関数としてピーク面積をプロットすることによって構築されます。
完全なDNA消化は8-オキソdGua周波数の正確な測定のために必要とされる、いくつかのゲノムDNAの消化方法は8,15,16が提案されています。必要に応じて、DNA抽出および消化の有効性は、アガロースゲル電気泳動（ 図5A）を使用して確認することができ、HPLC-ED（ 図5B）。消化されたDNA断片を有するサンプルがゲルをオフに実行して、このように未検出であった。図5（a）の明らかなDNAスメアとレーン（ 例えば 、レーン2、4、6、9、11、および13）は、未消化のDNAの存在を示します。 図5Bの高原は、さらにincubatiことを示しています1.5時間を超えて、消化酵素によるDNAの上dGuoより多くの量を生じない1.5時間後にほぼ完全な消化を示唆し、検出しました。また、アガロースゲル電気泳動及びHPLC-EDの両方がここで用いられるリン酸塩ベースのDNAの消化緩衝液の有用性を試験しました。このバッファは十分にHPLC移動相に一致して、異なるソリューション（データは示していない）の混合に起因する望ましくない検出器ノイズを生じさせません。したがって、リン酸ナトリウム緩衝液に文献で 提案されているバッファからスイッチ（ すなわち 、トリス塩酸8）は （ 図5（a）の右側対左）、このプロトコルのために推奨されます。 DNA消化の最適化のための基礎となる仮定は、酵素阻害およびサンプル不均一性が無視でき、消化時間であったことであったことに注意してください上記のように、唯一の制限因子でした。不完全なDNA消化をDETEであるには余りにも小さい断片をもたらしている可能性アガロースゲル遺跡にCTED。このような系統誤差が等しく、すべてのサンプルに影響を与えるにもかかわらず、さらなる実験は（ 例えば 、放射性標識プロオキシダント10で培養した細胞の治療は）完全にそのような可能性を排除するために実施することができます。
標準的な解決策とは異なり、消化されたDNAは、かどうかは、単離された細胞またはマウス組織から、いくつかの追加のピーク（ 図6Aおよび6B）を生成しました。これらは、8-オキソdGuoとdGuoのピークから離れたが、議論に概説検証演習の一環として実験をスパイクは、追加のピークは（ すなわち 、原因マトリックス効果へのサンプル不純物、例えば）の定量化を妨害するかどうかを調べるために必要とされます。 8-オキソdGuoピークは、標準での保持時間の一致によって確認しました。しかも、酸化促進剤治療を受けた細胞または動物からのサンプル（ 図7 8オキソdGuoピークの増加）。プロオキシダントKBrO 8-オキソdGuoの形成17につながるグアニンから一電子引き抜きで3参加しています。これは、プロオキシダントストレスの非存在下において、10 7 dGuoあたり8-オキソdGuoの2.4分子がA549細胞（ 図7A）で検出されたことは注目に値します。これは、代替、HPLC-ED法9の電位の欠点に対処するために設計された質量分析に基づくアプローチを用いて観察されたA549細胞において検出8-オキソdGuo / 10 7 dGuoの4.5分子に匹敵します。 DBC処理（ すなわち 、毎日20.0 mgのDBCは/ kg体重1日に3日間）は、マウスの脾臓DNA中の8-オキソdGuoのレベルを増加させました。 ROSは、 インビボ 8 中の多環芳香族炭化水素類の代謝中に生成されることが知られているので、これは、また、予想される結果です。ストレスを受けていない動物の脾臓中の8-オキソdGuoの相対レベルは、優れたagreemenである8.3から9.4 8-オキソdGuo / 10 6 dGuo（ 図7B）でしたHPLC-ED 18で標準的な条件下でのマウスの脾臓細胞で測定4 8-オキソdGの分子/ 10 6 dGuoの公表値とtが。ベースラインより上8-オキソdGuoのレベルが非常に小さいことを6,7示します。 DNAはここで観察されるよりも低いレベルに酸化されている場合はこのようにして、8-オキソdGuoのレベルは将来のプロトコルのユーザーが心に留めておくべきであるベースライン、区別できない場合があります。
図1. 8オキソdGuoの構造とその互変異性体8-OH-dGuoは8オキソdGuoよりもむしろ8-OH-dGuoはpH7.4の主な互変異性体であることに注意してください。
dGuo（A）および8-オキソdGuo（B）。HPLC-EDについては、図2保持時間クロマトグラムは、いずれかのdGuoの10.0μlの注入から得られた（1.0ナノモル合計）または8-オキソdGuo（千fmolの合計）と0.9 V（A）または0.5 V（B）で検出しました。 dGuoの保持ピークは約4.7分（A）であり、8-オキソdGuoのに約6.4分（B）としたこと。 2-3分の幅広いピークは、おそらく、注射の乱れに起因すると8 -オキソdGuoの濃度によって、（同様の強度で、すなわち 、常に存在）に影響されないされている。（C）スーパーインポーズクロマトグラムを二つの別々の（A）に記載の注射からUV（260ナノメートル）によって検出（B）。規格が同一の実行条件を使用して、同じ日に実行した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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図3.最適化の検出器電圧。dGuoの（A）ボルタモグラム0.7から1.1 V.（B）8-オキソdGuoのボルタモグラムの範囲でHPLC-ED分析によって検出された（最終濃度1ナノモル）（最終濃度500 fmolの） 3つの独立した実験の0.3〜0.7 V.手段の範囲でHPLC-ED分析によって検出（N = 3）±標準偏差示します。いくつかのケースではエラーバーは、プロット記号よりも小さいです。
dGuo（A）および8-オキソdGuo（B）図4.標準曲線。dGuoまたは8-オキソdGuoのいずれかの10マイクロリットルを0.9 V（A）または0.6 Vで注入し、HPLC-EDで測定した（B ）。三つの独立した実験の平均（N = 3）に示す標準偏差は±。いくつかのケースではエラーバーはSMでありますプロットシンボル以外Allerの。
DNA消化の5最適化を図。トリス-HCl 8に記載のように（A）サケ精巣DNAの80マイクログラムを消化し 、グリシン-酢酸緩衝液（左）またはリン酸ナトリウム緩衝液（右）。アガロースゲル電気泳動（1.0％）は、45分間、150 Vで運転しました。レーン1および8：DNAラダー;レーン2,4、及び6：未消化DNA。レーン3,5、および7：消化DNA;レーン9、11、及び13：未消化DNA（リン酸緩衝液）レーン10、12、及び14：DNA（リン酸緩衝液）を消化し た（B）サケ精巣DNA（80μgの）は50で、各ステップ毎に0.5〜2.5時間、DNアーゼI、PDE I、及びAPと共にインキュベートすることにより本明細書に消化し ました。塩化マグネシウムおよびDFOを含むmMのリン酸緩衝液。消化されたDNAの7.3μgのを含む各サンプルの50マイクロリットルを、HPLC（ すなわち 、0.9 V、および1ml /分で分析したFLOw）はdGuoを検出します。図は、3つの独立した実験の平均を示している（N = 3）平均の標準誤差を±。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
培養細胞（A）中の8-オキソdGuo検出または動物組織（B）は図6クロマトグラム（A）消化DNA A549細胞から、KBrO 3で処理したまたは未処理の（B）消化DNA DBCの脾臓から処置されたマウス。ピークが原因でガードカラムを除去することを左にシフトし（これは装置内の圧力上昇に、それらの位置を基準に確認しました）。標準とサンプルは、同一の実行条件を使用して、同じ日に実行されました1ml /分の流量及び0.5それぞれdGuoと8-オキソdGuo、0.9 Vでの、10mlの注射体積、。クリックしてくださいここで 、パネルAの拡大版のため、 ここではパネルBのために。
生体試料中の図8オキソdGuoの7定量を。ピークは（KBrO 3で処理し、A549細胞からDNAにおける8-オキソdGuoレベルを生成する（詳細については、 補足図2を参照）標準曲線に統合し、比較しましたA）、DBC処置マウス（B）の脾臓からのDNA又は8-オキソdGuoレベル。星印（*）は、統計的有意性を示す（P <0.05分散の一方向分析（ANOVA）（A）、スチューデントのt検定（B））。 3（A）または5（B）の平均値±標準誤差の独立した実験の平均を示します。サンプルは、3日間の治療後4または24時間に採取しました。
| 移動相 | 50.0 mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.2、6％MeOHおよび2.0 mMのKClを含みます |
| 移動相の流速 | 1.0mL /分 |
| 列タイプ | 結合した球状シリカとYMC-BASIC |
| カラム長さ | 15センチメートル |
| カラム内径 | 3.5ミリメートル |
| カラム温度 | 35°C |
| 検出器温度 | 29°C |
| 8-オキソdGuo用電圧設定 | +0.5 V |
| dGuoのための電圧設定 | 0.9 V |
| 注入量 | 10.0ミリリットル |
HPLC-EDによる検出および8-オキソdGuoの定量化のための表1の機器パラメータ。
| ナノモル | 100 nmの標準、μL | HPLC移動相、μL | 希釈、折り |
| 5 | 300 | 0 | 1 |
| 2.5 | 150 | 150 | 2 |
| 1 | 60 | 240 | 5 |
| 0.5 | 30 | 270 | 10 |
| 0.25 | 15 | 285 | 20 |
| 0.1 | 6 | 294 | 50 |
表2. <dGuoの標準曲線の / strong>の準備。
| フェムトモル | 250 nmの標準、μL | HPLC移動相、μL | 希釈、折り |
| 2,500 | 300 | 0 | 1 |
| 千 | 120 | 180 | 2.5 |
| 500 | 150 | 150 | 5 |
| 250 | 150 | 150 | 10 |
| 100 | 120 | 180 | 25 |
| 50 | 150 | 150 | 50 |
表8-オキソdGuoの標準曲線の調製。
燮 電気化学の plementary図1 の比較（EC）とdGuoのUVベースの検出。標準曲線は、電気化学的検出（EC）またはUV検出（260 nm）のことでdGuo検出のために作成されました。ピーク面積は、両方の方法で約4.7分でdGuoピークのために統合されました。 N = 3は、±標準偏差を示していることを意味します。
その標準曲線から補足図dGuoの2定量。dGuoの濃度を決定するための標準曲線の使用例が示されている。（A）のピーク面積は、標準的なソフトウェアを用いて積分することによって決定することができる。（B）この情報は、使用されています試料中の未知の検体濃度を計算するために直線の方程式を使用するために、標準曲線を構築します。52697 / 52697fig9large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
8-オキソdGuoがDNA酸化の有用なバイオマーカーとして報告されているが、その信頼性の定量化は、チャレンジを提起することができます。いくつか公開された方法が存在するが、それらの研究室での方法を展開する研究者を可能にするプロトコルの包括的、説明的な概要が必要とされています。ここでは、8オキソdGuoの検出および定量化のための効果的な方法を確立するために新しいユーザーを可能にするHPLCベースのプロトコルの詳細な概要を提示します。
8-オキソdGuoの定量のために記載されている三つの主要な方法。これらには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、本明細書に記載されるような9の他の場所に記載し、HPLC-EDの方法、クロマトグラフィー/質量分析（MS）法（ 例えば、液体の市販キット19を 、ベース含む。ELISA法は、干渉を受ける可能性が生物学的試料19中の特定の化合物と、一般に、結果がchromatogr用いて得られましたaphic技術は、ELISAに基づく方法20と比較して、8-オキソdGuoの定量化のために、より信頼性の高いと考えられています。 MSベースの方法でHPLC-ED法を比較すると、前者の利点は、比較的安価な装置（MSベースの方法のための装置よりもコストの大きさ、すなわち 、約オーダー）です。前者は、電気活性化合物の潜在的な干渉を受けやすいものではなく、同位体21を使用して明確な定量的測定を提供するようさらに、HPLC-MSは、HPLC-ED法より優れています。
懸念は、8-オキソdGuo定量22に使用されるゲノムDNAを抽出するための従来のフェノール抽出法の使用に関して提起されています。何人かの研究者は、標準的なフェノール抽出に関連した条件はベースラインレベル1,9を増やすしたがって、不要なdGuo酸化を導入することができることに注目しました。この問題は、セルとアニマに対処するために、LゲノムDNAを抽出し、修正されたDNAzolプロトコル22を用いて精製することができます。 DNAzolは、グアニジンチオシアネートを高濃度で含まれており、以前の研究では、9は DNAzolは、従来のフェノールとのNaIベースの抽出法に比べて使用されている下位基礎レベル8-オキソdGuoの形成を指摘しています。鉄キレート化合物DFOは、試料調製中にROS産生およびDNAの酸化を最小限にするために使用されました。上述したように、非ストレスA549細胞における8-オキソdGuoレベル（ 図7A）は、MSベースの方法13により測定されたものと非常に類似していました。これは、MSに基づく方法13について記載した注意事項の取り込みはHPLC-EDによって正確8-オキソdGuoの定量化を達成するために、試料調製及び分析の間に、望ましくないDNA酸化の最小化を可能にすることを示唆しています。 8-オキソdGuoレベルを減少することによってここに見られるように酸化促進処理後の剖検または収穫培養細胞のタイミングは、もう一つの重要な要因となる可能性があり最後の処理（ 図7B）後24時間対4時間で脾臓中。これは、DNA損傷を除去するために塩基除去修復の活性化に起因し得ます。
記載された方法の2明らかな制限があります：（1）DNAのではなく、大量の要件（サンプルあたり約80μgの3つの技術の複製を達成するために）、および共溶出化合物からの（2）潜在的な干渉。これは、他の（ 例えば 、遺伝子発現）のための組織の十分な量を残して、脾臓の非常に小さい（ すなわち 、約15mg）個（全組織重量の約15％）がDNAの80μgのを取得するのに十分であることが判明しました分析します。抽出したDNAの量は、人為的なDNA酸化23,24,25に影響を与えるもう一つの重要なパラメータです。そのため、私たちはここに示唆していることがかなり大きな（〜80ミリグラム/サンプル）での作業は人為的なDNA酸化25を最小化するために> 30 MGを使用して、以前の勧告と一致しています。これは2-3の実行のために十分なものでなければならないため、より小さい組織（ 例えば 、海馬）の場合、1は、20〜30μgのDNAと起動するためのプロトコルを縮小できました。 DNAのより大きな量は、おそらく背景雑音上記ピークの分解能を容易にするであろうが、これは実験的に、潜在的に干渉する物質の存在は、ケースバイケースで対処することができ、そしてそれは常にからDNA試料を含むことが必須である確認されないままでインビトロまたは酸化的DNA損傷を誘導することが知られている陽性対照とのインビボでの治療において同時（ 図7参照）。
リン酸緩衝液中のリン酸塩は、アルカリホスファターゼの活性を低下させることが報告されているが、方法の最適化実験（ 図5）は、リン酸緩衝液を容易に使用できることを確認しました。リン酸緩衝液を移動相中に含まれているので、試料調製におけるその使用は、ゾルに検出器ノイズを低減します混合ベント。したがって、電圧、緩衝液組成、DNA抽出および消化を最適化し、陽性対照を含めました。さらに、これらの変数はさらに、個々の研究室によって最適化する方法を概説が提供されます。私たちの目標は、8オキソdGuoの検出および定量化のためのアッセイの開発を目的とした専門家の研究室のために有用であり得る方法を生成することでした。
しかし、私たちは分析手順の検証のためのヒト用医薬品（ICH）の登録のための技術要件の調和に関する国際会議（ すなわち 、ICH Q2の（が推奨する検証手順の下で概説した方法の正式な検証が必要であることに注意してくださいR1）26）。簡単に言えば、定量的な検証の要素は、アッセイの検討すべきである：スパイク·イン8-オキソdGuo異なる量のサンプルを含むことによって達成することができる1）精度（; EXT両端の2）の範囲と直線性（線形応答終了した被分析物濃度; 3）精度（再現性と再現性）; 4）検出限界は、（一般に、点はれる信号対雑音比が大きいか又は2~3等しく、これは、マトリックスに依存してもよいです）。応答は、いくつかの所定のレベルのような2×コントロールの標準偏差を交わる5）定量限界（濃度は、マトリックスに依存）であってもよいです。 6）選択性/特異性（ニートのソリューションと比較し複雑なサンプル中の分析物を検出する能力）。 7）再現性（異なる事業者と異なる研究室で同じ結果を取得する機能）。および8）堅牢性とシステム適合。 ICHが推奨する、検証の目的は、それが「その意図する目的に適し」であり、多くの研究室は、おそらく、異なる目的を持っていることを実証することであるように、このアッセイの将来のユーザは、必要と認められる範囲で、これを検証する必要があります。 8-オキソdGuoの正確な定量は、毒物学と分子医学の罪で望ましいですCEは、機構的及び実験的に健康への悪影響にリンクされているか、酸化ストレス、より具体的には、DNAの酸化の理解を高めることができます。
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Acknowledgments
この研究は、カナダ保健省ゲノミクス研究開発イニシアティブ（GRDI）とバイオテクノロジーのためのカナダの規制戦略（CRSB）によって資金を供給されました。著者らは、利害の競合を持っていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details. |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E. coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH) |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
References
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