Summary
L'obiettivo di questo protocollo è il rilevamento del marker dell'ossidazione DNA, 8-oxo-7,8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxo-dGuo) mediante HPLC-DE, DNA da cellule o tessuti animali.
Abstract
Lo stress ossidativo è associato con molti processi fisiologici e patologici, nonché metabolismo xenobiotico, porta alla ossidazione di Biomacromolecules, compreso il DNA. Pertanto, la rilevazione efficiente di ossidazione del DNA è importante per una varietà di discipline di ricerca, tra cui la medicina e tossicologia. Un biomarcatore comune di DNA ossidativo danneggiato è di 8-oxo-7,8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxo-dGuo; spesso erroneamente indicato come 8-idrossi-2'-deossiguanosina (8-OH-dGuo o 8 -oxo-dG)). Sono stati descritti diversi protocolli per 8-oxo-dGuo misurazione ad alta pressione cromatografia liquida con rivelazione elettrochimica (HPLC-ED). Tuttavia, questi sono stati applicati principalmente DNA purificato trattati con pro-ossidanti. Inoltre, a causa delle differenze metodologiche tra laboratori, principalmente a causa delle differenze di allestimento di analisi, l'adozione di metodi pubblicati per il rilevamento di 8-oxo-dGuo mediante HPLC-DE richiede un'attenta ottimizzazione da ciascun laboratorio. Laprotocollo, descrivendo un tale processo di ottimizzazione, è carente. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per la rilevazione di 8-oxo-dGuo mediante HPLC-DE, DNA da cellule o tessuti animali. Esso illustra come preparazione del campione di DNA può essere facilmente e rapidamente ottimizzato per minimizzare indesiderabile ossidazione DNA che può verificarsi durante la loro preparazione. Questo protocollo mostra come rilevare 8-oxo-dGuo in cellule coltivate umane adenocarcinoma alveolare (cioè cellule A549) trattati con l'agente ossidante KBrO 3, e dalla milza di topi esposti al dibenzo idrocarburi aromatici policiclici (DEF, p) crisene (DBC, precedentemente noto come dibenzo (a, l) pirene, Dalp). Nel complesso, questo lavoro illustra come un metodo HPLC-ED può essere facilmente ottimizzato per il rilevamento di 8-oxo-dGuo in campioni biologici.
Introduction
Specie reattive dell'ossigeno (ROS), i cui livelli di stato stazionario può aumentare durante molte condizioni patologiche e metabolismo xenotoxic, contribuiscono ad una maggiore frequenza di danno ossidativo al DNA. Tra diverse possibili basi azotate prodotti di ossidazione, danno ossidativo del DNA può essere facilmente misurata utilizzando il marcatore stabile 8-oxo-7,8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxo-dGuo), che è una delle forme ossidate di 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo è il più abbondante lesione DNA 2 e, di conseguenza, è stato studiato per maggiore dettaglio come biomarker di ossidazione DNA nonostante l'esistenza di DNA multiple prodotti di ossidazione 3. Negli esseri umani, questo danno può essere riparato con la base di riparazione per escissione dell'8-oxoguanine glicosilasi 1 (hOGG1) 4. Se lasciato non riparata, 8-oxo-dGuo può contribuire alla formazione di base di mutazioni coppia-di sostituzione (cioè, G a T trasversioni) 4. È importante sottolineare che, a 8-oxo-dGuo è un marcatore consolidata for danni al DNA in relazione alla iniziazione e promozione di carcinogenesi 2. Pertanto, la quantificazione precisa di 8-oxo-dGuo è un biomarker utile e desiderabile di danno ossidativo del DNA 5.
C'è confusione diffusa nella letteratura per quanto riguarda i nomi corretti per i moduli ossidativamente-danneggiati di 2-deossiguanosina e, inoltre, il nome corretto del composto (s) di routine misurato come biomarker di danno ossidativo del DNA 6. I 6,8-dicheto e 6-enolica, 8-cheto forme tautomere di 8-oxo-dGuo (illustrata nella figura 1) sono i due tautomeri più importanti discussi in letteratura 5,7. La forma 6,8-dicheto è la forma più prominente a pH fisiologico di 7,4, ed è il più importante prodotto di ossidazione DNA 7. Pertanto, 8-oxo-dGuo, piuttosto che a 8-idrossi-dGuo è il nome più appropriato per questo prodotto di ossidazione 6. E 'anche importante notare che il 2-deossiguanosina (dGuo), piuttosto che nucleobase guanina (Gua) o guanosina ribonucleosidi (Guo), rispettivamente, viene rilevato dalla maggior parte dei metodi di 6.
La rilevazione accurata e la quantificazione di 8-oxo-dGuo è difficile a causa: i) la variabilità nella digestione del campione di DNA, ii) ossidazione accidentale di dGuo a 8-oxo-dGuo che può verificarsi durante la preparazione del campione, e iii) la necessità per la convalida efficace del metodo HPLC-ED analitica 8. In questo protocollo, abbiamo puntato a raggiungere i) offrendo condizioni favorevoli, per la completa digestione del DNA e ii) da parte del chelante inclusione metallo e soluzioni ferrochelanti trattati e un DNA di isolamento speciale reagente, mentre iii) solo parzialmente affrontati dalla inclusione di controlli positivi e fornendo in tal modo che il metodo è in grado di rilevare 8-oxo-dGuo in campioni biologici. Ulteriore convalida va oltre lo scopo di questo articolo. Tuttavia, siamo fiduciosi che questo protocollo aiuterà il futuroutenti di determinare la misura in cui essi devono convalidare formalmente il protocollo, a seconda dei loro fini. Un elenco di passi necessari per la validazione formale del metodo è fornito ulteriormente. Durante lo sviluppo e la diffusione di un metodo di rilevazione a 8-oxo-dGuo, metodi pubblicati sono stati rivisti e consolidati. Così, questo metodo elimina la necessità di raccogliere informazioni da diverse fonti pubblicati che spesso mancano di importanti dettagli sperimentali fornendo allo stesso tempo mezzi rapidi e semplici di test, se è stato adottato il metodo per l'individuazione e la quantificazione di 8-oxo-dGuo con successo. Questo metodo adatto è stato impiegato con successo per analizzare campioni di DNA da cellule in coltura e tessuti murino. Questo articolo video aiuterà altri gruppi a stabilire un metodo efficace per un rilevamento affidabile e quantificazione di 8-oxo-dGuo mediante HPLC-ED.
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Protocol
Assicurarsi che tutti la zootecnia, l'alloggio, la manipolazione e la sperimentazione rispettare norme e regolamenti locali e che i protocolli di sperimentazione siano approvate prima di iniziare qualsiasi studio. Per gli esperimenti descritti, cura degli animali, la gestione e il trattamento sono stati approvati dal Comitato Animal Care Health Canada. Vedere la "tabella di reagenti" per informazioni dei fornitori.
1. la raccolta di campioni biologici
- Cellule o tessuti animali
- Crescere cellule adenocarcinoma A549 alveolari umani in F12-K multimediale contenente il 10% di siero bovino fetale, 100 Unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina.
- Cellule seme a circa 1 milione di cellule per un piatto di 10 cm. Per ogni esperimento, utilizzare un set di 12 piatti in totale (tre piastre per una replica biologico x quattro dosi) per fornire abbastanza DNA (80 mg) per la digestione enzimatica e analisi HPLC.
- Quando la densità cellulare diventa maggiore di ca.imately 70% della superficie piatto, rimuovere il supporto e lavare le cellule due volte con 4 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4.
- Per le cellule animali in coltura, utilizzare KBrO 3 come controllo positivo.
NOTA: una relazione lineare positiva tra KBrO 3 la concentrazione e la frequenza a 8-oxo-dGuo è stato riportato in letteratura 9. - Sciogliere KBrO 3 in PBS. Assicurarsi che la concentrazione finale nel mezzo di coltura cellulare è superiore a 1 mM per ottenere un aumento statisticamente significativo a 8-oxo-dGuo rispetto alle cellule non-esposte. Aggiungere la stessa concentrazione di KBrO 3 a ciascuna piastra in serie (ad esempio, piastre da 12 a 10 cm).
- Incubare le piastre per 3 ore a 37 ° C. Rimuovere il supporto e lavare una volta con PBS.
- Aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina (concentrazione magazzino 2,5 g / ml) e incubare per 3 minuti a 37 ° C.
- Lavare con 4 ml di PBS, raccogliere le cellule di ogni insieme in un unico polystyr 50 ml conicaene provetta da centrifuga e centrifugare a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere PBS e conservare il pellet cellulare a -80 ° C fino ad ulteriore analisi. Ossidazione DNA artificiale può essere ulteriormente ridotta isolamento nucleare, come descritto altrove 10.
- Tessuti animali
- Dose animali come richiesto. Per questo protocollo, per adulti (9 settimane di età) trattamento negli uomini della Muta mouse mediante sonda gastrica al giorno per tre giorni consecutivi con 20 mg DBC / kg di peso corporeo al giorno disciolto in olio d'oliva.
NOTA: Questo animale transgenico porti ingegnerizzato λ-batteriofago e la mutazione gene reporter lacZ da E. coli 11 è utilizzato per roditori transgenici mutazione analisi 12. - Eseguire necroscopia animale ad esempio, anestetizzato i topi può con isoflurano e quindi eutanasia tramite dislocazione cervicale seguita da apertura cavità toracica. Immediatamente lampeggiare tessuti congelare in azoto liquido. Conservare i tessuti a -80 ° C fino al momento dell'analisi.
NOTA: I tempi dell'eutanasia dopo il trattamento può essere un'altra variabile importante (per esempio, l'ossidazione del DNA è massima a 72 ore dopo l'esposizione al rumore nel cervello di ratto e nel fegato 13).
- Dose animali come richiesto. Per questo protocollo, per adulti (9 settimane di età) trattamento negli uomini della Muta mouse mediante sonda gastrica al giorno per tre giorni consecutivi con 20 mg DBC / kg di peso corporeo al giorno disciolto in olio d'oliva.
2. DNA Extraction, precipitazioni e di lavaggio (per i tessuti procedere direttamente alla 2.2)
- Omogeneizzare le cellule raccolte in un 50 ml conica provetta di polistirene centrifuga con 1 ml di DNA isolare l'agente, come DNAzol. Utilizzare un puntale microlitri 1.000 per disperdere il pellet cellulare fino a quando la soluzione è omogenea. Trasferire omogenato in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Incubare in ghiaccio per 10-20 minuti. Procedere alla 2.3.
- Omogeneizzare 15-20 mg di tessuto in un 1 ml palmare omogeneizzatore vetro antiaderente contenente 500 microlitri agente di isolamento del DNA. Delicatamente sollevare e abbassare omogeneizzatore per circa 1 minuto; tessuti morbidi richiederanno meno tempo. Trattamento delicato assicura meno tosatura del DNA. Conservare il omogenato in ghiaccio per circa 10-20 min.
- Pallinal'omogeneizzato mediante centrifugazione per 10 min a 10.000 xg e 4 ° C in una provetta da 1,5 ml conica.
- Trasferire accuratamente il surnatante risultante in una nuova provetta 1,5 ml facendo attenzione ad evitare di contattare il pellet.
- Precipitare DNA dall'omogeneizzato aggiungendo 0,5 ml di EtOH 100% per 1 ml di omogenato. Invertire tubi 10 volte per garantire l'isolamento reagenti e EtOH sono sufficientemente mescolato.
- A questo punto, precipitato DNA è viscoso, bobina esso su una punta di plastica pipetta (ad esempio, con una capacità massima tenuta di 200 mL) e poi trasferito in un nuovo 1,5 ml provetta conica.
NOTA: centrifugazione rapida può essere impiegato per rimuovere ogni lisato residua dal DNA isolato.
(Wash DNA e solubilizzazione) - Aggiungere 1 ml di 75% EtOH al DNA isolato. Sospendere il pellet di DNA bene capovolgendo le provette 10 volte.
- Decantare con cautela l'etanolo dal tubo. Assicurarsi che the DNA pellet attacca al lato del tubo. Conservare le provette verticalmente per 1-2 min e utilizzare una pipetta per rimuovere qualsiasi eccesso di EtOH dal fondo della provetta.
- Ripetere il DNA lavare una volta di più, e sia conservare il campione in EtOH a -20 ° C (stabile per diversi mesi) o procedere immediatamente alla digestione.
- Sciogliere DNA in tampone di digestione (descritto di seguito) e quindi quantificare con metodi spettroscopici standard (cioè, l'assorbanza a 260 nm utilizzando NanoDrop spettrofotometro).
3. digestione enzimatica
- Preparare "tampone di digestione" combinando volumi adeguati (a seconda del numero di campioni da digerire) di 50 mM Na fosfato monobasico (contenenti KCl 2,0 mM, Desferal 1,0 mM (DFO) e 200 mM MgCl 2) con 50 mM fosfato bibasico Na (contenente anche KCl 2,0 mM, 1,0 DFO mM MgCl e 200 mM 2). Ogni campione richiede 4,0 microlitri monobasici e 17,0 ml di soluzione di fosfato bibasico. <li> Rimuovere ogni residuo EtOH dal fondo dei campioni tubi e aria secca per circa 5 minuti. Assicurarsi che il DNA non si asciughi completamente.
- Sciogliere 80 mg DNA estratto in 21.0 ml di tampone di digestione, aggiungere 1 unità di DNasi I disciolti in 2,0 ml di tampone di digestione.
- Vortex leggermente per ottenere una miscelazione accurata e incubare per 1,5 ore a 37 ° C.
- Alla fine del periodo di incubazione, aggiungere 216,4 ml di soluzione di fosfato bibasico 50 mM Na contenente KCl 2,0 mM, 1,0 mM DFO e MgCl 2 200 mM.
- Preparare "digestione tampone-2", combinando un volume di tampone digestione con nove volumi di bibasico, 50 Na mM fosfato (con mM KCl 2.0, 1.0 DFO e 200 mm MgCl 2).
- Aggiungere 0,025 unità di fosfodiesterasi (PDE) che enzima in 16.3 ml di buffer di 2-digestione. Pipetta su e giù per alcuni secondi, poi vortice leggermente per ottenere una completa miscelazione e incubare per 1,5 ore a 37 ° C.
- Aggiungi 0.4 Unità di fosfatasi alcalina (AP) in 8,0 ml di buffer di 2-digestione. Pipetta su e giù per alcuni secondi, poi vortice leggermente per ottenere una completa miscelazione e incubare per 1,5 ore a 37 ° C. Aggiungere 33,0 ml HPLC grado MeOH.
- Eseguire campioni di DNA digeriti in HPLC, come descritto di seguito, subito o conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso per ridurre al minimo l'ossidazione. Nota: la procedura di digestione 1,5 hr qui suggeriti si basano su tali intervalli suggerito altrove 9 e sui risultati che protocolli simili a raggiungere la completa digestione del DNA 9. Pertanto, si è ipotizzato che il fattore limitante per ottenere la completa digestione era tempo e che l'inibizione enzimatica e disomogeneità del campione erano trascurabili.
4. HPLC Run: Preparazione della fase mobile, il programma di installazione di strumenti e manutenzione
- Usare acqua ultrapura per preparare tutte le soluzioni tampone e trattati con alto legame resina resistenza (ad esempio, Chelex 100: stirene divinylbecopolimero nzene con iminodiacetate ioni che i metalli di transizione chelati con elevata affinità) per ridurre al minimo la contaminazione da metalli e ossidazione DNA durante la preparazione del campione.
- Preparare tampone fosfato 250 mM Na, pH 6,2. Utilizzare un rapporto di 1: 3,6957 di sodio fosfato bibasico (FW = 177.99 g / mol) di fosfato di sodio monobasico (FW = 119.98 g / mol).
Esempio: Pertanto, per una soluzione madre 3 L combinare 70.81 g di monobasico e 28.43 g di polvere dibasico, aggiungere acqua fino ad esempio, 2,8 L e verificare che il pH della soluzione è 6,2. Aggiustare il pH con 250 mM mono o sodio fosfato bibasico, soluzioni preparate separatamente e non con acidi concentrati o basi. Aggiungere 2,24 g di KCl per ottenere una concentrazione di KCl 10 mM. - Preparare fase mobile a tre bottiglie, almeno 1 L ogni, contenente: solvente B - HPLC-grade metanolo, solventi - B acqua ultrapura, e solvente C - tampone fosfato dal punto 4.2. Inserire HPLC tubo di alimentazione fase mobile nelle bottiglie; remainitubi ng devono essere immerse anche in una delle bottiglie (ad esempio, soluzione C) e innescato anche se non sono necessarie per la miscelazione.
- Durante la corsa, mescolare le soluzioni fase mobile 6% Un solvente, 74% B solvente e il 20% di solvente C per ottenere la soluzione finale di 50 mM tampone fosfato di sodio (pH 6,2) con KCl 2,0 mM, e il 6% MeOH.
- Staccare l'elettrodo dal rilevatore elettrochimico, smontarlo e riferimento pulita ed elettrodi di lavoro con le soluzioni di pulizia elettrodo e dischi lucidatura consigliati dal costruttore. Sciacquare le superfici pulite con acqua ultrapura, pulire l'acqua fuori delicatamente e verificare che il rivelatore è asciutta prima di accendere il sistema.
- Riassemblare il rivelatore e collegare l'ingresso fase mobile all'elettrodo. Accendere il flusso e consentire la fase mobile per riempire l'elettrodo prima di collegare il tubo di uscita fase mobile. Installare una nuova colonna prima di iniziare l'ottimizzazione. Assicurarsi che l'installazione è nella direzione corretta e follows raccomandazioni tutto del produttore.
- Accendere la strumentazione HPLC con largo anticipo (ad esempio, 1 ora) delle analisi dei campioni per consentire il raggiungimento dell'equilibrio e per ridurre il rumore della linea di base. Vedere la Tabella 1 per le impostazioni consigliate; il limite di pressione posteriore dovrebbe essere impostato a 3.000 psi per evitare danni alla colonna. Accendere il sistema di degasaggio. Procedere con adescamento delle pompe e la creazione di pendenza solvente.
- Primo secco le pompe in base alle istruzioni del produttore. Eseguire questa bagnare le linee quando una fase mobile è stata sostituita o nell'ingresso tubazione viene esposta all'aria.
- Individuare il disco di adescamento ed inserire una siringa di plastica di 10-15 ml lì. Assicurarsi che la siringa sia completamente inserita prima di aprire la linea. Per aprire le linee semplicemente girare il contatore disco in senso orario per un turno.
- Inizia il primo con la selezione appropriata interfaccia HPLC. Tirare delicatamente la siringa per aspirare il fluido nelle linee. Una volta che il fluido scorre, il primo è completa; consentire al programma difinire la corsa. Ripetere per tutte le linee (in genere quattro, a seconda dello strumento).
- In alternativa, il primo bagnato quando le linee sono già bagnate da un primo asciutto prima (vedi sotto).
NOTA: quando è trascorso una grande quantità di tempo tra gli usi (ad esempio, 2 settimane o più), si raccomanda un primo asciutto. - Modificare la composizione dei componenti solvente fase mobile al 25% ciascuno utilizzando l'interfaccia utente HPLC. Dall'interfaccia, selezionare l'opzione "Funzione diretta", quindi selezionare l'opzione "Wet Prime". Questo adescherà tutte le linee contemporaneamente.
- Assicurarsi che tutta l'aria è fuori dal sistema osservando la linea primaria bagnato mentre entra nel contenitore di rifiuti. Dopo un buon primo, assicurarsi che non bolle sono lasciati nella linea. Se bolle persistono, ripetere adescamento.
- Quando la pompa è adescata, iniziare a muovere la fase mobile HPLC. Utilizzare l'interfaccia HPLC per modificare manualmente la composizione della fase mobile al 6% di metanolo (solvente A) e il 94%acqua (solvente B), e selezionare una velocità di flusso di 0,9 ml / min. Lasciare 5 min per eliminare qualsiasi metanolo dalla fase di pulizia della colonna.
- Dopo 5 min, modificare la composizione al 6% di metanolo (solvente A), 74% di acqua (solvente B), il tampone 20% (solvente C), di aumentare la portata di 1,0 ml / min. Imposta altri parametri come riassunto nella tabella 1, e impostare il limite di contropressione a 3.000 psi per evitare danni alla colonna.
NOTA: Potenziali problemi con l'installazione HPLC sono alla deriva della linea di base, picco dividere e intensità del segnale diminuisce. Questi di solito può essere superate con la pulizia della colonna dopo ogni utilizzo, la pulizia degli elettrodi frequente, e garantire che le soluzioni tampone sono privi di contaminazioni (ad esempio, la presenza di particelle o di crescita microbica). - Eseguire la fase mobile per circa 1-1,5 ore per ottenere un segnale stabile di riferimento.
- Utilizzando l'interfaccia software dello strumento, selezionare i parametri come indicato nella tabella 1 e set gestito il tempo di 15 min. Iniettare il sample. Utilizzare maggiori tempi di esecuzione per campioni complessi (determinare empiricamente osservando la presenza o l'assenza di picchi oltre intervallo di 15 min).
NOTA: Il software Instrument consente la programmazione delle condizioni di esecuzione del campione e configurazione per autosampling. - Dopo l'esecuzione sono state completate, spegnere la cella del rivelatore utilizzando l'interfaccia del rivelatore. E 'importante seguire le raccomandazioni del produttore per quanto riguarda spegnere il rilevatore come uso improprio e di arresto può danneggiare lo strumento. NON spegnere la cella passando retro del rivelatore, che possono danneggiare lo strumento.
- Modificare manualmente la composizione della fase mobile al 6% di metanolo e 94% di acqua. Eseguire per 5 min.
- Ridurre manualmente la portata di 0,7 ml / min, immediatamente cambiare la composizione al 50% MeOH e 50% di acqua. Run per almeno 20 minuti. La mancata eseguire questo passaggio per il tempo indicato potrebbe causare danni alla colonna e il rivelatore. Chiudere il flusso, und quindi spegnere il sistema di degasaggio.
5. Preparazione di norme
- Preparare tampone fase mobile come indicato dal passo 4,1-4,3 sopra. È importante utilizzare la fase mobile HPLC per la preparazione di standard per evitare picchi risultanti dalla miscelazione di soluzioni differenti dopo l'iniezione del campione.
- Diluire la soluzione uno su cinque con acqua ultrapura prima dell'uso, e la soluzione finale deve contenere il 6% MeOH.
- dGuo standard
NOTA: Elevato potenziale di ossidazione necessari per il rilevamento dGuo può aumentare il rischio di misurare interferire composti elettroattivi. Questo si può verificare, ad esempio, una curva standard di rilevamento UV di dGuo a 260 nm e confrontandola con la curva standard creato con rilevazione CE. Se entrambi allineare bene (ad esempio, la figura complementare 1) e gli effetti di matrice del campione sono state prese in considerazione, si può procedere con la rilevazione dGuo da UV a 260 nm, piuttosto che la rilevazione CE.- Vortex ad alta velocità fino dGuo scioglie completamente. Questo è il titolo principale; conservare a -20 ° C per diverse settimane.
- Per creare il dGuo azione secondaria (0,5 mm), diluire 143 ml di dGuo primario azionario in 857 ml di Fase mobile per HPLC. Conservare in ghiaccio fino al momento dell'uso e preparare quotidiano fresco.
- Fare diluizioni per creare una curva standard (ad esempio, Tabella 2). Solutions Store su ghiaccio e preparare fresco ogni giorno. Standard Eseguire in serie con i campioni sperimentali.
- Prima di eseguire, variare la tensione detector utilizza la più alta concentrazione dello stock di trovare la tensione ottimale.
- 8-oxo-dGuo standard
- Misurare 1,0 mg di 8-oxo-dGuo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere grado MeOH 0,1 ml HPLC. Vortex sull'alta velocità fino a 8-oxo-dGuo dissolve completamente. Questo è il magazzino principale di 8-oxo-dGuo. Conservare a -20 ° C per sevsettimane rale.
- In un tubo, unire 2,9 ml di brodo primario e 997,1 ml di HPLC tampone fase mobile, vortice. Questo è il titolo secondario (10.000 Nm).
- Per creare una soluzione di lavoro per la curva standard (250 nm), unire 24.4 ml di brodo secondaria e 975,6 ml di buffer di fase mobile.
- Eseguire ulteriori diluizioni per fornire le soluzioni necessarie per creare una curva standard (ad esempio, Tabella 3). Solutions Store su ghiaccio e preparare fresco ogni giorno. Norme Corri con i campioni sperimentali.
- Quantificazione
- Integrare l'area sotto la curva sia 8-oxo-dGuo e dGuo utilizzando software standard (come una parte di interfaccia HPLC-macchina; vedere complementare Figura 2A).
- Creare la curva standard (concentrazione nota di ogni analita vs. area sotto la curva (complementare Figura 2B). Usando l'equazione della curva standard, calcolare il rapporto per 8-oxo-dGuo / dGuo per ogni campione.
6. Gel di Agarosio
NOTA: elettroforesi su gel di agarosio può essere eseguito per verificare la completezza della digestione DNA.
- Preparare 50x Tris-acetato-EDTA (TAE) Buffer, sciogliendo 242 g Tris base (FW = 121,14) in 750 ml di acqua ultrapura. Aggiungere 57,1 ml di acido acetico glaciale e 100 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0; EDTA sciogliere completamente quando il pH della soluzione viene regolato a 8,0 con ad esempio, NaOH) e aggiungere acqua ultrapura ad un volume finale di 1 L. Conservare a RT, diluire questa soluzione 50x prima dell'uso.
- Pesare 1 g di agarosio e scioglierlo in 100 ml di tampone 1x TAE, riscaldamento nel forno a microonde per 1-2 minuti. Indossare occhiali e dispositivi di protezione per evitare il contatto con agarosio bollente.
- Raffreddare la soluzione verso il basso fino a circa 50 ° C, aggiungere 5 ml di etidio bromuro (attenzione: mutageno) e versarlo nel agarosio dell'apparato gel esecuzione. Inserire il pettine.
- Attendere che si solidifica soluzione, versare tampone TAE sopra il gel e caricare i campioni (volume dipende dalle dimensioni pettine, in genere, viene caricata 10-20 ml di campione di DNA, mescolato con 6x tintura in esecuzione per visualizzare e facilitare carico).
- Eseguire il gel finché il colorante migra circa 2/3 della lunghezza del gel (ad esempio, 45 min a 150 V). Visualizzare le bande di DNA sotto la luce UV.
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Representative Results
dGuo stato osservato per avere un tempo di ritenzione di 4,7 min, mentre 8-oxo-dGuo aveva un tempo di ritenzione di circa 6,4 min (Figura 2A e B). Vi è circa 1.000 volte differenza nelle altezze tra i due analiti, come si vede nella Figura 2C. Voltammograms per 8-oxo-dGuo e dGuo stati ottenuti per gli standard che funzionano a potenziale lavorativo nell'intervallo 0,2-1,1 V. Il potenziale di lavoro ottimale per 8-oxo-dGuo è risultata di +0,5 V e +0,9 V per dGuo (Figura 3). Questi potenziali sono in accordo con altri elettrodi di carbonio vetroso descritti in letteratura 14,15. Il limite di rilevazione e la gamma dinamica di 8-oxo-dGuo e dGuo rivelazione elettrochimica è segnalato per essere nel range femtomole e nanomole rispettivamente 8,9. Le curve standard per dGuo e 8-oxo-dGuo devono essere eseguiti quotidianamente per garantire il rilevamento lineare attraverso un range di concentrazione adeguata e corretta eseguirezione dello strumento (Figura 4). Le curve standard sono costruite tracciando l'area del picco in funzione della concentrazione dell'analita nota (Figura integrativa 2) che permette di calcolare la concentrazione dell'analita nel campione dall'equazione generata dalle curve standard.
È richiesta completa digestione del DNA per misurazioni accurate di frequenza a 8-oxo-Dgua e diversi metodi di digestione del DNA genomico sono state suggerite 8,15,16. Se necessario, l'efficacia di estrazione del DNA e la digestione può essere verificata mediante elettroforesi in gel di agarosio (Figura 5A) e HPLC-ED (Figura 5B). Lanes con evidente striscio DNA nella Figura 5A (ad esempio, corsie 2, 4, 6, 9, 11, e 13) indicano la presenza di DNA non digerito, mentre campioni con frammenti di DNA digeriti scappare il gel ed erano quindi inosservato. L'altopiano di Figura 5B indica che ulteriori incubatisu DNA con enzimi digestivi oltre 1,5 ore non determina una maggiore quantità di dGuo rilevato, suggerendo quasi completa digestione dopo 1,5 ore. Inoltre, sia elettroforesi su gel di agarosio e HPLC-ED sono stati usati per testare l'utilità del buffer di digestione del DNA a base di fosfato impiegato qui. Questo tampone è ben abbinato alla fase mobile HPLC e non dà luogo a indesiderati rumore del rivelatore attribuibile alla miscelazione di soluzioni differenti (dati non mostrati). Pertanto, il passaggio dal buffer suggerito in letteratura (ad esempio, Tris-HCl 8) al tampone di fosfato di sodio è raccomandato per questo protocollo (sinistra contro lato destro della Figura 5A). Si prega di notare che le ipotesi di base per l'ottimizzazione della digestione DNA erano che l'inibizione dell'enzima e campione disomogeneità erano trascurabili e tempo di digestione era l'unico fattore limitante, come sopra indicato. Una possibilità che la digestione del DNA incompleta provocato frammenti che sono troppo piccole per essere deteCTED sui resti di gel agarosio. Anche se un tale errore sistematico interesserebbe tutti i campioni allo stesso modo, ulteriori esperimenti (ad esempio, il trattamento delle cellule in coltura con radiomarcato pro-ossidante 10) potrebbero essere condotte per escludere del tutto tale possibilità.
A differenza di soluzioni standard, il DNA digerito, sia da cellule isolate o tessuti di topo, ha prodotto diversi picchi aggiuntivi (Figura 6a e 6b). Questi erano distanti dai picchi 8-oxo-dGuo e dGuo, ma esperimenti di arricchimento come una parte di esercizi di convalida descritte nella discussione sono necessari per valutare se i picchi addizionali (cioè, campione impurità dovuta agli effetti della matrice, per esempio) interferiscono con quantificazione . Il dGuo-8-oxo picco è stato confermato dalla corrispondenza del tempo di ritenzione con lo standard; ed inoltre, aumento del 8-oxo-dGuo picco per campioni di cellule o animali sottoposti a trattamento pro-ossidante (Figura 7). Pro-ossidante KBrO 3 partecipa a un elettrone astrazione dalla guanina che conduce a 8-oxo-dGuo formazione 17. È da notare che, in assenza di stress pro-ossidante, 2,4 molecole di 8-oxo-dGuo per 10 7 dGuo sono stati rilevati in cellule A549 (Figura 7A). Questo è paragonabile a 4,5 molecole di 8-oxo-dGuo / 10 7 dGuo rilevati nelle cellule A549 osservate con una alternativa, approccio basato spettrometria di massa progettato per affrontare eventuali lacune del metodo HPLC-ED 9. Trattamento DBC (cioè, ogni giorno 20,0 mg DBC / kg di peso corporeo al giorno per tre giorni) ha aumentato i livelli-dGuo 8-oxo in topo milza DNA. Questo è anche un risultato atteso, poiché ROS è noto per essere prodotte durante il metabolismo di idrocarburi aromatici policiclici in vivo 8. I livelli relativi di 8-oxo-dGuo nella milza di animali atono erano 8,3-9,4 8-oxo-dGuo / 10 6 dGuo (Figura 7B), che è in eccellenti ad act con valori pubblicati di quattro molecole 8-oxo-dG / 10 6 dGuo misurati in cellule spleniche murine in condizioni standard per HPLC-ED 18. Le figure 6 e 7 mostrano che i livelli di 8-oxo-dGuo sopra la linea di base sono molto piccole . Così se il DNA viene ossidato a livelli più bassi di quelli osservati qui, i livelli di 8-oxo-dGuo possono essere indistinguibile dal basale, che deve essere tenuto presente dagli utenti potenziali protocollo.
Figura 1. Struttura di 8-oxo-dGuo e il suo tautomero 8-OH-dGuo. Si noti che l'8-oxo-dGuo invece di 8-OH-dGuo è la principale tautomero a pH 7,4.
Figura 2. I tempi di ritenzione per dGuo (A) e 8-oxo-dGuo (B). HPLC-ED cromatogrammi sono stati ottenuti da una iniezione di 10,0 ml di una dGuo, (1,0 nmol totale) o 8-oxo-dGuo (1.000 fmol totale) e rilevati in 0,9 V (A) o 0,5 V (B). Il picco di ritenzione per dGuo era circa 4,7 min (A) e che per 8-oxo-dGuo era approssimativamente 6,4 min (B). L'ampio picco a 2-3 min è probabilmente causato da disturbi di iniezione e non è influenzato (cioè, sempre presente in intensità simile) e la concentrazione di 8-oxo dGuo. (C) cromatogrammi sovrapposti da due iniezioni separate descritti in (A) e (B) rilevata da UV (260 nm). Gli standard sono stati eseguiti nello stesso giorno con le condizioni di esecuzione identiche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. tensione rivelatore Ottimizzazione. (A) voltammogramma di dGuo (concentrazione finale 1 nmol) rilevata mediante analisi HPLC-DE in un intervallo di 0,7-1,1 V. (B) voltammogramma di 8-oxo-dGuo (concentrazione finale 500 fmol) rilevata mediante analisi HPLC-ED in un intervallo di 0,3-0,7 V. Mezzi di tre esperimenti indipendenti (N = 3) ± deviazione standard mostrato. In alcuni casi le barre di errore sono inferiori ai simboli stampa.
Figura 4. curva standard per dGuo (A) e 8-oxo-dGuo (B). Dieci microlitri di entrambi dGuo o 8-oxo-dGuo stato iniettato e misurate mediante HPLC-ED a 0.9 V (A) o 0,6 V (B ). Mezzi di tre esperimenti indipendenti (N = 3) ± deviazione standard mostrato. In alcuni casi le barre di errore sono smaller che i simboli complotto.
Figura 5. Ottimizzazione della digestione del DNA. (A) Ottanta microgrammo di testicoli salmone DNA è stato digerito come descritto 8 in Tris-HCl, tampone glicina-acetato (sinistra) o tampone fosfato di sodio (destra). Elettroforesi su gel di agarosio (1,0%) è stato eseguito a 150 V per 45 min. Corsia 1 e 8: scala di DNA; corsie 2, 4, e 6: il DNA non digerito; corsie 3, 5, e 7: DNA digerito; corsie 9, 11 e 13: DNA digerito (tampone fosfato); Lanes 10, 12 e 14:. digerito DNA (tampone fosfato) (B) testicoli Salmon DNA (80 mg) è stato digerito qui incubando con DNasi I, PDE io, e AP per 0,5-2,5 ore per ogni passo, in 50 tampone fosfato mM contenente cloruro di magnesio e DFO. Cinquanta microlitri di ciascun campione, contenente 7,3 mg di DNA digerito, è stato analizzato mediante HPLC (cioè 0,9 V e 1 ml / min flow) per rilevare dGuo. La figura mostra attraverso tre esperimenti indipendenti (n = 3) ± errore standard della media. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. cromatogrammi per 8-oxo-dGuo rilevamento in cellule in coltura (A) o tessuto animale (B). (A) Digerito DNA dalle cellule A549, trattate o non trattate con KBrO 3. (B) DNA digerito dalla milza di DBC topi -treated. Picchi spostati verso sinistra a causa della rimozione della colonna di guardia (a causa di accumulo di pressione nel dispositivo, la loro posizione è stata confermata con standard). Norme e campioni sono stati analizzati lo stesso giorno con condizioni di esecuzione identicis e 10 ml di iniezione volumi, a velocità di flusso 1 ml / min e 0,5 e 0,9 V per dGuo e 8-oxo-dGuo rispettivamente. Cliccate qui per una versione più grande del pannello A, qui per il pannello B.
Figura 7. La quantificazione di 8-oxo-dGuo in campioni biologici. Peaks sono stati integrati e confrontati con curve standard (vedi Figura integrativa 2 per maggiori dettagli) per produrre i livelli di 8-oxo-dGuo nel DNA dalle cellule A549, trattate con KBrO 3 ( A), livelli o 8-oxo-dGuo nel DNA dalla milza di topi trattati DBC (B). Stelle (*) indicano significatività statistica (p <0.05, Analisi a senso unico della varianza (ANOVA) (A), test t (B)). Mezzi di tre (A) o cinque (B) esperimenti indipendenti ± errore standard della media sono mostrati. I campioni sono stati raccolti 4 o 24 ore dopo il trattamento di 3 giorni.
| Fase mobile | Tampone fosfato Na 50,0 mM, pH 6,2, contenente il 6% MeOH e KCl 2,0 mM |
| Portata Fase mobile | 1,0 ml / min |
| Tipo di colonna | YMC-BASIC con legante silice sferica |
| Lunghezza Colonna | 15 centimetri |
| Diametro interno della colonna | 3,5 millimetri |
| Temperatura della colonna | 35 ° C |
| Temperatura Detector | 29 ° C |
| Impostazione della tensione per l'8-oxo-dGuo | +0,5 V |
| Impostazione della tensione per dGuo | +0,9 V |
| Volume di iniezione | 10,0 ml |
Tabella 1. Parametri di strumenti per il rilevamento e la quantificazione di 8-oxo-dGuo mediante HPLC-ED.
| mmoli | 100 di serie nM, ul | Fase mobile per HPLC, ul | Diluizione, piega |
| 5 | 300 | 0 | 1 |
| 2.5 | 150 | 150 | 2 |
| 1 | 60 | 240 | 5 |
| 0.5 | 30 | 270 | 10 |
| 0.25 | 15 | 285 | 20 |
| 0.1 | 6 | 294 | 50 |
Tabella 2. </ Strong> Preparazione della curva standard per dGuo.
| fmoles | 250 di serie nM, ul | Fase mobile per HPLC, ul | Diluizione, piega |
| 2.500 | 300 | 0 | 1 |
| 1.000 | 120 | 180 | 2.5 |
| 500 | 150 | 150 | 5 |
| 250 | 150 | 150 | 10 |
| 100 | 120 | 180 | 25 |
| 50 | 150 | 150 | 50 |
Tabella 3. Preparazione della curva standard per 8-oxo-dGuo.
Cenare complementare Figura 1. Confronto di elettrochimica (CE) e la rilevazione a base di raggi UV di dGuo. Curva standard è stato creato per dGuo il rilevamento da parte di rilevamento elettrochimica (CE) o il rilevamento UV (260 nm). Aree di picco sono state integrate per dGuo picco a circa 4,7 minuti con entrambi i metodi. N = 3, significa ± deviazione standard sono mostrati.
Figura complementare 2. Quantificazione di dGuo dalla curva standard. Un esempio dell'uso di curva standard per determinare è indicata la concentrazione di dGuo. (A) dell'area di picco può essere determinata mediante integrazione con software standard. (B) viene utilizzato Questa informazione per costruire una curva standard per utilizzare l'equazione della linea per calcolare la concentrazione dell'analita nel campione sconosciuto.52697 / 52697fig9large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Anche se a 8-oxo-dGuo 'stato segnalato come un utile biomarcatore di ossidazione del DNA, la sua quantificazione affidabile può rappresentare una sfida. Anche se esistono diversi metodi pubblicati, vi è la necessità di un approccio globale, panoramica descrittiva di protocollo per consentire ai ricercatori di implementare il metodo nei loro laboratori. Qui vi presentiamo una panoramica dettagliata di un protocollo basato su HPLC che permetterà ai nuovi utenti di stabilire un metodo efficace per il rilevamento a 8-oxo-dGuo e la quantificazione.
Tre principali metodi che sono stati descritti per la quantificazione di 8-oxo-dGuo. Questi includono immunoenzimatico (ELISA) a base di kit commerciali 19, cromatografia liquida spettrometria / massa (MS) metodi (ad esempio, come descritto altrove 9 e metodi HPLC-ED, come quello qui descritti. Metodi ELISA possono soffrire di disturbi con alcuni composti in campioni biologici 19. In generale, i risultati ottenuti utilizzando Chromatogrtecniche aphic sono considerati più affidabile per 8-oxo-dGuo quantificazione in confronto con metodi ELISA-20. Confrontando i metodi HPLC-DE con i metodi basati su MS, il vantaggio del primo è relativamente poco costosa apparecchiatura (cioè, circa un ordine di grandezza meno costosa apparecchiatura per i metodi basati-MS). Inoltre, HPLC-MS sono superiori ai metodi HPLC-ED quanto le prime non sono inclini a potenziali interferenze con composti elettroattivi e fornire misurazioni quantitative, non ambigue ed isotopi 21.
Sono state sollevate preoccupazioni riguardo l'uso di metodi di estrazione fenolo tradizionali per l'estrazione di DNA genomico da utilizzare per 8-oxo-dGuo quantificazione 22. Diversi ricercatori hanno notato che le condizioni associate con l'estrazione con fenolo norma possono introdurre indesiderati dGuo ossidazione, aumentando così i livelli di base 1,9. Per risolvere questo problema, cellulare e animal DNA genomico può essere estratto e purificato usando un protocollo DNAzol modificata 22. DNAzol contiene alte concentrazioni di guanidina tiocianato, e studi precedenti 9 hanno notato più basso livello di base a 8-oxo-dGuo formazione quando DNAzol viene utilizzato rispetto al fenolo tradizionali e metodi di estrazione basati NaI. Il composto chelante del ferro deferoxamina è stato utilizzato per ridurre al minimo la produzione di ROS e l'ossidazione del DNA durante la preparazione del campione. Come indicato in precedenza, i livelli di 8-oxo-dGuo nelle cellule A549 atone (Figura 7A) sono stati molto simili a ciò che è stato misurato mediante un metodo basato su MS 13. Questo suggerisce che l'incorporazione di precauzioni descritte per i metodi basati su MS 13 consentito minimizzazione indesiderabile ossidazione DNA durante la preparazione e l'analisi del campione per ottenere accurata quantificazione 8-oxo-dGuo mediante HPLC-ED. Tempistica delle cellule di coltura della necroscopia o di raccolta dopo il trattamento pro-ossidante può essere un altro fattore importante, come si vede qui in calo di 8-oxo-dGuo livellinella milza a 24 ore contro 4 ore dopo l'ultimo trattamento (Figura 7B). Ciò può essere dovuto all'attivazione della riparazione escissione base per eliminare i danni DNA.
I due ovvie limitazioni del metodo descritto sono: (1) la necessità di quantità relativamente grandi di DNA (circa 80 g per campione per ottenere tre repliche tecnici), e (2) il potenziale interferenza da composti co-eluizione. Si è riscontrato che solo una piccola (cioè, circa 15 mg) pezzo di milza (circa il 15% del peso totale del tessuto) era sufficiente per ottenere 80 mg di DNA, lasciando una quantità sufficiente di tessuto per altri (ad esempio, l'espressione genica) analisi. La quantità di DNA estratto è un altro parametro importante che influenza l'ossidazione del DNA artefatta 23,24,25. Pertanto, in collaborazione con piuttosto grande (~ 80 mg / campione), che vi proponiamo qui è coerente con le precedenti raccomandazioni di usare> 30 mg per ridurre al minimo artefatta ossidazione del DNA 25.Per i tessuti più piccoli (ad esempio, l'ippocampo), si potrebbe ridurre la portata del protocollo di iniziare con 20-30 mg di DNA, in quanto questo dovrebbe essere sufficiente per 2-3 corse. Grandi quantità di DNA presumibilmente facilitano la risoluzione dei picchi sopra il rumore di fondo, ma questo resta da essere verificata sperimentalmente la presenza di sostanze potenzialmente interferenti può essere affrontato caso per caso, ed è essenziale includere sempre campione di DNA da simultanea in vitro o in vivo trattamenti con un controllo positivo che è nota causare danno ossidativo del DNA (vedi Figura 7).
Sebbene il fosfato nel tamponi fosfato è stato segnalato per ridurre l'attività di fosfatasi alcalina, esperimenti di ottimizzazione metodo (Figura 5) ha confermato tampone fosfato potrebbe agevolmente utilizzabile. Poiché tampone fosfato è contenuto nella fase mobile, il suo uso nella preparazione dei campioni ridotto rumore rivelatore dovuta a solvent miscelazione. , La composizione del buffer, l'estrazione del DNA Così la tensione e la digestione sono stati ottimizzati e sono stati inclusi controlli positivi. Inoltre, è prevista una sintesi che illustra come queste variabili possono essere ulteriormente ottimizzati dai singoli laboratori. Il nostro obiettivo era quello di produrre un metodo che potrebbe essere utile per i laboratori specializzati volti a sviluppare un test per il rilevamento a 8-oxo-dGuo e la quantificazione.
Tuttavia, notiamo che è necessaria la convalida formale del metodo, come descritto sotto i gradini convalide raccomandate dalla Conferenza internazionale sull'armonizzazione dei requisiti tecnici per la registrazione dei prodotti farmaceutici per uso umano (ICH) per la validazione delle procedure analitiche (ad esempio, ICH Q2 ( R1) 26). In breve, gli elementi di validazione quantitativa dovrebbero esaminare il dosaggio: 1) la precisione (che può essere compiuto includendo campioni con diverse quantità di 8-oxo-dGuo spillo-in; 2) gamma e linearità (risposta lineare attraverso extconcentrazione dell'analita ended; 3) la precisione (ripetibilità e riproducibilità); 4) limite di rilevazione (generalmente, il punto in cui il rapporto segnale-rumore è maggiore o uguale 2-3; questo può essere matrice-dipendente); 5) limite di quantificazione (concentrazione alla quale la risposta soddisfa alcuni livelli predeterminati come 2 x deviazione standard di controllo; può essere matrice-dipendente); 6) selettività / specificità (capacità di rilevare il analizzare nei campioni complessi rispetto a soluzioni pulite); 7) riproducibilità (la possibilità di ottenere lo stesso risultato in diversi laboratori con diversi operatori); e 8) robustezza e sistema di idoneità. Poiché lo scopo della convalida raccomandato dal ICH è quello di dimostrare che è "adatto per gli scopi previsti" e molti laboratori probabilmente avrà scopi diversi, i potenziali utenti di questo test dovrebbero convalidare questo nella misura ritenuta necessaria. Quantificazione accurata di 8-oxo-dGuo è auspicabile in tossicologia e medicina molecolare del peccatoCe può aumentare la comprensione dello stress ossidativo come, e più in particolare l'ossidazione del DNA, è meccanicamente ed empiricamente legata a effetti negativi sulla salute.
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Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dal Canada Genomics di Ricerca e Sviluppo Health Initiative (GRDI) e la strategia di regolamentazione canadese per la biotecnologia (CRSB). Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details. |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E. coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH) |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
References
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