Summary
Das Ziel des Protokolls ist die Detektion der DNA-Oxidation Marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-Desoxyguanosin (8-oxo-dGuo) durch HPLC-ED, in DNA aus kultivierten Zellen oder tierische Gewebe.
Abstract
Oxidativer Stress ist mit vielen physiologischen und pathologischen Prozessen, wie auch Fremdstoffmetabolismus assoziiert, was zur Oxidation von Biomakromolekülen, einschließlich DNA. Daher ist eine effiziente Detektion von DNA-Oxidation wichtig für eine Vielzahl von Forschungsbereichen, einschließlich der Medizin und Toxikologie. Eine gemeinsame Biomarker oxidativ geschädigten DNA 8-oxo-7,8-dihydro-2'-Desoxyguanosin (8-oxo-dGuo; oft fälschlicherweise bezeichnet als 8-Hydroxy-2'-Deoxyguanosin (8-OH-dGuo oder 8 oxo-dG)). Mehrere Protokolle für 8-oxo-dGuo Messung durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit elektrochemischer Detektion (HPLC-ED) sind beschrieben worden. Diese wurden jedoch in erster Linie um gereinigte DNA mit Prooxidantien behandelt angewendet. Darüber hinaus aufgrund methodischer Unterschiede zwischen Labors, vor allem aufgrund der Unterschiede in Analysegeräten, die Annahme von veröffentlichten Verfahren zum Nachweis von 8-oxo-dGuo durch HPLC-ED erfordert eine sorgfältige Optimierung von jedem Labor. EINumfassendes Protokoll, wie einen Optimierungsprozess beschreiben, fehlt. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Erfassung von 8-oxo-dGuo durch HPLC-ED aus kultivierten Zellen oder tierische Gewebe beschrieben, in DNA. Sie veranschaulicht, wie die DNA-Aufreinigung kann leicht und schnell optimiert, um unerwünschte DNA-Oxidation, die während der Probenvorbereitung erfolgen kann minimiert werden. Dieses Protokoll zeigt, wie zu erkennen 8-oxo-dGuo in kultivierten menschlichen alveolaren Adenokarzinomzellen (dh, A549-Zellen) mit dem Oxidationsmittel KBrO 3 behandelt und aus der Milz von Mäusen, die polycyclische aromatische Kohlenwasserstoff Dibenzo (DEF, p) ausgesetzt Chrysen (DBC, früher bekannt als Dibenzo (a, l) pyren bekannt, DALP). Insgesamt zeigt diese Arbeit, wie ein HPLC-ED-Methodik kann leicht für die Erfassung von 8-oxo-dGuo in biologischen Proben zu optimieren.
Introduction
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS), dessen stationäre Ebenen können während viele pathologische Zustände und xenotoxic Stoffwechsel zu erhöhen, tragen zu einer erhöhten Häufigkeit der oxidative DNA-Schäden. Unter mehreren möglichen Nukleobasen Oxidationsprodukte können oxidative DNA-Schädigung leicht unter Verwendung der stabilen Marker gemessen werden 8-oxo-7,8-dihydro-2'-Desoxyguanosin (8-oxo-dGuo), die eine der oxidierten Formen 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo ist das am häufigsten vorkommende DNA-Läsion 2, und deshalb wurde auf größerem Detail als DNA Oxidations Biomarker trotz der Existenz von mehreren DNA-Oxidationsprodukte 3 untersucht. Beim Menschen kann dieser Schaden über Basenexzisionsreparatur von 8-Oxoguanin Glycosylase 1 (hOGG1) 4 repariert werden. Wenn unbe unrepaired können 8-oxo-dGuo zur Bildung von Basenpaar-Substitutionsmutationen (dh G-Trans V) beitragen 4. Wichtig ist, dass 8-oxo-dGuo ein etablierter Marker for DNA-Schaden in Bezug auf die Initiierung und Förderung der Karzinogenese 2. Daher genaue Quantifizierung von 8-oxo-dGuo ist eine nützliche und wünschenswerte Biomarker für oxidativen DNA-Schädigung 5.
Es gibt weit verbreitete Verwirrung in der Literatur über den richtigen Namen für oxidativ beschädigte Formen der 2-Desoxyguanosin und darüber hinaus der richtige Name der Verbindung (en) routinemäßig als Biomarker für oxidative DNA-Schäden 6 gemessen. Die 6,8-Diketo-und 6-Enol, 8-keto tautomeren Formen der 8-oxo-dGuo (in 1 gezeigt), sind die beiden wichtigsten Tautomere in der Literatur diskutiert 5,7. Der 6,8-Diketo-Form ist das Hauptproblem bei einem physiologischen pH-Wert von 7,4 und ist das bekannteste DNA Oxidationsprodukt 7. Deshalb 8-oxo-dGuo ist nicht 8-Hydroxy-dGuo die am besten geeignete Namen für diese Oxidationsprodukt 6. Es ist auch wichtig zu beachten, dass 2-Desoxyguanosin (dGuo) anstatt nucleobase Guanin (Gua) oder Ribonukleosid Guanosin (Guo) verbunden sind, wird von den meisten Verfahren 6 erfaßt.
Genaue Detektion und Quantifizierung von 8-oxo-dGuo ist schwierig aufgrund: i) Schwankungen bei der Verdauung der DNA-Probe, ii) Eine zufällige Oxidation dGuo bis 8-oxo-dGuo, die während der Probenvorbereitung erfolgen kann, und iii) die Notwendigkeit für eine effektive Überprüfung der analytischen HPLC-ED Methode 8. In diesem Protokoll zur Erreichung i) durch das Bereitstellen von Bedingungen, günstig für vollständige DNA-Verdauung und ii) durch die Aufnahme Metallchelatbildner und Chelator-behandelten Lösungen und einer speziellen DNA-Isolierung Reagenz, während iii) nur teilweise durch die Aufnahme von adressierten gerichtet wir positive Kontrollen und somit vorausgesetzt, daß die Methode zum Aufspüren von 8-oxo-dGuo in biologischen Proben ist. Weitere Bestätigung über den Rahmen dieses Dokuments. Wir sind jedoch zuversichtlich, dass dieses Protokoll wird den Interessenten helfenBenutzer bestimmen, in welchem Ausmaß die sie benötigen, um das Protokoll formal validieren, abhängig von ihren Zwecken. Eine Liste der Schritte für die formale Validierung des Verfahrens erforderlich ist ferner vorgesehen. Während der Entwicklung und Bereitstellung eines Verfahrens zur 8-oxo-dGuo Erkennung, veröffentlicht wurden Methoden überprüft und konsolidiert. Somit beseitigt dieses Verfahren die Notwendigkeit, Informationen aus verschiedenen veröffentlichten Quellen, die oft fehlen wichtige experimentelle Details während sie auch eine schnelle und einfache Methode zur Messung, wenn das Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von 8-oxo-dGuo wurde erfolgreich angenommen sammeln. Diese angepasste Verfahren wurde eingesetzt, um DNA-Proben erfolgreich analysieren aus kultivierten Zellen und murinen Gewebe. Dieses Video Artikel werden andere Gruppen die Schaffung eines wirksamen Verfahrens zur sicheren Erkennung und Quantifizierung von 8-oxo-dGuo durch HPLC-ED unterstützen.
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Protocol
Stellen Sie sicher, dass alle Tierhaltung, Unterbringung, Handhabung und Experimentieren, um lokale Regeln und Vorschriften einhalten und dass Experimente Protokolle werden vor Antritt der Studie zugelassen. Bei den beschriebenen Versuchen wurden die Tierpflege, Handhabung und Behandlung von der Health Canada Animal Care Committee genehmigt. Siehe "Reagenzien Tabelle" zur Information der Lieferanten.
1. Sammeln von biologischen Proben
- Zellen oder Tiergewebe
- Wachsen menschlichen alveolaren Adenokarzinom A549 Zellen in F12-K-Medium, das 10% fötales Rinderserum, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
- Samenzellen bei etwa 1 Millionen Zellen pro 10 cm-Platte. Für jeden Versuch, mit einem Satz von 12 Platten in total (drei Platten pro biologische Replikation x vier Dosen), um genügend DNA (80 ug) sorgen für enzymatischen Abbau und HPLC-Analyse.
- Wenn die Zelldichte größer als ca. wirdimately 70% der Plattenfläche, wird das Medium entfernt und wäscht die Zellen zweimal mit 4 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS), pH 7,4.
- Für kultivierte Tierzellen verwenden KBrO 3 als positive Kontrolle.
Hinweis: eine positive lineare Beziehung zwischen Konzentration und KBrO 3 8-oxo-dGuo Frequenz wurde in der Literatur 9 gemeldet. - Löse KBrO 3 in PBS. Sicherzustellen, dass die Endkonzentration in der Zellkulturmediums größer als 1 mm bis zu einem statistisch signifikanten Anstieg der 8-oxo-dGuo relativ zu unbelichteten Zellen zu erhalten. Füge das gleiche Konzentration an KBrO3 zu jeder Platte in der Reihe (beispielsweise 12 10 cm-Platten).
- Die Platten für 3 Stunden bei 37 ° C. Entfernen Sie die Medien und einmal mit PBS waschen.
- 1 ml Trypsin-Lösung (Stammkonzentration von 2,5 g / ml) und Inkubation für 3 min bei 37 ° C.
- Mit 4 ml PBS waschen, sammeln Sie die Zellen, die aus jeweils in einem einzigen 50 ml konischen polystyr eingestelltene-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 1.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
- Entfernen PBS und speichert das Zellpellet bei -80 ° C bis zur weiteren Analyse. Künstliche DNA-Oxidation kann durch nukleare Isolation minimiert werden, wie an anderer Stelle 10 beschrieben.
- Tierischen Geweben
- Dosis Tiere nach Bedarf. Aus diesem Protokoll Erwachsenen (9 Wochen alt) zu behandeln männliche Muta Maus durch orale Gabe täglich für drei aufeinanderfolgende Tage mit 20 mg DBC / kg Körpergewicht pro Tag in Olivenöl aufgelöst.
HINWEIS: Diese transgene Tier Häfen entwickelt λ-Bakteriophagen und Mutation Reportergens lacZ aus E. coli 11 wird für transgene Nager Mutationsassays 12 verwendet. - Zuführen Tier Nekropsie zB die Mäuse anästhesiert kann mit Isofluran und dann über zervikale Dislokation gefolgt von Brusthöhle Öffnung euthanasiert. Unmittelbar Blitzeis Gewebe in flüssigem Stickstoff. Speicher Geweben bei -80 ° C bis zur Analyse.
Anmerkung: Der Zeitpunkt der Euthanasie nach der Behandlung kann eine weitere wichtige Variable sein (zum Beispiel war DNA Oxidation maximal bei 72 h nach der Lärmbelastung im Gehirn der Ratte und der Leber 13).
- Dosis Tiere nach Bedarf. Aus diesem Protokoll Erwachsenen (9 Wochen alt) zu behandeln männliche Muta Maus durch orale Gabe täglich für drei aufeinanderfolgende Tage mit 20 mg DBC / kg Körpergewicht pro Tag in Olivenöl aufgelöst.
2. DNA-Extraktion, Fällung und Waschen (für Gewebe gehen Sie direkt zu 2.2)
- Homogenisieren der gesammelten Zellen in einem 50 ml konischen Polystyrolzentrifugenröhrchen mit 1 ml DNS-Isolierungsmittel, wie DNAzol. Verwenden Sie einen 1.000 ul Pipettenspitze, um die Zellpellet verteilen, bis die Lösung homogen ist. Übertragen Homogenat in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren auf Eis für 10-20 min. Fahren Sie mit 2.3.
- Homogenisieren 15-20 mg Gewebe in einem 1 ml Hand Teflon Glashomogenisator, enthaltend 500 & mgr; l DNA-Trennmittel enthält. Gently heben und senken Homogenisator für ca. 1 min; weicher Gewebe weniger Zeit erforderlich. Schonende Behandlung sorgt für weniger Scherung der DNA. Lagern Sie das Homogenisat auf Eis für etwa 10-20 min.
- Kügelchendas Homogenat durch Zentrifugation für 10 min bei 10.000 × g und 4 ° C in einem 1,5 ml konischen Zentrifugenröhrchen.
- Der resultierende Überstand vorsichtig in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Aufmerksamkeit zahlen, um zu vermeiden, Kontakt mit dem Pellet zu übertragen.
- Auszufällen DNA aus dem Homogenat durch Hinzufügen von 0,5 ml 100% EtOH pro 1 ml Homogenat. Kehren Rohre 10 Mal zu isolieren Reagenz zu gewährleisten und EtOH sind ausreichend gemischt.
- An diesem Punkt ist die DNA Präzipitat viskose, Spule es auf eine Kunststoffpipettenspitze (beispielsweise mit einem maximalen Fassungsvermögen von 200 & mgr; l) und dann in ein neues 1,5 ml konischen Zentrifugenröhrchen überführt.
HINWEIS: Kurze Zentrifugation verwendet werden, um jegliches verbleibende Lysat aus der isolierten DNA zu entfernen.
(DNA Wash und Solubilisierung) - 1 ml 75% EtOH zu der isolierten DNA. Hängen Sie die DNA-Pellet gründlich durch Umdrehen der Röhrchen 10 Mal.
- Dekantieren Sie vorsichtig das Ethanol aus der Tube. Stellen Sie sicher, dass the DNA pelle klebt an der Seite des Rohres. Die Rohre vertikal zu speichern für 1-2 min und mit einer Pipette, um überschüssiges EtOH vom Boden des Rohrs zu entfernen.
- Wiederholen Sie die DNA waschen einmal, und entweder speichern Sie die Probe in EtOH bei -20 ° C (mehrere Monate stabil) oder unmittelbar um die Verdauung zu gehen.
- Aufzulösen DNA in Verdauungspuffer (nachstehend beschrieben) und dann unter Verwendung von Standard quantifizieren spektroskopische Methoden (dh die Absorption bei 260 nm unter Verwendung von ND-Spektralphotometer).
3. enzymatische Verdauung
- Vorbereiten "Verdauungspuffer" durch Kombination und geeignete Mengen (je nach der Anzahl der Abtastwerte zur Verdauung) von 50 mM monobasisches Natriumphosphat (enthaltend 2,0 mM KCl, 1,0 mM Desferal (DFO) und 200 mM MgCl 2) mit 50 mM dibasisches Natriumphosphat (auch enthaltend 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO und 200 mM MgCl 2). Jede Probe erfordert 4.0 ul ein- und 17,0 ul dibasische Phosphatlösung. <li> Entfernen Sie alle verbleibenden EtOH aus dem Boden der Röhre und der Luft trocknen Proben für ca. 5 min. Stellen Sie sicher, dass die DNA nicht vollständig austrocknen.
- Man löst 80 ug extrahierten DNA in 21,0 ul des Verdauungspuffer, fügen Sie 1 Einheit DNase I in 2,0 ul der Verdauung Puffer gelöst.
- Wirbel leicht um ein gründliches Mischen zu erreichen und Inkubation für 1,5 h bei 37 ° C.
- Am Ende der Inkubationszeit hinzuzufügen 216,4 ul 50 mM dibasisches Natriumphosphat-Lösung, enthaltend 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO und 200 mM MgCl 2.
- Bereiten Sie "Verdauungspuffer-2" durch die Kombination von einem Volumen Verdauungspuffer mit neun Bänden von dibasischen, 50 mM Na-Phosphat (mit 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO und 200 mM MgCl 2).
- Hinzuzufügen 0,025 Einheiten der Phosphodiesterase (PDE) I-Enzym in 16,3 ul Verdauungspuffer-2. Pipette nach oben und unten für einige Sekunden, dann Wirbel leicht, um eine gute Durchmischung zu erreichen und Inkubation für 1,5 Stunden bei 37 ° C.
- Hinzufügen 00,4 Einheiten alkalischer Phosphatase (AP) in 8,0 & mgr; l Verdauungspuffer-2. Pipette nach oben und unten für einige Sekunden, dann Wirbel leicht, um eine gute Durchmischung zu erreichen und Inkubation für 1,5 Stunden bei 37 ° C. In 33,0 ul HPLC MeOH.
- Laufen verdauten DNA-Proben mittels HPLC, wie unten beschrieben oder bei -80 ° C beschrieben ist, direkt bis zum Gebrauch, um die Oxidation zu minimieren. HINWEIS: Die 1,5-Stunden-Schritten Verdauung hier vorgeschlagen werden auf solchen Abständen anhand anderer Stelle vorgeschlagen, 9 und auf den Erkenntnissen, dass ähnliche Protokolle zu erreichen vollständige DNA-Verdauung 9. Daher wurde angenommen, dass der einzige begrenzende Faktor zu erreichen vollständige Verdauung war Zeit und Enzymhemmung und Probeninhomogenität vernachlässigbar waren.
4. HPLC Run: Herstellung der mobilen Phase, Besetzung Installations- und Wartungs
- Verwenden Reinstwasser, um alle Pufferlösungen vorzubereiten und mit hoher Klebkraft Harz (zB Chelex 100 behandelt: Styrol divinylbenzene Copolymer mit Iminodiacetat Ionen, die Chelat-Übergangsmetalle mit hoher Affinität) an Metallkontamination und DNA-Oxidation während der Probenvorbereitung zu minimieren.
- Vorzubereiten 250 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,2. Verwenden ein Verhältnis von 1: 3,6957 zweibasisches Natriumphosphat (FW = 177,99 g / mol) Natriumphosphat (FW = 119,98 g / mol) monobasischen.
Beispiel: Daher ist für einen 3 l-Stammlösung kombinieren 70,81 g ein- und 28,43 g von zweibasigen Pulver, Wasser hinzufügen bis zu beispielsweise 2,8 L und überprüfen, dass der pH-Wert der Lösung beträgt 6,2. Der pH-Wert mit 250 mM Mono oder Natriummonohydrogenphosphat-Lösungen, durch konzentrierte Säuren oder Basen getrennt und nicht vorbereitet. Hinzuzufügen 2,24 g KCl in einer Konzentration von 10 mM KCl erhalten. - Vorbereitung der mobilen Phase in drei Flaschen, mindestens 1 L jeweils enthalten: Lösungsmittel B - HPLC-grade Methanol, Lösungsmittel - B hochreinem Wasser und Lösungsmittel C - Phosphatpuffer von Schritt 4.2. Legen HPLC mobilen Phase Zufuhrschlauch in die Flaschen; remaining Röhren müssen auch in einer der Flaschen (zB Lösung C) getaucht und grundiert, selbst wenn sie nicht für das Mischen erforderlich.
- Während des Laufs, mischen Sie die mobile Phase-Lösungen als 6% Lösemittel A, 74% Lösungsmittel B und 20% Lösungsmittel C bis zur endgültigen Lösung von 50 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 6,2) mit 2,0 mM KCl, und 6% MeOH zu erreichen.
- Nehmen Sie die Elektrode aus der elektrochemischen Detektor, zerlegen und reinigen Referenz und Arbeitselektroden mit den Elektrodenreinigungslösungen und Polierscheiben vom Hersteller empfohlen. Spülen Sie die gereinigten Oberflächen mit hochreinem Wasser, wischen Sie das Wasser sanft ab und sorgen für die Detektor trocken, das System ist.
- Montieren Sie den Detektor und eine Verbindung der mobilen Phase Einlass zu der Elektrode. Schalten Sie die Strömung und damit der mobilen Phase zu füllen die Elektrode vor dem Anbringen der Steckdose mobilen Phase Rohr. Installieren Sie eine neue Spalte vor dem Start-Optimierung. Stellen Sie sicher, dass der Einbau in die richtige Richtung und follows Empfehlungen ist alles Herstellers.
- Schalten Sie die HLPC Instrumentierung weit vor (beispielsweise 1 Stunde) der Probenanalyse, um ein Gleichgewicht zu ermöglichen und Grundrauschen zu reduzieren. Siehe Tabelle 1 für vorgeschlagenen Einstellungen; der Gegendruck Grenzwert sollte bis 3000 psi eingestellt werden, um Beschädigungen zu vermeiden Spalte. Schalten Sie den Entgaser. Fahren Sie mit der Grundierung der Pumpen und die Einrichtung Lösungsmittelgradienten.
- Chemische Primzahl die Pumpen nach den Anweisungen des Herstellers. Dies tun, um die Linien zu benetzen, wenn eine mobile Phase ersetzt wurde, oder der Schlauch Einlaß der Luft ausgesetzt ist.
- Suchen Sie die Priming-Disc und legen Sie eine 10-15 ml Kunststoffspritze gibt. Stellen Sie sicher, die Spritze vollständig vor dem Öffnen der Zeile eingefügt. So öffnen Sie die Zeilen schalten Sie einfach die Scheibe gegen den Uhrzeigersinn für eine Umdrehung.
- Starten Sie den prime mit dem entsprechenden HPLC Schnittstellenauswahl. Ziehen Sie die Spritze, um Flüssigkeit in die Linien zu zeichnen. Sobald Flüssigkeit fließt, ist die wichtigste vollständig; Lassen Sie das Programmschliessen Sie die Sicht. Wiederholung für alle Linien (in der Regel vier, abhängig von dem Gerät).
- Alternativ nassen prime, wenn die Linien sind bereits aus einer früheren Trocken prime benetzt (siehe unten).
HINWEIS: Wenn eine große Menge an Zeit zwischen den Anwendungen (zB 2 Wochen) abgelaufen ist, wird ein trockener prime empfohlen. - Ändern der Zusammensetzung der Lösungsmittel mit mobiler Phase Komponenten miteinander unter Verwendung des HPLC-Benutzeroberfläche 25%. Von der Schnittstelle, wählen Sie die Option "Direct Function", und wählen Sie "Wet Prime" option. Dies wird prime alle Linien gleichzeitig.
- Stellen Sie sicher, alle die Luft aus dem System durch die Beobachtung der nassen Hauptleitung, da sie die Abfallbehälter gelangt. Nach einem guten prime, sicherzustellen, dass keine Blasen in der Linie nach links. Wenn Blasen bestehen, wiederholen Grundierung.
- Sobald die Pumpe gefüllt ist, beginnen Bewegen der HPLC mobilen Phase. Verwenden die HPLC-Schnittstelle, um die Zusammensetzung der mobilen Phase bis 6% Methanol (Lösungsmittel A) und 94% manuell ändernWasser (Lösungsmittel B), und wählen Sie eine Durchflussrate von 0,9 ml / min. Sie 5 min, um jede Methanol aus dem Säulenreinigungsschritt zu löschen.
- Nach 5 min verändern die Zusammensetzung bis 6% Methanol (Lösungsmittel A), 74% Wasser (Lösungsmittel B), 20% Puffer (Lösungsmittel C), erhöhen die Durchflussrate auf 1,0 ml / min. Stellen Sie andere Parameter, wie in Tabelle 1 zusammengefasst, und setzen Sie die Rückdruckgrenze auf 3000 psi bis Spalte Schäden zu vermeiden.
HINWEIS: Mögliche Probleme mit HPLC-Setup sind Grundlinie treiben, Split peak und verminderte Signalintensität. Diese können in der Regel durch die Reinigung der Spalte nach jedem Gebrauch, häufige Reinigung der Elektrode, und sicherzustellen, dass die Pufferlösungen frei von Verunreinigungen sind überwunden werden (beispielsweise Partikel oder mikrobielle Wachstum). - Führen Sie die mobile Phase für etwa 1-1,5 h, um eine stabile Grundliniensignal zu erzielen.
- Mit Hilfe des Instruments Software-Schnittstelle, wählen Sie Parameter wie in Tabelle 1 angegeben und auf 15 Minuten Laufzeit. Spritzen Sie das sample. Verwenden Sie erhöhte Laufzeiten für komplexe Stichproben (bestimmen diese empirisch durch Beobachtung der Gegenwart oder Abwesenheit von Gipfeln jenseits der 15-Minuten-Intervall).
HINWEIS: Instrument-Software ermöglicht die Programmierung der Probenlaufbedingungen und Setup für Autosampler. - Nachdem die Durchläufe abgeschlossen sind, schalten Sie die Detektorzelle mit Hilfe der Schnittstelle des Detektors. Es ist wichtig, den Empfehlungen des Herstellers in Bezug auf Ausschalten des Detektors, wie unsachgemäße Behandlung folgen und Abfahren kann das Gerät beschädigen. Schalten Sie nicht die Zelle durch Umschalten der Rückseite des Detektors, da dies das Gerät beschädigen.
- Die Zusammensetzung der mobilen Phase bis 6% Methanol und 94% Wasser manuell ändern. Führen Sie für 5 min.
- Die Durchflussrate manuell zu reduzieren, um 0,7 ml / min, sofort zu ändern, die Zusammensetzung zu 50% MeOH und 50% Wasser. Laufen über mindestens 20 min. Wenn Sie diesen Schritt für die empfohlene Zeit kann zu Schäden an der Säule und den Detektor führen laufen. Schalten Sie den Fluss, eind schalten Sie dann den Entgaser.
5. Herstellung von Standards
- Vorbereitung der mobilen Phase Puffer wie in den Schritten 4,1-4,3 oben beschrieben. Es ist wichtig, die HPLC mobilen Phase zur Herstellung von Standards zu verwenden, um Peaks aus Mischen unterschiedlicher Lösungen nach der Probeninjektion zu vermeiden.
- Verdünnte diese Lösung ein in fünf mit hochreinem Wasser vor der Verwendung, und die endgültige Lösung darf 6% MeOH enthält.
- dGuo Norm
Hinweis: Hochoxidationspotential für dGuo Erkennung erforderlich ist, kann das Risiko der Messung störenden elektroaktiven Verbindungen erhöhen. Dies kann durch die überprüft werden, beispielsweise eine Standardkurve von UV Detektion dGuo bei 260 nm und Vergleich mit der Standardkurve mit EC Detektion erstellt. Wenn beide gut auszurichten (zB Ergänzungs Abbildung 1) und die Probenmatrix Effekte berücksichtigt, kann man mit dGuo Detektion durch UV bei 260 nm gehen, anstatt EC Detektion.- Vortex mit hoher Geschwindigkeit, bis dGuo vollständig auflöst. Dies ist die primäre Lager; bei -20 ° C für mehrere Wochen.
- Um die Sekundär dGuo Lager (0,5 mm) zu erstellen, zu verdünnen 143 ul primären dGuo Lager in 857 & mgr; l HPLC mobilen Phase. Lagerung auf Eis bis zum Gebrauch und bereiten täglich frisch.
- Stellen Sie weitere Verdünnungen, um eine Standardkurve zu erstellen (zB Tabelle 2). Shop-Lösungen auf Eis und bereiten täglich frisch. Führen Standards in Reihe mit experimentellen Proben.
- Vor ausführen, variieren die Detektorspannung mit der höchsten Konzentration der Stamm, um eine optimale Spannung zu finden.
- 8-oxo-Norm dGuo
- Messen 1,0 mg 8-oxo-dGuo in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 0,1 ml HPLC MeOH. Vortex auf hoher Geschwindigkeit, bis 8-oxo-dGuo vollständig auflöst. Dies ist die primäre Lager von 8-oxo-dGuo. Lagerung bei -20 ° C für sevrere Wochen.
- In einem separaten Röhrchen, kombinieren 2,9 ul primären Lager und 997,1 ul HPLC mobilen Phase Puffer, Wirbel. Dies ist die sekundäre Lager (10.000 Nm).
- Um eine funktionierende Lösung für die Standardkurve (250 nM) zu erstellen, kombinieren 24,4 ul sekundären Lager und 975,6 ul mobiler Phase Puffer.
- Führen Sie weitere Verdünnungen, die erforderlich ist, um eine Standardkurve zu erstellen Lösungen (zB Tabelle 3). Shop-Lösungen auf Eis und bereiten täglich frisch. Führen Standards mit den experimentellen Proben.
- Quantifizierung
- Integrieren Sie die Fläche unter der Kurve für beide 8-oxo-dGuo und dGuo unter Verwendung von Standard-Software (als Teil der HPLC-Computer-Schnittstelle, siehe Zusatz 2A).
- Konstruieren Standardkurve (bekannte Konzentration jedes Analyten vs. Fläche unter der Kurve (Ergänzende 2B). Unter Verwendung der Gleichung der Standardkurve, wird das Verhältnis für 8-oxo-dGuo / dGuo für jede Probe.
6. Agarose-Gel-Elektrophorese
HINWEIS: Die Agarosegelelektrophorese ausgeführt, um die Vollständigkeit der DNA Verdau verifizieren.
- Bereiten 50x Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE), die durch Auflösen von 242 g Tris-Base (FW = 121,14) in 750 ml Reinstwasser. In 57,1 ml Eisessig und 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0; EDTA wird vollständig zu lösen, wenn der pH der Lösung auf 8,0 mit zB NaOH) und fügen Reinstwasser auf ein Endvolumen von 1 L. Lagern bei RT, Verdünnen dieser Lösung 50x vor der Verwendung.
- Abwiegen 1 g Agarose und löst ihn in 100 ml 1x TAE-Puffer, Heizung in der Mikrowelle für 1-2 min. Schutzbrille und Schutzausrüstung, um den Kontakt mit kochendem Agarose zu vermeiden.
- Die Lösung wird nach unten, bis ca. 50 ° C werden 5 & mgr; l Ethidiumbromid (Achtung: mutagen) und gießen Sie sie in das Agarose-Gel Laufgerät. Setzen Sie den Kamm.
- Warten, bis die Lösung erstarrt gießen TAE-Puffer über das Gel und Laden der Proben (Volumen hängt von der Kammgröße, typischerweise 10-20 ul DNA-Probe geladen, gemischt mit 6x ausgeführt Farbstoff sichtbar zu machen und zu erleichtern Beladung).
- Die Elektrophorese, bis der Farbstoff wandert etwa 2/3 der Länge des Gels (zB 45 min bei 150 V). Visualisieren DNA-Banden unter dem UV-Licht.
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Representative Results
dGuo wurde beobachtet, dass eine Retentionszeit von 4,7 min wohin 8-oxo-dGuo hatte eine Retentionszeit von etwa 6,4 min (2A und B). Es gibt etwa 1000-facher Unterschied in den Peakhöhen der beiden Analyten, wie in 2C zu sehen. Voltammogramme für 8-oxo-dGuo und dGuo wurden durch Ausführen von Standards bei einer Arbeitsspannung im Bereich von 0,2 bis 1,1 V. erhaltene optimale Arbeitspotential für 8-oxo-dGuo bestimmt wurde auf +0,5 V und +0,9 betragen V für dGuo (Abbildung 3). Diese Potentiale sind in Übereinstimmung mit anderen in der Literatur beschriebenen 14,15 Glaskohlenstoffelektroden. Die Nachweisgrenze und der Dynamikbereich von 8-oxo-dGuo und dGuo elektrochemischer Detektion wird berichtet, dass in der Femtomol und Nanomol Bereich jeweils 8,9 betragen. Standardkurven für dGuo und 8-oxo-dGuo sollte täglich ausgeführt werden, um eine lineare Detektion in einem geeigneten Konzentrationsbereich zu gewährleisten und die ordnungsgemäße durchzuführendes Instruments stand (Figur 4). Standardkurven werden durch Auftragen der Peakfläche als Funktion bekannter Analytkonzentration (Supplementary Abbildung 2), die man, um die Analyt-Konzentration in den Proben aus dem aus den Standardkurven erzeugt Gleichung berechnen können konstruiert.
Vollständige DNA-Verdauung für genaue Messungen von 8-oxo-dgua Frequenz und mehreren genomischen DNA-Verdauungsverfahren erforderlich sind vorgeschlagen worden 8,15,16. Soweit erforderlich, kann die Wirksamkeit der DNA-Extraktion und die Verdauung unter Verwendung von Agarose-Gel-Elektrophorese (5A) und HPLC-ED (5B) überprüft werden. Lanes mit offensichtlichen DNA-Abstrich in 5A (zB Bahnen 2, 4, 6, 9, 11 und 13) zeigen das Vorhandensein von unverdaute DNA während Proben mit verdauten DNA-Fragmente laufen an der Gel und lag damit unentdeckt. Die Hochebene in 5B zeigt an, dass weitere incubatian der DNA-Verdauungsenzyme über 1,5 h nicht in größeren Menge dGuo detektiert, was darauf hindeutet nahezu vollständige Verdauung nach 1,5 h führen. Darüber hinaus wurden sowohl Agarose-Gelelektrophorese und HPLC-ED verwendet werden, um die Nützlichkeit der hier eingesetzten Phosphatbasis DNA-Verdauungspuffer testen. Dieser Puffer ist dem mobilen HPLC-Phase abgestimmt ist und nicht zu unerwünschten Detektorrauschen, die auf das Mischen von unterschiedlichen Lösungen (Daten nicht gezeigt). Daher schlug der Schalter aus dem Puffer in der Literatur (zB Tris-HCl 8) in Natriumphosphatpuffer für dieses Protokoll (linke gegen rechte Seite von 5A) empfohlen. Bitte beachten Sie, dass die zugrunde liegenden Annahmen für die Optimierung von DNA Verdauung waren, dass Enzymhemmung und Proben Inhomogenität zu vernachlässigen und Aufschlusszeit war der einzige limitierende Faktor, wie oben angegeben. Eine Möglichkeit, dass unvollständige DNA Verdauung ergab Fragmente, die zu klein dete zu seinauf dem Agarosegel Reste cted. Obwohl eine solche systematische Fehler würde alle Proben gleichermaßen betreffen weitere Experimente (zB Behandlung von Kulturzellen mit einem radiomarkierten Prooxidans 10) durchgeführt werden könnte, vollständig auszuschließen, eine solche Möglichkeit.
Im Gegensatz zu herkömmlichen Lösungen, die verdaute DNA, entweder von isolierten Zellen oder Geweben der Maus, produzierte mehrere zusätzliche Peaks (6A und 6B). Diese wurden entfernt von den 8-oxo-dGuo und dGuo Peaks, aber Spiking-Versuche als Teil Validierung im Diskussions umrissen sind erforderlich, um zu prüfen, ob zusätzliche Peaks (dh Probe Verunreinigung auf Matrixeffekte, zum Beispiel) interferieren Quantifizierung . Die 8-oxo-dGuo Peak wurde durch Korrespondenz der Retentionszeit mit dem Standard bestätigt; und erhöhen zudem in der 8-oxo-dGuo Peak für Proben aus Zellen oder Tiere, die pro-oxidativen Behandlung unterzogen (Figur 7). Pro-Oxidationsmittel KBrO 3 nimmt an Ein-Elektronen-Abstraktion von Guanin, die 8-oxo-dGuo Bildung 17 führt. Es ist bemerkenswert, dass in Abwesenheit des pro-oxidativen Stress, 2,4 Moleküle von 8-oxo-dGuo pro 10 7 dGuo wurden A549-Zellen (7A) detektiert. Dies ist vergleichbar mit 4,5 Molekülen von 8-oxo-dGuo / 10 7 dGuo Verwendung eines alternativen, Massenspektrometrie basierenden Ansatz, um mögliche Mängel der HPLC-ED Methode 9 Adresse im beobachteten A549-Zellen nachgewiesen. DBC-Behandlung (dh täglich 20,0 mg DBC / kg Körpergewicht pro Tag für drei Tage) erhöhte sich um 8-oxo-dGuo Ebenen in der Milz der Maus DNA. Auch dies ist ein erwartetes Ergebnis, da ROS ist bekannt, während des Metabolismus von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen in vivo 8 hergestellt werden. Die relativen Mengen an 8-oxo-dGuo in der Milz von unbelasteten Tiere waren 8,3-9,4 8-oxo-dGuo / 10 6 dGuo (7B), die in einem ausgezeichneten agreemen istt mit veröffentlichten Werten von vier 8-Oxo-dG Moleküle / 10 6 dGuo in murinen Milzzellen unter Standardbedingungen durch HPLC-ED 18 gemessen. Die 6 und 7 zeigen, dass die Konzentrationen von 8-oxo-dGuo oberhalb der Basislinie sind sehr klein . Wenn also DNA wird auf ein niedrigeres Niveau oxidiert als hier beobachtet werden, können die Pegel von 8-oxo-dGuo nicht zu unterscheiden von der Basislinie, die im Sinn von potenziellen Nutzern Protokoll gehalten werden sollte.
Figur 1. Die Struktur von 8-oxo-dGuo und dessen Tautomer 8-OH-dGuo. Man beachte, dass 8-oxo-dGuo anstatt 8-OH-dGuo ist die Haupt Tautomer bei pH 7,4.
Abbildung 2. Die Retentionszeiten für dGuo (A) und 8-Oxo-dGuo (B). HPLC-ED Chromatogramme wurden aus einem 10,0 & mgr; l Injektion von dGuo erhalten (1,0 nmol Gesamtmenge) oder 8-oxo-dGuo (1.000 fmol gesamt) und 0,9 V (A) oder 0,5 V (B) nachgewiesen. Die Retentions Peak für dGuo war ungefähr 4,7 min (A) und 8-Oxo-dGuo war ungefähr 6,4 min (B). Die breite Spitze bei 2-3 min wird wahrscheinlich durch Injektion Störungen aus zwei in (A) beschrieben separaten Injektionen und verursacht und ist unabhängig von der Konzentration von 8-oxo dGuo (dh immer in ähnlicher Intensität vorhanden). (C) Überlagerte Chromatogramme (B) durch UV (260 nm) nachgewiesen. Die Standards wurden am gleichen Tag mit identischen Laufbedingungen führen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3. Optimieren Detektorspannung. (A) Voltammogramm dGuo (Endkonzentration 1 nmol) von HPLC-ED-Analyse in einem Bereich von 0,7 bis 1,1 V. (B) Voltammogramm 8-oxo-dGuo erkannt (Endkonzentration 500 fmol) durch HPLC-Analyse ED in einem Bereich von 0,3-0,7 V. Mittel von drei unabhängigen Experimenten nachgewiesen (n = 3) ± Standardabweichung gezeigt. In einigen Fällen kann die Fehlerbalken sind kleiner als die Zeichnungssymbole.
Figur 4. Standardkurve für dGuo (A) und 8-Oxo-dGuo (B). Zehn Mikroliter entweder dGuo oder 8-oxo-dGuo wurde eingespritzt und durch HPLC-ED bei 0,9 V (A) oder 0,6 V gemessen, (B ). Mittel von drei unabhängigen Experimenten (N = 3) ± Standardabweichung gezeigt. In einigen Fällen Fehlerbalken sind smaller als die Zeichnungssymbolen.
Abbildung 5. Optimierung der DNA die Verdauung. (A) Achtzig ug Lachshoden-DNA wurde wie in Tris-HCl 8 beschrieben verdaut, Glycin-Acetatpuffer (links) oder Natriumphosphatpuffer (rechts). Agarose-Gel-Elektrophorese (1,0%) wurde bei 150 V für 45 min laufen. Spur 1 und 8: DNA-Leiter; Bahnen 2, 4 und 6: unverdaute DNA; Bahnen 3, 5 und 7: verdaute DNA; Bahnen 9, 11 und 13: unverdaute DNA (Phosphatpuffer); Spuren 10, 12 und 14. verdaute DNA (Phosphatpuffer) (B) Lachshoden-DNA (80 ug) wurde hier durch Inkubation mit DNase I, PDE I und AP für 0,5-2,5 h pro jedem Schritt verdaut, in 50 mM Phosphatpuffer, enthaltend Magnesiumchlorid und DFO. Fünfzig Mikroliter von jeder Probe, die 7,3 ug der verdauten DNA wurde durch HPLC (dh 0,9 V und 1 ml / min analysiert flow) zur dGuo zu erkennen. Abbildung zeigt anhand von drei unabhängigen Experimenten (N = 3) ± Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 6. Die Chromatogramme für 8-oxo-dGuo Detektion in kultivierten Zellen (A) oder tierischem Gewebe (B). (A) verdaute DNA aus A549-Zellen, behandelt oder unbehandelt mit KBrO 3. (B) verdaute DNA aus der Milz DBC -behandelten Mäusen. Spitzen nach links verschoben aufgrund der Entfernung der Schutzsäule (aufgrund von Druckaufbau in der Vorrichtung, deren Position mit Standards bestätigt). Standards und Proben wurden am gleichen Tag mit identischen Laufzustand laufens und 10 ml Injektionsvolumina, bei 1 ml / min Volumenstrom und 0,5 und 0,9 V für dGuo und 8-oxo-dGuo sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version der A-Panel; hier für Panel B.
Abbildung 7. Quantifizierung von 8-oxo-dGuo in biologischen Proben. Peaks wurden integriert und im Vergleich zu Standard-Kurven (siehe Zusatz 2 für weitere Details) bis 8-oxo-dGuo Ebenen in DNA aus A549-Zellen, mit KBrO 3 (behandelt ergeben A) oder 8-oxo-dGuo Ebenen in DNA aus der Milz DBC-behandelten Mäusen (B). Sterne (*) zeigen die statistische Signifikanz (p <00,05, one-way Varianzanalyse (ANOVA) (A), Student-t-Test (B)). Mittels dreier (A) oder fünf (B) unabhängigen Experimenten ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt. Die Proben wurden gesammelt 4 oder 24 Stunden nach der 3-Tages-Behandlung.
| Mobile Phase | 50,0 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,2, enthaltend 6% MeOH und 2,0 mM KCl |
| Mobile Phase Flussrate | 1,0 ml / min |
| Spaltentyp | YMC-BASIC mit gebundenen kugelförmigen Silika |
| Säulenlänge | 15 cm |
| Column Innendurchmesser | 3,5 mm |
| Säulentemperatur | 35 ° C |
| Detektortemperatur | 29 ° C |
| Spannungseinstellung für 8-oxo-dGuo | 0,5 V |
| Spannungseinstellung für dGuo | 0,9 V |
| Injektionsvolumen | 10,0 ml |
Tabelle 1. Geräteparameter für die Detektion und Quantifizierung von 8-oxo-dGuo durch HPLC-ED.
| nmol | 100 nM Standard & mgr; | HPLC mobilen Phase, ul | Verdünnung, falten |
| 5 | 300 | 0 | 1 |
| 2.5 | 150 | 150 | 2 |
| 1 | 60 | 240 | 5 |
| 0,5 | 30 | 270 | 10 |
| 0,25 | 15 | 285 | 20 |
| 0.1 | 6 | 294 | 50 |
Tabelle 2 </ Strong> Vorbereitung der Standardkurve für dGuo.
| fmol | 250 nm-Standard, ul | HPLC mobilen Phase, ul | Verdünnung, falten |
| 2500 | 300 | 0 | 1 |
| 1000 | 120 | 180 | 2.5 |
| 500 | 150 | 150 | 5 |
| 250 | 150 | 150 | 10 |
| 100 | 120 | 180 | 25 |
| 50 | 150 | 150 | 50 |
Tabelle 3. Herstellung der Standardkurve für 8-oxo-dGuo.
Sup komplementäre Abbildung 1. Vergleich der elektrochemischen (EC) und UV-basierte Detektion dGuo. Standardkurve wurde für dGuo Nachweis durch elektrochemische Detektion (EC) oder UV-Detektion (260 nm) erstellt. Peakflächen wurden für dGuo Peak bei etwa 4,7 min mit beiden Methoden integriert. N = 3, Mittel ± Standardabweichung gezeigt.
Zusatz Abbildung 2. Quantifizierung dGuo von der Standardkurve. Ein Beispiel für die Verwendung der Standardkurve zur Bestimmung der Konzentration von dGuo gezeigt. (A) = Peakfläche kann durch Integration unter Verwendung von Standard-Software bestimmt werden kann. (B) Diese Informationen werden verwendet, um eine Standardkurve, um die Gleichung der Geraden zu verwenden, um die unbekannte Konzentration des Analyten in der Probe zu berechnen konstruieren.52697 / 52697fig9large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Obwohl 8-oxo-dGuo wurde als nützlicher Biomarker von DNA-Oxidation berichtet, kann seine zuverlässige Quantifizierung eine Herausforderung darstellen. Obwohl mehrere veröffentlichte Verfahren existieren, gibt es einen Bedarf für eine umfassende, beschreibende Übersicht der Protokoll den Forschern ermöglichen, das Verfahren in ihren Laboratorien bereitstellen. Hier präsentieren wir Ihnen einen detaillierten Überblick über eine HPLC-basiertes Protokoll, das neue Benutzer erlauben, ein wirksames Verfahren für 8-oxo-dGuo Nachweis und die Quantifizierung zu etablieren.
Drei Hauptverfahren, die zur Quantifizierung von 8-oxo-dGuo beschrieben wurden. Diese umfassen Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) basierende kommerzielle Kits 19, Flüssigkeitschromatographie / Massenspektrometrie (MS) Verfahren (zB wie anderswo 9 beschrieben und HPLC-ED Methoden, wie sie hier beschrieben sind. ELISA-Verfahren kann von Störungen leiden mit bestimmten Verbindungen, die in biologischen Proben 19. Im Allgemeinen erhaltenen Ergebnisse unter Verwendung ChromatogrAFIK Techniken sind im Vergleich zu ELISA-basierten Methoden 20 die zuverlässiger für 8-oxo-dGuo Quantifizierung. Beim Vergleich der HPLC-ED Methoden mit den MS-basierte Verfahren ist der Vorteil der ersteren relativ billigen Ausrüstung (dh ungefähr um eine Grßenordnung weniger kostspielig als Ausrüstung für die MS-basierte Methoden). Außerdem sind HPLC-MS überlegen HPLC-ED Methoden da erstere nicht anfällig, um mögliche Interferenzen mit elektroaktiven Verbindungen und liefern ein eindeutiges, quantitative Messungen mittels Isotopen 21.
Wurden Bedenken hinsichtlich der Verwendung von herkömmlichen Phenol-Extraktionsverfahren zur Extraktion von genomischer DNA für 8-oxo-dGuo Quantifizierung 22 verwendet werden angehoben. Mehrere Forscher haben festgestellt, dass die Bedingungen der Norm Phenolextraktion verbunden sind, können unerwünschte dGuo Oxidation so vorstellen zunehmender Ausgangswerte 1,9. Um dieses Problem zu, Zell- und anima Adressel genomische DNA extrahiert und unter Verwendung eines modifizierten Protokolls DNAzol 22 gereinigt werden. DNAzol enthält hohe Konzentrationen von Guanidinthiocyanat, und frühere Studien haben 9 Untergrundniveau 8-oxo-dGuo Bildung beim DNAzol wird im Vergleich zu herkömmlichen Phenol- und NaI-basierte Extraktionsverfahren verwendet werden, festgestellt. Das Eisen chelatisierenden Verbindung DFO wurde verwendet, um ROS-Produktion und DNA-Oxidation während der Probenvorbereitung zu minimieren. Wie oben erwähnt, sind die 8-oxo-dGuo Ebenen in unbetonten A549-Zellen (7A) waren sehr ähnlich zu dem, was von einem MS-basierten Methode 13 gemessen. Dies deutet darauf hin, daß die Einarbeitung für die MS-basierten Verfahren 13 beschriebenen Vorsichtsmaßnahmen erlaubt die Minimierung von unerwünschten DNA Oxidation während der Probenvorbereitung und Analyse, um genaue 8-oxo-dGuo Quantifizierung durch HPLC-ED erzielen. Zeitpunkt der Autopsie oder Erntekulturzellen nach Prooxidans Behandlung kann ein weiterer wichtiger Faktor, da hier durch den Rückgang der 8-oxo-dGuo Ebenen gesehenin der Milz bei 24 Stunden gegen 4 Stunden nach der letzten Behandlung (7B). Dies kann auf die Aktivierung des Basenexzisionsreparatur sein, DNA-Schäden zu beseitigen.
Die beiden offensichtlichen Einschränkungen des beschriebenen Verfahrens sind: (1) die Forderung nach relativ große DNA-Mengen (etwa 80 & mgr; g pro Probe zu drei technische Replikate zu erreichen), und (2) eine mögliche Störung von koeluierenden Verbindungen. Es wurde festgestellt, dass nur ein sehr kleiner (dh etwa 15 mg) Stück Milz (etwa 15% der gesamten Gewebegewicht) war ausreichend, um 80 ug DNA zu erhalten, so dass eine ausreichende Menge an Gewebe für andere (zB Genexpressions) Analysen. Die Menge der extrahierten DNA ist ein weiterer kritischer Parameter, artifactual DNA Oxidations 23,24,25 wirkt. Daher arbeiten mit ziemlich großen (~ 80 mg / Probe), die wir vorschlagen, ist hier im Einklang mit früheren Empfehlungen des mit> 30 mg bis artifactual DNA-Oxidation 25 zu minimieren.Für kleinere Geweben (zB den Hippocampus), könnte man nach unten zu skalieren das Protokoll mit 20-30 & mgr; g DNA zu starten, da dies sollte ausreichend für 2-3 läuft. Größere Mengen an DNA vermutlich erleichtert die Auflösung der Peaks über dem Hintergrundrauschen, was jedoch noch experimentell verifiziert werden, wenn potentiell störenden Substanzen können auf einer Fall-zu-Fall-Basis behandelt werden, und es ist wesentlich, dass stets DNA Probe von gleichzeitige in vitro oder in vivo-Behandlung mit einer positiven Kontrolle, die bekanntermaßen oxidative DNA-Schädigung induzieren, (siehe Abbildung 7).
Obwohl das Phosphat in Phosphatpuffer wurde berichtet, dass die Aktivität der alkalischen Phosphatase zu reduzieren, Verfahren Optimierungsexperimente (Abbildung 5), dass Phosphatpuffer ohne weiteres verwendet werden. Da Phosphatpuffer in der mobilen Phase enthalten ist, ist seine Verwendung bei der Probenherstellung verringert Detektorrauschen aufgrund solEntlüftungs Mischen. So Spannung, Pufferzusammensetzung, DNA-Extraktion und die Verdauung optimiert und positive Kontrollen wurden eingeschlossen. Darüber hinaus eine Zusammenfassung erläutert wird, wie diese Variablen kann durch einzelne Laboratorien optimiert werden zur Verfügung gestellt. Unser Ziel war es, eine Methode, die für Speziallabors zur Entwicklung eines Assays zum 8-oxo-dGuo Nachweis und die Quantifizierung gerichtet sein könnte zu produzieren.
Allerdings stellen wir fest, dass die formale Validierung des Verfahrens erforderlich ist, wie im Rahmen der von der Internationalen Konferenz zur Harmonisierung der technischen Anforderungen an Produkte erweitern Registrierung von Humanarzneimitteln (ICH) Validierungen Schritte zur Validierung analytischer Verfahren (dh ICH Q2 (umrissen R1) 26). Kurz gesagt, sollten die Elemente der quantitativen Validierung des Assays zu untersuchen: 1) Genauigkeit (die, indem Proben mit unterschiedlichen Mengen von 8-oxo-dGuo erreicht werden kann Spike-in, 2) Bereich und Linearität (lineare Reaktion auf extended Analytkonzentration; 3) Präzision (Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit); 4) Nachweisgrenze (im allgemeinen der Punkt, an dem das Signal-Rausch-Verhältnis größer oder gleich 2,3; dies kann matrixbedingte) liegen; 5) Grenze (Konzentration, bei der die Antwort trifft einige vorbestimmte Niveaus wie 2 x Standardabweichung der Steuer; kann matrixabhängig) sein; 6) Selektivität / Spezifität (Fähigkeit, die Analyten in komplexen Proben gegenüber ordentlich Lösungen) zu erfassen; 7) Reproduzierbarkeit (die Fähigkeit, das gleiche Ergebnis in verschiedenen Labors mit verschiedenen Betreibern) zu erhalten; und 8), Robustheit und Systemeignung. Da der Zweck der Validierung durch das ICH zu empfehlen ist, um zu zeigen, dass sie "für den beabsichtigten Zweck" und vielen Labors wird wahrscheinlich verschiedene Zwecke, würden die künftigen Nutzer dieses Tests müssen dies in dem Maße als notwendig erachtet zu prüfen. Genaue Quantifizierung von 8-oxo-dGuo ist in der Toxikologie und der molekularen Medizin sin erwünschtce kann das Verständnis dafür, wie oxidativem Stress und insbesondere DNA-Oxidation zu verbessern, ist mechanistisch und empirisch zu gesundheitlichen Beeinträchtigungen verbunden.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Health Canada Genomics Research and Development Initiative (GRDI) und der kanadischen Regulierungsstrategie für die Biotechnologie (CRSB) gefördert. Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details. |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E. coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH) |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
References
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