Summary
Le but de ce protocole est la détection du marqueur de l'oxydation de l'ADN, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo) par CLHP-DE, en ADN à partir de cellules en culture ou des tissus animaux.
Abstract
Le stress oxydatif est associé à de nombreux processus physiologiques et pathologiques, ainsi que le métabolisme des xénobiotiques, conduisant à l'oxydation des macromolécules biologiques, y compris l'ADN. Par conséquent, la détection efficace de l'oxydation de l'ADN est important pour une variété de disciplines de recherche, y compris la médecine et de la toxicologie. Un biomarqueur commun par oxydation de l'ADN endommagé est le 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo; souvent appelée à tort comme 8-hydroxy-2'-désoxyguanosine (8-OH-dGuo ou 8 oxo-dG)). Plusieurs protocoles de mesure 8-oxo-dGuo par chromatographie liquide à haute pression avec détection électrochimique (HPLC-ED) ont été décrites. Toutefois, ceux-ci ont été principalement appliquées à l'ADN purifié traité avec pro-oxydants. En outre, en raison de différences méthodologiques entre les laboratoires, principalement en raison de différences dans l'équipement analytique, l'adoption de méthodes publiées pour la détection de la 8-oxo-dGuo par HPLC-ED nécessite une optimisation soignée par chaque laboratoire. UNprotocole complet, décrivant un tel processus d'optimisation, est absente. Ici, un protocole détaillé est décrit pour la détection de 8-oxo-dGuo par HPLC-DE, en ADN à partir de cellules en culture ou des tissus animaux. Elle illustre comment la préparation d'échantillons d'ADN peut être facilement et rapidement optimisée pour minimiser l'oxydation indésirable de l'ADN qui peut se produire au cours de la préparation des échantillons. Ce protocole montre comment détecter 8-oxo-dGuo dans des cellules humaines en culture d'adénocarcinome alvéolaire (par exemple, des cellules A549) traités avec l'agent oxydant KBrO 3, et à partir de la rate des souris exposées à la dibenzo d'hydrocarbure aromatique polycyclique (DEF, p) chrysène (DBC, anciennement connu sous le dibenzo (a, l) pyrène, Dalp). Dans l'ensemble, ce travail illustre comment une méthode HPLC-ED peut être facilement optimisée pour la détection de la 8-oxo-dGuo dans des échantillons biologiques.
Introduction
Espèces réactives de l'oxygène (ROS), dont les niveaux de l'état d'équilibre peut augmenter pendant de nombreuses conditions pathologiques et le métabolisme xenotoxic, contribuent à une augmentation de la fréquence des dommages oxydatifs à l'ADN. Parmi plusieurs produits d'oxydation possibles de nucléobases, des dommages oxydatifs de l'ADN peut être facilement mesurée en utilisant le marqueur stable 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo), qui est l'une des formes oxydées de 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo ADN est le plus abondant lésion 2 et, par conséquent, a été étudiée de façon plus détaillée en tant que biomarqueur de l'oxydation de l'ADN malgré l'existence de produits d'oxydation de l'ADN multiple 3. Chez l'homme, ces dommages peuvent être réparé via la base réparation par excision de 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4. Si laissé non réparés, 8-oxo-dGuo peut contribuer à la formation de base de mutations paire de substitution (ie, G à T transversions) 4. Fait important, la 8-oxo-dGuo est un marqueur établi for dommages à l'ADN par rapport à l'initiation et à la promotion de la cancérogenèse 2. Par conséquent, la quantification précise de la 8-oxo-dGuo est un biomarqueur utile et souhaitable de dommages oxydatifs de l'ADN 5.
Il ya une grande confusion dans la littérature concernant les noms corrects pour les formes oxydante endommagées de 2-désoxyguanosine et, d'ailleurs, le nom correct du composé (s) régulièrement mesurés en tant que biomarqueur de lésions oxydatives de l'ADN 6. Les 8-céto-6,8-dicéto-énol et 6, les formes tautomères des 8-oxo-dGuo (représenté sur la figure 1) sont les deux plus importants tautomères décrits dans la littérature 5,7. La forme 6,8-dicéto est la forme la plus importante au pH physiologique de 7,4, et est le produit d'oxydation de l'ADN le plus important 7. Par conséquent, 8-oxo-dGuo, plutôt que 8-hydroxy-dGuo est le nom le plus approprié pour ce produit d'oxydation 6. Il est également important de noter que le 2-désoxyguanosine (dGuo), plutôt que nucleobase guanine (GUA) ribonucléoside ou guanosine (Guo), respectivement, sont détectés par la plupart des méthodes 6.
Détection précise et la quantification de 8-oxo-dGuo est difficile en raison de: i) la variabilité dans la digestion de l'échantillon d'ADN, ii) l'oxydation accidentelle de dGuo à 8-oxo-dGuo qui peut se produire lors de la préparation de l'échantillon, et iii) la nécessité pour la validation effective de la méthode HPLC-ED analytique 8. Dans ce protocole, nous avons cherché à obtenir i) en fournissant des conditions, favorables à la digestion complète de l'ADN et ii) par le chélateur inclusion de métal et des solutions de chélateur-traitée et un réactif d'ADN isolation spéciale, tandis que iii) n'a été que partiellement abordées par l'inclusion de Des témoins positifs et fournissent ainsi que la méthode est capable de détecter des 8-oxo-dGuo dans des échantillons biologiques. En outre la validation est au-delà de la portée de ce document. Cependant, nous sommes convaincus que ce protocole aidera la prospectiveles utilisateurs à déterminer la mesure dans laquelle ils ont besoin de valider formellement le protocole, en fonction de leurs besoins. Une liste des étapes nécessaires à la validation formelle de la méthode est fournie plus loin. Pendant le développement et le déploiement d'une méthode de détection 8-oxo-dGuo, méthodes publiées ont été revues et consolidées. Ainsi, cette méthode élimine le besoin de recueillir des informations de plusieurs sources publiées qui manquent souvent d'importants détails expérimentaux tout en fournissant également des moyens rapides et simples de tester si la méthode pour la détection et la quantification de 8-oxo-dGuo a été adoptée avec succès. Ce procédé a été adapté avec succès utilisé pour analyser des échantillons d'ADN à partir de cellules en culture et le tissu murin. Cet article vidéo aidera les autres groupes à établir une méthode efficace pour la détection et la quantification fiable de 8-oxo-dGuo par HPLC-ED.
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Protocol
Veiller à ce que tous l'élevage, le logement, la manipulation et l'expérimentation respecter les règles et réglementations locales et que les protocoles d'expérimentation sont approuvés avant le début de toute étude. Pour les expériences décrites, soins aux animaux, la manipulation et le traitement ont été approuvés par le Comité de protection des animaux Santé Canada. Voir la "table des réactifs" pour l'information des fournisseurs.
1. Prélèvement d'échantillons biologiques
- Cellules ou tissus animaux
- Cultiver des cellules d'adénocarcinome A549 alvéolaires humains dans un milieu F12-K contenant 10% de sérum bovin fœtal, 100 unités / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine.
- cellules de semences à environ 1 million de cellules par une plaque de 10 cm. Pour chaque expérience, utiliser un ensemble de 12 plaques au total (trois plaques par une répétition biologique x quatre doses) pour fournir suffisamment d'ADN (80 pg) pour la digestion enzymatique et l'analyse HPLC.
- Lorsque la densité des cellules devient supérieure à envron 70% de la superficie de la surface de la plaque, retirer médias et laver les cellules deux fois avec 4 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4.
- Pour les cellules animales cultivées, utiliser KBrO 3 comme un contrôle positif.
REMARQUE: Une relation linéaire positive entre KBrO 3 concentration et la fréquence 8-oxo-dGuo a été rapporté dans la littérature 9. - Dissoudre KBrO 3 dans du PBS. Assurez-vous que la concentration finale dans le milieu de culture cellulaire est supérieure à 1 mM pour obtenir une augmentation statistiquement significative de 8-oxo-dGuo par rapport aux cellules exposées à l'ONU. Ajouter la même concentration de KBrO 3 de chaque plaque de la série (par exemple, des plaques à 12 10 cm).
- Incuber les plaques pendant 3 heures à 37 ° C. Retirez les médias et laver une fois avec du PBS.
- Ajouter 1 ml de solution de trypsine (concentration des stocks de 2,5 g / ml) et incuber pendant 3 min à 37 ° C.
- Laver avec 4 ml de PBS, recueillir les cellules de chaque ensemble dans un seul polystyr conique de 50 mlle tube ène de centrifugeuse et centrifuger à 1000 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Retirer du PBS et stocker le culot cellulaire à -80 ° C jusqu'à analyse ultérieure. Oxydation de l'ADN artificiel peut être encore réduit par l'isolement nucléaire, comme décrit par ailleurs 10.
- Tissus animaux
- Dose animaux tel que requis. Pour ce protocole, adulte (âge de 9 semaines) traiter mâle Muta souris par gavage oral par jour pendant trois jours consécutifs avec 20 mg DBC / kg de poids corporel par jour dissous dans l'huile d'olive.
NOTE: Cet animal transgénique ports conçu λ-bactériophage et la mutation du gène rapporteur lacZ de E. coli 11 est utilisé pour des essais de mutation rongeurs transgéniques 12. - Effectuer l'autopsie des animaux, par exemple, anesthésié les souris peut utilisant l'isoflurane et ensuite euthanasiés par dislocation cervicale suivie par l'ouverture de la cavité thoracique. Immédiatement clignoter tissus de congélation dans l'azote liquide. tissus de conserver à -80 ° C jusqu'à l'analyse.
NOTE: Le calendrier de l'euthanasie après le traitement peut être une autre variable importante (par exemple, l'oxydation de l'ADN était maximale à 72 heures après l'exposition au bruit dans le cerveau de rat et le foie 13).
- Dose animaux tel que requis. Pour ce protocole, adulte (âge de 9 semaines) traiter mâle Muta souris par gavage oral par jour pendant trois jours consécutifs avec 20 mg DBC / kg de poids corporel par jour dissous dans l'huile d'olive.
2. Extraction de l'ADN, des précipitations et de lavage (pour les tissus Allez directement à 2.2)
- Homogénéiser les cellules recueillies dans un tube conique de centrifugation de polystyrène de 50 ml avec 1 ml d'ADN isoler agent tel que DNAzol. Utiliser un embout de pipette ul 1,000 pour disperser le culot de cellules jusqu'à ce que la solution soit homogène. Transfert homogénat à un nouveau tube de 1,5 ml. Incuber sur de la glace pendant 10-20 min. Passez à 2.3.
- Homogénéiser 15-20 mg de tissu dans une poche homogénéisateur en verre antiadhésif 1 ml contenant 500 ul agent de l'ADN d'isolement. Soulevez doucement et homogénéisateur inférieure pendant environ 1 min; tissus doux, il faudra moins de temps. Un traitement en douceur assure moins de cisaillement de l'ADN. Rangez le broyat sur la glace pendant environ 10-20 min.
- Pastillel'homogénat par centrifugation pendant 10 min à 10 000 x g et 4 ° C dans un tube conique de centrifugation de 1,5 ml.
- Soigneusement transférer le surnageant résultant dans un nouveau tube de 1,5 ml en faisant attention à éviter tout contact avec le culot.
- Précipiter l'ADN à partir de l'homogénat par addition de 0,5 ml de EtOH à 100% par 1 ml d'homogénat. Inversez tubes 10 fois pour assurer réactif isoler et EtOH sont suffisamment mélangés.
- À ce stade, l'ADN précipité est visqueux, spool il sur une pointe de pipette en plastique (par exemple, avec une capacité de rétention maximale de 200 pi), puis transféré à un nouveau 1,5 ml conique microtube.
REMARQUE: centrifugation rapide peut être utilisé pour enlever tout reste de lysat à partir de l'ADN isolé.
(DNA Laver et solubilisation) - Ajouter 1 ml de EtOH à 75% à l'ADN isolé. Suspendre le culot d'ADN soigneusement en inversant les tubes 10 fois.
- Décanter avec soin l'éthanol à partir du tube. Veiller à ce que ee culot d'ADN bâtons sur le côté du tube. Conserver les tubes à la verticale pendant 1-2 min et utiliser une pipette pour enlever l'excédent EtOH du fond du tube.
- Répéter l'ADN laver une fois de plus, et soit stocker l'échantillon dans de l'éthanol à -20 ° C (stable pendant plusieurs mois) ou procéder immédiatement à la digestion.
- Dissoudre l'ADN dans un tampon de digestion (décrit ci-dessous), puis quantifier en utilisant des méthodes spectroscopiques classiques (par exemple, l'absorbance à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop).
3. Digestion enzymatique
- Préparez "tampon de digestion" en combinant des volumes appropriés (en fonction du nombre d'échantillons à digérer) de 50 mM de phosphate de Na monobasique (contenant 2,0 mM de KCl, mM de Desferal 1,0 (MPO) et 200 mM de MgCl2) avec 50 mM de phosphate dibasique de Na (contenant également mM KCl 2,0 mM, 1,0 MPO et 200 mM MgCl2). Chaque échantillon nécessite 4,0 pi monobasiques et 17,0 ul solution de phosphate disodique. <li> Retirez tout EtOH restant dans le fond des échantillons de tubes et sécher à l'air pendant environ 5 min. Assurez-vous que l'ADN ne se dessèche pas complètement.
- Dissoudre 80 ug de l'ADN extrait dans 21,0 ul de tampon de digestion, ajouter une unité de DNase I dissous dans 2,0 ul de tampon de digestion.
- Vortex légèrement pour atteindre un mélange complet et incuber pendant 1,5 heures à 37 ° C.
- A la fin de la période d'incubation, ajouter 216,4 pi de solution de phosphate dibasique 50 mM de Na contenant 2,0 mM de KCl, 1,0 mM de MPO et 200 mM de MgCl 2.
- Préparer "digestion tampon-2" en combinant un volume de tampon de digestion avec neuf volumes de phosphate dibasique, 50 mM de Na (avec 2,0 mM de KCl, 1,0 mM de MPO et 200 mM de MgCl2).
- Ajouter 0,025 unités de la phosphodiestérase (PDE) Je enzyme dans 16,3 ul de la digestion tampon-2. Pipette de haut en bas pendant plusieurs secondes, puis vortex légèrement pour atteindre un mélange complet et incuber pendant 1,5 heures à 37 ° C.
- Ajouter 00,4 unités de phosphatase alcaline (AP) dans 8,0 ul de la digestion tampon-2. Pipette de haut en bas pendant plusieurs secondes, puis vortex légèrement pour atteindre un mélange complet et incuber pendant 1,5 heures à 37 ° C. Ajouter 33,0 pi qualité HPLC MeOH.
- Exécutez des échantillons d'ADN digérés par HPLC, comme décrit ci-dessous, tout de suite ou conserver à -80 ° C jusqu'à son utilisation pour minimiser l'oxydation. REMARQUE: Les étapes de digestion de 1,5 h suggérées ici sont basés sur des intervalles suggéré ailleurs 9 et sur les conclusions que les protocoles similaires atteindre digestion complète de l'ADN 9. Par conséquent, on a supposé que le seul facteur limitant pour obtenir une digestion complète était temps et que l'inhibition de l'enzyme et de l'échantillon étaient des non-homogénéité négligeable.
4. HPLC Run: Préparation de la phase mobile, installation de Instrumentation et maintenance
- Utilisez de l'eau ultra pure pour préparer toutes les solutions tampons et traité à la résine de force de liaison (par exemple, Chelex 100: styrène divinylbenzene copolymère avec des ions iminodiacétate que les métaux de transition chelates avec une affinité élevée) pour minimiser la contamination métallique et l'oxydation de l'ADN au cours de la préparation des échantillons.
- Préparer 250 mM de tampon de phosphate de Na, pH 6,2. Utiliser un rapport de 1: 3,6957 de phosphate de sodium dibasique (FW = 177,99 g / mol) de phosphate de sodium monobasique (FW = 119,98 g / mol).
Exemple: Par conséquent, pour un stock solution à 3 L combiner 70,81 g de monosodique et de 28,43 g de poudre dibasique, ajouter de l'eau jusqu'à par exemple, 2,8 L et vérifiez que le pH de la solution est de 6,2. Ajuster le pH avec 250 mM de phosphate mono ou disodique solutions préparées séparément, et non par des acides ou des bases concentrées. Ajouter 2,24 g de KCl pour obtenir une concentration de 10 mM de KCl. - Préparer la phase mobile en trois bouteilles, au moins 1 L chaque contenant: solvant B - méthanol de qualité HPLC, solvant - B eau ultra-pure, et solvant C - tampon phosphate de l'étape 4.2. Insérez HPLC tube d'alimentation de la phase mobile dans les bouteilles; remaining tubes doivent également être trempées dans l'une des bouteilles (par exemple, solution C) et amorcés, même si elles ne sont pas nécessaires pour le mélange.
- Au cours de l'essai, le mélange des solutions de phase mobile jusqu'à 6% de solvant A, 74% de solvant B et 20% de solvant C pour obtenir une solution finale de mM de tampon 50 phosphate de sodium (pH 6,2) avec mM de KCl 2,0, et 6% de MeOH.
- Détacher l'électrode du détecteur électrochimique, le démonter et de référence propre et électrodes de travail avec les solutions de nettoyage de l'électrode et disques à polir recommandés par le fabricant. Rincer les surfaces nettoyées avec de l'eau ultra-pure, essuyez l'eau douce et d'assurer le détecteur est sec avant d'allumer le système.
- Remonter le détecteur et relier l'entrée de la phase mobile à l'électrode. Tournez sur le flux et permettre à la phase mobile pour remplir l'électrode avant de fixer le tube de sortie de phase mobile. Installez une nouvelle colonne avant de commencer l'optimisation. Assurez-vous que l'installation est dans la direction correcte et follows toutes les recommandations du fabricant.
- Allumez l'instrumentation HLPC bien en avance (par exemple, 1 h) de l'analyse des échantillons pour permettre un équilibrage et de réduire le bruit de fond. Voir le tableau 1 pour les réglages suggérés; la limite de pression de retour doit être réglé à 3000 psi pour éviter d'endommager la colonne. Allumez le dégazeur. Procéder à l'amorçage des pompes et de la mise en place gradient de solvant.
- Premier à sec les pompes selon les instructions du fabricant. Pour ce faire, pour mouiller les lignes quand une phase mobile a été remplacée ou l'entrée du tube est exposé à l'air.
- Localisez le disque d'amorçage et insérez une seringue en plastique de 10-15 ml il. Assurez-vous que la seringue est complètement inséré avant l'ouverture de la ligne. Pour ouvrir les lignes il suffit de tourner le compteur disque dans le sens horaire pour un tour.
- Lancer le premier avec la sélection de l'interface HPLC appropriée. Tirez doucement la seringue pour aspirer le fluide dans les lignes. Une fois fluide circule, le premier est terminé; permettre au programme determiner la course. Répétez l'opération pour toutes les lignes (généralement quatre, en fonction de l'instrument).
- Alternativement, le Premier humide lorsque les lignes sont déjà mouillés à partir d'un premier sèche plus tôt (voir ci-dessous).
REMARQUE: Quand une grande quantité de temps écoulé entre les utilisations (par exemple, 2 semaines ou plus), un premier à sec est recommandé. - Changer la composition des composants de solvant de phase mobile pour 25% par l'aide de l'interface utilisateur de l'HPLC. Depuis l'interface, sélectionner l'option "Fonction Direct", puis sélectionnez l'option "Wet Premier". Ce sera apprêter toutes les lignes en même temps.
- Assurez-vous que tout l'air est sorti du système en observant la ligne principale humide qui entre dans le conteneur de déchets. Après un bon premier, veiller à ce que pas de bulles sont laissés dans la ligne. Si des bulles persistent, répéter l'amorçage.
- Une fois que la pompe est amorcée, commencer à déplacer la phase mobile HPLC. Utiliser l'interface de HPLC pour changer manuellement la composition de la phase mobile à 6% de methanol (solvant A) et 94%l'eau (solvant B), et sélectionnez un taux de 0,9 ml / min. Autoriser 5 min pour effacer toute méthanol à partir de l'étape de nettoyage de la colonne.
- Après 5 min, de changer la composition de 6% de methanol (solvant A), 74% d'eau (solvant B), 20% de tampon (solvant C), d'augmenter la vitesse d'écoulement de 1,0 ml / min. Définissez d'autres paramètres tels que résumés dans le tableau 1, et définir la limite de pression à 3000 psi pour éviter d'endommager la colonne.
REMARQUE: Les problèmes potentiels avec la configuration de HPLC comprennent la dérive de base, pic scission et de l'intensité du signal diminue. Ceux-ci peuvent généralement être surmontés par le nettoyage de la colonne après chaque utilisation, le nettoyage de l'électrode fréquentes, et veiller à ce que les solutions tampons sont exempts de contamination (par exemple, des particules ou la croissance microbienne). - Exécutez la phase mobile pour environ 1-1,5 heures pour atteindre un signal de référence stable.
- Utilisation de l'interface de logiciel de l'appareil, sélectionnez les paramètres comme indiqué dans le tableau 1 et régler le temps d'exécution à 15 min. Injecter le sample. L'utilisation accrue des temps d'exécution pour les échantillons complexes (le déterminer de façon empirique en observant la présence ou l'absence de pics au-delà de l'intervalle de 15 min).
REMARQUE: Le logiciel Instrument permet de programmer des conditions de roulage de l'échantillon et de la configuration pour autosampling. - Après les courses ont été validées, éteindre la cellule de détection en utilisant l'interface du détecteur. Il est important de suivre les recommandations du fabricant concernant la mise hors tension du détecteur comme une mauvaise manipulation et d'arrêt peut endommager l'appareil. NE PAS éteindre le portable en passant à l'arrière du détecteur, car cela pourrait endommager l'appareil.
- Modifier manuellement la composition de la phase mobile à 6% de methanol et 94% d'eau. Exécutez pendant 5 min.
- Réduire manuellement le débit à 0,7 ml / min, changer immédiatement la composition à 50% de MeOH et 50% d'eau. Exécutez pendant au moins 20 min. Défaut d'exécuter cette étape pour la durée recommandée peut entraîner des dommages à la colonne et le détecteur. Éteignez le flux, unD puis éteignez le dégazeur.
5. Préparation des étalons
- Préparer tampon de phase mobile, comme indiqué dans les étapes 4.1-4.3 ci-dessus. Il est important d'utiliser la phase mobile HPLC pour la préparation de normes pour éviter les pics résultant du mélange de solutions dissemblables après l'injection de l'échantillon.
- Diluer cette solution un sur cinq avec de l'eau ultra pure avant de l'utiliser, et la solution finale doit contenir 6% de MeOH.
- dGuo standard
NOTE: Un fort potentiel d'oxydation nécessaire pour la détection dGuo peut augmenter le risque de mesurer interférer composés électroactifs. Cela peut être vérifié, par exemple, une courbe d'étalonnage de détection UV de 260 nm à dGuo et en la comparant à la courbe d'étalonnage créée avec détection CE. Si les deux cadrent bien (par exemple, la figure 1 supplémentaire) et les effets de la matrice de l'échantillon ont été pris en compte, on peut procéder à la détection dGuo par UV à 260 nm, plutôt que la détection CE.- Vortex à grande vitesse jusqu'à dGuo dissout complètement. Ceci est le stock primaire; stocker à -20 ° C pendant plusieurs semaines.
- Pour créer le stock dGuo secondaire (0,5 mM), diluer 143 pi de primaire actions dGuo dans 857 pi de phase mobile HPLC. Stocker sur la glace jusqu'à utilisation et préparer frais tous les jours.
- Faire des dilutions pour créer une courbe standard (par exemple, le tableau 2). solutions de magasins sur la glace et à préparer quotidiennement. Exécuter les normes en série avec des échantillons expérimentaux.
- Avant de courir, faire varier la tension du détecteur utilisant la plus forte concentration du stock pour trouver la tension optimale.
- 8-oxo-dGuo standard
- Mesurer 1,0 mg de 8-oxo-dGuo dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 0,1 ml de qualité HPLC MeOH. Vortex à haute vitesse jusqu'à 8-oxo-dGuo dissout complètement. Ceci est le stock primaire de 8-oxo-dGuo. Conserver à -20 ° C pendant sevsieurs semaines.
- Dans un tube, mélanger 2,9 ul d'actions primaires et 997,1 pi de tampon de CLHP phase mobile, vortex. Ceci est le stock secondaire (10 000 nM).
- Pour créer une solution de travail pour la courbe standard (250 nM), mélanger 24,4 ul d'actions secondaire et 975,6 pi de tampon de la phase mobile.
- Effectuer d'autres dilutions pour fournir les solutions nécessaires pour créer une courbe standard (par exemple, le tableau 3). solutions de magasins sur la glace et à préparer quotidiennement. Normes courir avec les échantillons expérimentaux.
- Quantification
- Intégrer l'aire sous la courbe pour les deux 8-oxo-dGuo et dGuo utilisant un logiciel standard (comme une partie de l'interface HPLC-ordinateur; voir complémentaire figure 2A).
- Construire la courbe standard (concentration connue de chaque analyte vs aire sous la courbe (complémentaire figure 2B). En utilisant l'équation de la courbe standard, pour calculer le ratio 8-oxo-dGuo / dGuo pour chaque échantillon.
6. Agarose Gel Electrophoresis
REMARQUE: électrophorèse sur gel d'agarose peut être réalisée pour vérifier l'intégrité de l'ADN digestion.
- Préparer 50x Tris-acétate-EDTA (TAE) tampon, en dissolvant 242 g de base Tris (FW = 121.14) dans 750 ml d'eau ultra-pure. Ajouter 57,1 ml d'acide acétique glacial et 100 ml d'EDTA 0,5 M (pH 8,0; EDTA complètement dissoudre lorsque le pH de la solution est ajusté à 8,0 avec, par exemple, NaOH) et ajouter de l'eau ultra-pure à un volume final de 1 L. Conserver à la température ambiante, diluer cette solution 50x avant de l'utiliser.
- Peser 1 g d'agarose et le dissoudre dans 100 ml de tampon 1x TAE, chauffage au micro-ondes pendant 1-2 min. Porter des lunettes et des équipements de protection pour éviter tout contact avec de l'agarose bouillante.
- Refroidir la solution jusqu'à ce que environ 50 ° C, ajouter 5 ul de bromure d'éthidium (attention: mutagène) et versez-le dans l'appareil gel de fonctionnement agarose. Insérez le peigne.
- Attendez jusqu'à ce que la solidification de la solution, verser tampon TAE sur le gel et de charger les échantillons (volume dépend de la taille de peigne; typiquement, 10-20 ul de l'échantillon d'ADN est chargé, mélangé avec 6x colorant courir à visualiser et à faciliter le chargement).
- Exécuter le gel jusqu'à ce que le colorant migre approximativement 2/3 de la longueur du gel (par exemple, 45 minutes à 150 V). Visualiser les bandes d'ADN sous la lumière UV.
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Representative Results
dGuo a été observé à un temps de rétention de 4,7 min alors que les 8-oxo-dGuo avait un temps de rétention d'environ 6,4 min (Figure 2A et B). Il n'y a de différence sur 1000 fois dans les hauteurs de pics entre les deux analytes, comme on le voit sur la figure 2C. Voltammogrammes pour 8-oxo-dGuo et dGuo ont été obtenus par les normes en cours d'exécution à un potentiel de travail dans la gamme de 0,2 à 1,1 V. Le potentiel de travail optimal pour les 8-oxo-dGuo a été établie à 0,5 V et 0,9 V pour dGuo (Figure 3). Ces potentiels sont en accord avec les autres électrodes de carbone vitreux décrits dans la littérature 14,15. La limite de détection et la gamme dynamique de détection électrochimique 8-oxo-dGuo et dGuo est signalé à être dans la gamme femtomole et nanomole, respectivement 8,9. Les courbes d'étalonnage pour dGuo et 8-oxo-dGuo doivent être effectués tous les jours afin de garantir une détection linéaire sur une plage de concentration appropriée et effectuer appropriément de l'appareil (figure 4). Les courbes d'étalonnage sont construites en traçant la surface du pic en fonction de la concentration d'analyte connue (figure complémentaire 2) qui permet de calculer la concentration en analyte dans les échantillons à partir de l'équation générée à partir des courbes standards.
La digestion complète de l'ADN est nécessaire pour des mesures précises de fréquence 8-oxo-dgua et plusieurs procédés de digestion de l'ADN génomique ont été suggérées 8,15,16. Lorsque cela est nécessaire, l'efficacité de l'extraction d'ADN et la digestion peut être vérifiée en utilisant une électrophorèse sur gel d'agarose (figure 5A) et HPLC-ED (Figure 5B). Lanes manifeste des frottis d'ADN sur la figure 5A (par exemple, les lignes 2, 4, 6, 9, 11, et 13) indiquent la présence de l'ADN non digérés tandis que les échantillons avec des fragments d'ADN digérés ruissellement du gel et étaient donc inaperçue. Le plateau de la figure 5B indique que d'autres incubatisur de l'ADN avec des enzymes de digestion au-delà de 1,5 h ne conduit pas à une plus grande quantité de dGuo détectée, ce qui suggère la digestion presque complète après 1,5 h. En outre, à la fois agarose électrophorèse sur gel et HPLC-ED ont été utilisés pour tester l'utilité de la mémoire tampon ADN digestion à base de phosphate employé ici. Ce tampon est adaptée à la phase mobile HPLC et ne donne pas lieu à un bruit de détecteur indésirable attribuable à mélanger des solutions hétérogènes (données non présentées). Par conséquent, le commutateur de la mémoire tampon a suggéré dans la littérature (par exemple, Tris-HCl 8) de tampon de phosphate de sodium est recommandée pour ce protocole (de gauche à droite par rapport à la figure 5A). S'il vous plaît noter que les hypothèses sous-jacentes pour l'optimisation de la digestion de l'ADN étaient que inhibition de l'enzyme et inhomogénéité de l'échantillon étaient négligeables et l'heure de la digestion était le seul facteur limitant, comme indiqué ci-dessus. Une possibilité que la digestion incomplète d'ADN conduit à des fragments qui sont trop petites pour être deteDECT sur les restes de gel d'agarose. Même si une telle erreur systématique aurait une incidence sur tous les échantillons aussi, d'autres expériences (par exemple, le traitement des cellules cultivées avec un pro-oxydant radiomarqué 10) pourraient être conduites pour exclure complètement une telle possibilité.
Contrairement aux solutions classiques, l'ADN digéré, que ce soit à partir de cellules isolées ou de tissus de souris, a produit plusieurs pics supplémentaires (Figure 6A et 6B). Ceux-ci étaient éloignés des sommets 8-oxo-dGuo et dGuo, mais dopage expériences dans le cadre d'exercices de validation décrites dans la discussion sont nécessaires pour examiner si les pics supplémentaires (c.-échantillon impureté due à des effets de matrice, par exemple) interfèrent avec la quantification . Le dGuo-8-oxo pic a été confirmée par correspondance du temps de rétention à la norme; et en outre, l'augmentation de la dGuo-8-oxo pic pour des échantillons de cellules ou d'animaux qui ont subi un traitement pro-oxydant (Figure 7). Pro-oxydant KBrO 3 participe à l'abstraction de la guanine un électron qui conduit à la formation de 8-oxo-dGuo 17. Il est à noter qu'en l'absence de la contrainte pro-oxydant, 2,4 molécules de 8-oxo-dGuo par dGuo 7 10 ont été détectés dans des cellules A549 (figure 7A). Ceci est comparable à 4,5 molécules de 8-oxo-dGuo / 10 7 dGuo détectés dans les cellules A549 observées en utilisant une approche alternative, fondée sur la spectrométrie de masse conçu pour combler les lacunes potentielles de la méthode HPLC-ED 9. DBC traitement (c.-à-jour 20,0 mg DBC / kg de poids corporel par jour pendant trois jours) a augmenté les niveaux dGuo-8-oxo dans l'ADN de rate de souris. Ceci est également un résultat attendu, puisque ROS est connue pour être produite au cours du métabolisme des hydrocarbures aromatiques polycycliques 8 in vivo. Les niveaux relatifs de 8-oxo-dGuo dans la rate des animaux non accentuées sont 8.3 à 9.4 8-oxo-dGuo / 10 6 dGuo (figure 7B), ce qui est en excellent agreement avec les valeurs publiées de quatre molécules 8-oxo-dG / 10 6 dGuo mesurées dans les cellules spléniques murins dans des conditions standard par HPLC-ED 18. Les figures 6 et 7 montrent que les niveaux de 8-oxo-dGuo ci-dessus la ligne de base sont très petites . Ainsi, si l'ADN est oxydé à des niveaux inférieurs à celui observé ici, les niveaux de 8-oxo-dGuo peuvent se distinguer de la ligne de base, qui doit être gardé à l'esprit par les utilisateurs du protocole potentiels.
Figure 1. Structure de 8-oxo-dGuo et son tautomère 8-OH-dGuo. Notez que 8-oxo-dGuo au lieu de 8-OH-dGuo est le tautomère majeur à pH 7,4.
Figure 2. temps de rétention pour dGuo (A) et 8-oxo-dGuo (B). HPLC-ED chromatogrammes ont été obtenus à partir d'une injection de 10,0 ul de navigateur dGuo (1,0 nmol totale) ou 8-oxo-dGuo (1000 fmol au total) et détectés à 0,9 V (A) ou 0,5 V (B). Le pic de rétention pour dGuo était d'environ 4,7 min (A) et en ce que pour 8-oxo-dGuo était d'environ 6,4 minutes (B). Le pic large à 2-3 min est probablement causée par des perturbations d'injection et est affecté (par exemple, toujours présent à l'intensité similaire) par la concentration de 8-oxo dGuo. (C) chromatogrammes superposés de deux injections séparées décrits dans (A) et (B) détecté par UV (260 nm). Les normes ont été exécutés le jour même en utilisant des conditions d'exécution identiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. tension du détecteur Optimisation. (A) Voltamogramme de dGuo (concentration finale 1 nmol) détecté par une analyse HPLC-ED à une gamme de 0,7-1,1 V. (B) Voltamogramme de 8-oxo-dGuo (concentration finale 500 fmol) détectée par l'analyse HPLC-ED à une gamme de 0,3-0,7 V. Moyens de trois expériences indépendantes (N = 3) ± écart type représenté. Dans certains cas, les barres d'erreur sont plus petites que les symboles de traçage.
Figure 4. Courbe standard pour dGuo (A) et 8-oxo-dGuo (B). Dix microlitres de chaque dGuo ou 8-oxo-dGuo a été injecté et mesurées par HPLC-ED à 0,9 V (A) ou 0,6 V (B ). Moyens de trois expériences indépendantes (n = 3) ± écart type indiqué. Dans certains cas, les barres d'erreur sont smaller que les symboles de traçage.
Figure 5. L'optimisation de la digestion de l'ADN. (A) Quatre-vingt microgrammes de testicules de saumon ADN a été digéré comme décrit 8 dans du Tris-HCl, un tampon glycine-acétate (à gauche) ou du tampon phosphate de sodium (à droite). Une électrophorèse sur gel d'agarose (1,0%) a été effectuée à 150 V pendant 45 min. La piste 1 et 8: Echelle d'ADN; pistes 2, 4, et 6: ADN non digéré; les pistes 3, 5 et 7: ADN digéré; pistes 9, 11 et 13: l'ADN non digéré (tampon phosphate); Les pistes 10, 12 et 14:. digéré l'ADN (tampon phosphate) (B) testicules de saumon ADN (80 pg) a été digéré par les présentes incubation avec de la DNase I, PDE I, et de 0,5 à 2,5 hr AP pour chaque étape, dans 50 tampon phosphate mM contenant du chlorure de magnésium et le MPO. Cinquante microlitres de chaque échantillon, contenant 7,3 ug d'ADN digéré, on a analysé par HPLC (par exemple, 0,9 V et 1 ml / min flow) pour détecter dGuo. Figure montre moyen de trois expériences indépendantes (n = 3) ± erreur standard de la moyenne. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Les chromatogrammes de détection 8-oxo-dGuo dans des cellules cultivées (A) ou de tissus d'origine animale (B). (A) digéré l'ADN à partir de cellules A549, traitées ou non traitées avec KBrO 3. (B) ADN digéré à partir de la rate de DBC souris traités par. Les pics décalés vers la gauche en raison du retrait de la colonne de garde (en raison de l'accumulation de pression dans l'appareil, leur position a été confirmée avec les normes). Étalons et les échantillons ont été exécutés le même jour utilisant la condition d'exécution identiquess et 10 ml, le volume d'injection à un débit de 1 ml / min et 0,5 et 0,9 V pour dGuo et 8-oxo-dGuo, respectivement. S'il vous plaît cliquez ici pour une version plus grande de la partie A; ici pour le panneau B.
Figure 7. Quantification de 8-oxo-dGuo dans des échantillons biologiques. Les pics ont été intégrés et comparés aux courbes standard (voir Figure complémentaire 2 pour plus de détails) pour donner les niveaux 8-oxo-dGuo dans l'ADN de cellules A549, traités avec KBrO 3 ( A), les niveaux ou 8-oxo-dGuo en ADN à partir de la rate de souris traitées par DBC (B). Etoiles (*) indiquent une signification statistique (p <00,05, analyse unidirectionnelle de variance (Anova) (A), le test t de Student (B)). Moyens de trois (A) ou cinq (B) expériences indépendantes ± erreur standard de la moyenne sont affichés. Des échantillons ont été prélevés 4 ou 24 h après le traitement de 3 jours.
| Phase mobile | Na 50,0 mM de tampon phosphate, pH 6,2, contenant 6% de MeOH et 2,0 mM de KCl |
| Le débit de la phase mobile | 1,0 ml / min |
| Type de colonne | YMC-BASIC avec de la silice sphérique liée |
| longueur de la colonne | 15 cm |
| Diamètre intérieur Colonne | 3,5 mm |
| Température de la colonne | 35 ° C |
| La température du détecteur | 29 ° C |
| réglage de la tension de 8-oxo-dGuo | 0,5 V |
| Réglage de la tension pour dGuo | 0,9 V |
| Volume d'injection | 10,0 ml |
Tableau 1. Paramètres de l'instrument pour la détection et la quantification de 8-oxo-dGuo par HPLC-ED.
| nmoles | 100 nM norme, pl | HPLC en phase mobile, ul | Dilution, pliez |
| 5 | 300 | 0 | 1 |
| 2.5 | 150 | 150 | 2 |
| 1 | 60 | 240 | 5 |
| 0,5 | 30 | 270 | 10 |
| 0,25 | 15 | 285 | 20 |
| 0,1 | 6 | 294 | 50 |
Tableau 2. </ Strong> Préparation de la courbe standard pour dGuo.
| fmoles | 250 nM norme, pl | HPLC en phase mobile, ul | Dilution, pliez |
| 2500 | 300 | 0 | 1 |
| 1000 | 120 | 180 | 2.5 |
| 500 | 150 | 150 | 5 |
| 250 | 150 | 150 | 10 |
| 100 | 120 | 180 | 25 |
| 50 | 150 | 150 | 50 |
Tableau 3. Préparation de la courbe standard pour 8-oxo-dGuo.
Souper Figure 1. Comparaison complémentaire de électrochimique (EC) et la détection UV à base de dGuo. courbe standard a été créée pour la détection dGuo par détection électrochimique (EC) ou d'une détection UV (260 nm). Domaines de pointe ont été intégrés pour dGuo pic à environ 4,7 min par les deux méthodes. N = 3, la moyenne ± écart-type sont représentés.
Figure complémentaire 2. Quantification des dGuo de sa courbe standard. Un exemple de l'utilisation de la courbe standard pour déterminer la concentration de dGuo est montré. (A) zone de crête peut être déterminée par l'intégration en utilisant un logiciel standard. (B) Cette information est utilisée pour construire une courbe d'étalonnage afin d'utiliser l'équation de la ligne pour calculer la concentration d'analyte dans l'échantillon inconnu.52697 / 52697fig9large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Bien que 8-oxo-dGuo a été rapporté comme un biomarqueur utile de l'oxydation de l'ADN, sa quantification fiable peut représenter un défi. Bien que plusieurs méthodes publiées existent, il ya une nécessité d'une approche globale, aperçu descriptif du protocole pour permettre aux chercheurs de déployer la méthode dans leurs laboratoires. Ici, nous présentons un aperçu détaillé d'un protocole fondé HPLC-qui permettra aux nouveaux utilisateurs d'établir une méthode efficace pour la détection 8-oxo-dGuo et la quantification.
Trois grandes méthodes qui ont été décrites pour la quantification de 8-oxo-dGuo. Ceux-ci comprennent immuno-enzymatique (ELISA) à base de kits commerciaux 19, chromatographie liquide / spectrométrie de masse (MS) méthodes (par exemple, comme décrit par ailleurs 9 et méthodes HPLC-ED, tel que décrit ici. Méthodes ELISA peuvent souffrir d'interférences avec certains composés dans des échantillons biologiques 19. En général, les résultats obtenus en utilisant Chromatographic techniques sont considérées comme plus fiable pour 8-oxo-dGuo quantification par rapport aux procédés 20 basés sur ELISA. En comparant les méthodes HPLC-ED avec les méthodes basées sur la MS, l'avantage de l'ancien est relativement peu coûteux équipements (soit environ un ordre de grandeur moins coûteux que des équipements pour les méthodes MS). En outre, HPLC-MS sont supérieurs aux méthodes HPLC-ED que l'ancien ne sont pas sujettes à des interférences potentielles avec des composés électroactifs et de fournir des mesures quantitatives, sans ambiguïté en utilisant des isotopes 21.
Des préoccupations ont été soulevées quant à l'utilisation de méthodes d'extraction phénol traditionnelles pour l'extraction de l'ADN génomique à être utilisé pour 8-oxo-dGuo quantification 22. Plusieurs chercheurs ont constaté que les conditions associées à l'extraction de phénol norme peuvent introduire oxydation dGuo indésirables augmentant ainsi les niveaux de base 1,9. Pour résoudre ce problème, cellulaire et animade l 'ADN génomique peut être extrait et purifié en utilisant un protocole modifié DNAzol 22. DNAzol contient de fortes concentrations de thiocyanate de guanidine, et des études antérieures 9 ont noté inférieure niveau basal formation 8-oxo-dGuo quand DNAzol est utilisé par rapport à phénol traditionnelle et des méthodes d'extraction à base de Nal. Le composé chélateur de fer MPO a été utilisé pour minimiser la production de ROS et de l'oxydation de l'ADN au cours de la préparation des échantillons. Comme indiqué plus haut, les niveaux de 8-oxo-dGuo dans des cellules A549 non stressés (figure 7A) étaient très semblables à ce qui a été mesurée par une méthode basée sur la MS 13. Cela donne à penser que la transposition de précautions pour les méthodes décrites 13 MS a permis de minimiser l'oxydation de l'ADN indésirable pendant la préparation et l'analyse des échantillons pour réaliser précis 8-oxo-dGuo quantification par HPLC-ED. Moment de cellules de culture ou de récolte de l'autopsie après le traitement pro-oxydant peut être un autre facteur important, comme on le voit ici en refusant 8-oxo-dGuo niveauxdans la rate à 24 h vs 4 heures après le dernier traitement (figure 7B). Cela peut être dû à l'activation de la réparation par excision de base pour éliminer les dommages à l'ADN.
Les deux limites évidentes du procédé décrit sont les suivants: (1) la nécessité d'assez grandes quantités d'ADN (environ 80 ug par exemple d'atteindre trois répétitions techniques), et (2) tout risque d'interférence à partir de composés de co-élution. On a constaté que seule une très petite (par exemple, environ 15 mg) morceau de rate (environ 15% du poids du tissu totale) était suffisante pour obtenir 80 ug d'ADN, en laissant une quantité suffisante de tissu pour d'autres (par exemple, l'expression du gène) analyses. La quantité d'ADN extrait est un autre paramètre critique qui affecte l'oxydation de l'ADN artéfactuelle 23,24,25. Par conséquent, travailler avec, plutôt grande (~ 80 mg / échantillon) que nous proposons ici est conforme aux recommandations précédentes de l'aide> 30 mg pour minimiser l'oxydation de l'ADN artifactual 25.Pour les plus petits tissus (par exemple, l'hippocampe), on pourrait réduire le protocole de commencer avec 20-30 pg d'ADN, car ce devrait être suffisant pour 2-3 séries. De plus grandes quantités d'ADN seraient probablement faciliter la résolution des pics au-dessus du bruit de fond, mais cela reste à être vérifiée expérimentalement La présence de substances potentiellement interférents peut être adressée au cas par cas, et il est essentiel de toujours inclure échantillon d'ADN de simultanée in vitro ou in vivo avec des traitements de contrôle positif qui est connu pour induire des dommages oxydatifs à l'ADN (voir Figure 7).
Bien que le phosphate dans des tampons phosphate a été rapporté pour réduire l'activité de la phosphatase alcaline, des expériences méthode d'optimisation (figure 5) ont confirmé que tampon phosphate pourrait facilement être utilisé. Comme tampon de phosphate est contenu dans la phase mobile, son utilisation dans la préparation des échantillons réduit le bruit de détecteur en raison de solvent de mélange. Ainsi, la tension, la composition du tampon, l'extraction d'ADN et la digestion ont été optimisées et des contrôles positifs ont été inclus. En outre, un résumé décrivant la façon dont ces variables peuvent être optimisées par des laboratoires individuels est fourni. Notre objectif était de produire une méthode qui pourrait être utile pour les laboratoires spécialisés visant à développer un test pour la détection 8-oxo-dGuo et la quantification.
Toutefois, nous notons que la validation formelle de la méthode est requise, comme indiqué dans les validations mesures recommandées par la Conférence internationale sur l'harmonisation des exigences techniques pour l'enregistrement des produits pharmaceutiques à usage humain (ICH) pour la validation des méthodes analytiques (c.-à-ICH Q2 ( R1) 26). En bref, les éléments de validation quantitative devraient examiner de l'essai: 1) la précision (qui peut être accompli en incluant des échantillons avec différentes quantités de 8-oxo-dGuo dopés en; 2) la distance et linéarité (réponse linéaire à travers posteconcentration de l'analyte indéterminée; 3) la précision (répétabilité et reproductibilité); 4) limite de détection (généralement, le point auquel le rapport signal sur bruit est supérieur ou égal 3/2, ce qui peut être dépendante de la matrice); 5) la limite de quantification (concentration à laquelle la réponse répond à certains niveaux prédéterminés tels que 2 x écart type de contrôle; peut être la matrice-dépendante); 6) sélectivité / spécificité (capacité à détecter l'analyte dans des échantillons complexes par rapport aux solutions sans solvant); 7) la reproductibilité (la capacité d'obtenir le même résultat dans différents laboratoires, avec différents opérateurs); et 8) la robustesse et la pertinence du système. Comme le but de la validation recommandée par le CIH est de démontrer qu'il est "approprié aux fins prévues» et de nombreux laboratoires aura probablement des fins différentes, les utilisateurs potentiels de ce test devraient valider ce dans la mesure jugée nécessaire. Quantification précise de 8-oxo-dGuo est souhaitable en toxicologie et en médecine moléculaire péchéCE, il peut améliorer la compréhension du stress oxydatif comment, et plus spécifiquement l'oxydation de l'ADN, est mécaniquement et empiriquement liée à des effets néfastes sur la santé.
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Acknowledgments
Cette recherche a été financée par l'Initiative de Santé Canada de recherche en génomique et le développement (GRDI) et la Stratégie canadienne de réglementation de la biotechnologie (SCRB). Les auteurs ne sont pas de conflit d'intérêts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details. |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E. coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH) |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
References
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