Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

HPLC Måling av DNA Oksidasjon Biomarker, 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanosin, i dyrkede celler og dyrevev

Published: August 1, 2015 doi: 10.3791/52697
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Environmental Health Science and Research Bureau, Health Canada

Summary

Målet med denne protokollen er deteksjon av DNA oksydasjon markør, 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanosin (8-okso-dGuo) ved hjelp av HPLC-ED, i DNA fra dyrkede celler eller animalsk vev.

Abstract

Oksidativt stress er forbundet med mange fysiologiske og patologiske prosesser, samt xenobiotisk metabolisme, som fører til oksidasjon av biomacromolecules, inkludert DNA. Derfor er effektiv påvisning av DNA oksydasjon viktig for en rekke forskningsdisipliner, inkludert medisin og toksikologi. En vanlig biomarkør av oksydativt skadet DNA er 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanosin (8-okso-dGuo, ofte feilaktig referert til som 8-hydroksy-2'-deoksyguanosin (8-OH-dGuo eller 8 -okso-dG)). Flere protokoller for 8-oxo-dGuo måling ved høytrykks-væskekromatografi med elektrokjemisk deteksjon (HPLC-ED) er blitt beskrevet. Men disse ble hovedsakelig brukt til renset DNA behandlet med pro-oksidanter. I tillegg, på grunn av metodiske forskjeller mellom laboratorier, hovedsakelig på grunn av forskjeller i analyseutstyr, bruk av publiserte metoder for påvisning av 8-oxo-dGuo ved HPLC-ED krever forsiktig optimalisering av hvert laboratorium. Amangler omfattende protokoll, som beskriver en slik optimaliseringsprosess,. Her er en detaljert protokoll som er beskrevet for deteksjon av 8-oxo-dGuo ved HPLC-ED, i DNA fra dyrkede celler eller animalsk vev. Det illustrerer hvordan DNA prøveopparbeidelse kan enkelt og raskt optimalisert for å minimalisere uønsket DNA oksidering som kan oppstå under tillagingen. Denne protokollen viser hvordan oppdage 8-oxo-dGuo i dyrkede humane alveolare adenokarsinomceller (dvs. A549-celler) ble behandlet med oksydasjonsmiddel KBrO 3, og fra milten av mus eksponert for den polycykliske aromatiske hydrokarbon dibenzo (def, s) chrysen (DBC, tidligere kjent som dibenzo (a, l) pyren, DalP). Totalt, illustrerer dette arbeidet hvordan en HPLC-ED metode kan lett optimaliseres for påvisning av 8-oxo-dGuo i biologiske prøver.

Introduction

Reaktive oksygenforbindelser (ROS), hvis steady-state nivåer kan øke i mange patologiske tilstander og xenotoxic metabolisme, bidrar til en økt frekvens av oksidativ DNA skade. Blant flere mulige nukleobaser oksydasjonsprodukter, kan oksidativt DNA-skade lett kan måles ved hjelp av den stabile markør 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanosin (8-okso-dGuo), som er en av de oksyderte former av 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo er den mest tallrike DNA lesjon 2 og har derfor blitt studert i større detalj som en DNA-oksidasjon biomarkør tross for eksistensen av multiple DNA-oksidasjonsprodukter tre. Hos mennesker kan denne skaden repareres via basen excision reparasjon av 8-oxoguanine glykosylase 1 (hOGG1) 4. Hvis venstre ureparert, kan 8-oxo-dGuo bidra til dannelsen av basepar-substitusjons mutasjoner (dvs. G til T transversions) 4. Viktigere er 8-oxo-dGuo en etablert markør for DNA-skader i forhold til initiering og markedsføring av carcinogenesis to. Derfor er nøyaktig kvantifisering av 8-oxo-dGuo en nyttig og ønskelig biomarkør av oksidativ DNA-skade 5.

Det er utbredt forvirring i litteraturen om de riktige navnene for oksidativt-skadede former av to-deoksyguanosin og dessuten riktig navn på forbindelsen (e) rutinemessig målt som en biomarkør for oksidativ DNA skade 6. De 6,8-diketo-enol og 6, 8-keto tautomere former av 8-oxo-dGuo (vist i figur 1) er de to mest fremtredende tautomerer diskutert i litteraturen 5,7. De 6,8-diketo formen er den mest fremtredende formen ved fysiologisk pH-verdi på 7,4, og er den mest fremtredende DNA oksidasjonsprodukt 7. Derfor, 8-oxo-dGuo, er i stedet for 8-hydroksy-dGuo den mest passende navn for denne oksydasjon produktet 6. Det er også viktig å merke seg at 2-deoksyguanosin (dGuo), heller enn nucleobase guanin (Gua) eller ribonukleosid guanosin (Guo), respektivt, blir detektert ved de fleste metoder 6.

Nøyaktig deteksjon og kvantifisering av 8-oxo-dGuo er utfordrende på grunn av: i) variabiliteten i fordøyelsen av DNA-prøven, ii) adventitious oksydasjon av dGuo til 8-oxo-dGuo som kan oppstå under tillagingen, og iii) behovet for effektiv validering av den analytiske HPLC-metode 8 ED. I denne protokollen, som tar sikte på å oppnå vi i) ved å tilveiebringe betingelser gunstige for fullstendig DNA-fordøyelse og ii) ved å inkludere metallchelator og chelatorkonjugert behandlede løsninger og en spesiell DNA-isolering reagens, mens iii) var bare delvis løses ved å inkludere positive kontroller og dermed gjør at fremgangsmåten er i stand til å detektere 8-oxo-dGuo i biologiske prøver. Ytterligere validering er utenfor omfanget av denne artikkelen. Men vi er sikre på at denne protokollen vil hjelpe potensiellebrukerne bestemme i hvilken grad de trenger for å validere formelt protokollen, avhengig av deres formål. En liste av trinn som kreves for den formelle validering av metoden er gitt videre. Under utvikling og utplassering av en metode for 8-oxo-dGuo påvisning ble publisert metoder gjennomgått og konsolidert. Således eliminerer metoden behovet for å samle informasjon fra flere publiserte kilder som ofte mangler viktige eksperimentelle detaljer samtidig som det gir også enkel og rask metode for testing hvis metoden for deteksjon og kvantifisering av 8-oxo-dGuo er vedtatt måte. Dette tilpasses metoden ble benyttet for å kunne analysere DNA-prøver fra dyrkede celler og murine vev. Denne video artikkelen vil hjelpe til andre grupper i å etablere en effektiv metode for pålitelig deteksjon og kvantifisering av 8-oxo-dGuo ved HPLC-ED.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sørg for at alt husdyrhold, bolig, håndtering og eksperimentering holde lokale lover og regler, og at eksperimentering protokoller er godkjent før du begynner å studere. For de beskrevne forsøk ble dyr omsorg, håndtering og behandling godkjent av Health Canada Animal Care komiteen. Se "Reagenser bordet" for leverandørenes informasjon.

1. Samle biologiske prøver

  1. Celler eller animalsk vev
    1. Dyrke humane alveolare adenokarsinom A549-celler i F12-K-medium inneholdende 10% føtalt bovint serum, 100 enheter / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.
    2. Seed cellene på ca 1 million celler per 10 cm plate. For hvert forsøk, bruke et sett med 12 plater totalt (tre plater per én biologisk replikere x fire doser) for å gi nok DNA (80 mikrogram) for enzymatisk fordøyelse og HPLC-analyse.
    3. Når celletettheten blir større enn ca.imately 70% av plateoverflaten området, fjern mediet og vask cellene to ganger med 4 ml fosfat-buffret saltvann (PBS), pH 7,4.
    4. For dyrkede dyreceller, bruker KBrO 3 som en positiv kontroll.
      MERK: En positivt lineært forhold mellom konsentrasjonen KBrO 3 og 8-oxo-dGuo frekvens er blitt rapportert i litteraturen 9.
    5. Oppløse KBrO 3 i PBS. Sikre at sluttkonsentrasjonen i cellekulturmediet er større enn 1 mm for å oppnå en statistisk signifikant økning i 8-oxo-dGuo forhold til un-eksponerte celler. Legge til den samme konsentrasjon av KBrO 3 til hver plate i serien (f.eks 12 10 cm plater).
    6. Inkuber platene i 3 timer ved 37 ° C. Fjern media og vaske en gang med PBS.
    7. Tilsett 1 ml trypsinoppløsning (stock konsentrasjon 2,5 g / ml) og inkuberes i 3 minutter ved 37 ° C.
    8. Vask med 4 ml PBS, samle cellene fra hver satt inn i et enkelt 50 ml konisk polystyrEne sentrifugerør, og sentrifuger ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C.
    9. Fjern PBS og lagre cellepelleten ved -80 ° C inntil videre analyse. Kunstig DNA oksydasjon kan ytterligere reduseres ved kjerne isolasjon, som beskrevet andre steder 10.
  2. Animalsk vev
    1. Dose dyr etter behov. For denne protokollen, voksen (9 uker gamle) behandle mannlig Muta Mouse av oralt inntak daglig i tre påfølgende dager med 20 mg DBC / kg kroppsvekt per dag oppløst i olivenolje.
      MERK: Denne transgene dyr havner konstruert λ-bakteriofag og mutasjon reporter gen lacZ fra E. coli 11 brukes for transgen gnager mutasjonsanalysene 12.
    2. Utfør dyr obduksjon f.eks bedøvet musene kan ved hjelp av isofluran og deretter avlives via halsdislokasjon fulgt av brysthulen åpningen. Umiddelbart flash fryse vevet i flytende nitrogen. Oppbevar vev ved -80 ° C inntil analyse.
      MERK: Tidspunktet for eutanasi etter behandlingen kan være en annen viktig variabel (for eksempel DNA oksydasjon var maksimal ved 72 timer etter eksponering støy i rottehjerne og lever 13).

2. DNA Extraction, nedbør og Wash (For Vev gå direkte til 2.2)

  1. Homogen de oppsamlede cellene i et 50 ml konisk sentrifugerør polystyren med 1 ml av DNA-isolering middel slik som DNAzol. Bruk en 1000 mL pipettespissen dispergere cellepelleten inntil løsningen er homogen. Overfør homogenat til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Inkuber på is i 10-20 min. Fortsett til 2,3.
  2. Homogen 15-20 mg vev i en 1 ml håndholdt slipp glasshomogenisator inneholdende 500 ul DNA-isolasjonsmiddel. Forsiktig heve og senke homogenisator i ca. 1 min; mykere vev vil kreve mindre tid. Skånsom behandling sikrer mindre klipping av DNA. Oppbevar homogenat på is i omtrent 10-20 min.
  3. PelletHomogenatet ved sentrifugering i 10 min ved 10 000 xg og 4 ° C i en 1,5 ml konisk mikrosentrifugerør.
  4. Overføre den resulterende supernatanten forsiktig inn en ny 1,5 ml mikrosentrifugerør betale forsiktig oppmerksomhet for å unngå kontakt med pellets.
  5. DNA utfelles fra homogenatet ved tilsetning av 0,5 ml 100% EtOH per 1 ml homogenat. Inverter rør 10 ganger for å sikre isolering av reagens og EtOH er tilstrekkelig blandet.
  6. På dette punktet, er DNA-utfellingen viskøs, spole det på en plastpipettespiss (f.eks, med en maksimal holdekapasitet på 200 ul) og deretter overført til et nytt 1,5 ml konisk mikrosentrifugerør.
    MERK: Hurtigsentrifugering kan brukes til å fjerne eventuelle gjenværende lysat fra det isolerte DNA.
    (DNA Vask og Solubilisering)
  7. Tilsett 1 ml 75% EtOH til det isolerte DNA. Suspendere den DNA-pelleten grundig ved å snu rørene 10 ganger.
  8. Dekanter forsiktig etanol fra røret. Sørg for at the DNA-pelleten pinner til siden av røret. Oppbevar rørene vertikalt i 1-2 min og bruke en pipette for å fjerne eventuelt overskytende etanol fra bunnen av røret.
  9. Gjenta DNA vaskes en gang til, og enten lagre prøven i EtOH ved -20 ° C (stabile i flere måneder), eller umiddelbart videre til fordøyelsen.
  10. Oppløs DNA i fordøyelses buffer (beskrevet nedenfor) og deretter kvantifisere ved hjelp av standard spektroskopiske metoder (dvs. absorbans ved 260 nm ved hjelp av Nanodrop spektrofotometer).

3. Enzymatisk Fordøyelse

  1. Klargjør "fordøyelse buffer" ved å kombinere hensiktsmessige volumer (avhengig av antall prøver som skal fordøyes) i 50 mM Na-monobasisk fosfat (inneholdende 2,0 mM KCl, 1.0 mM desferal (DFO) og 200 mM MgCl2) med 50 mM Na-fosfat, dibasisk (også inneholdende 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO og 200 mM MgCl2). Hver prøve krever 4,0 mL enbasiske og 17,0 mL tobasisk fosfat løsning.
    2. <li> Fjern eventuelle gjenværende EtOH fra bunnen av røret og lufttørke prøver for ca 5 min. Sørg for at DNA ikke tørker helt ut.
  2. Løs opp 80 mikrogram hentet DNA i 21,0 mL av fordøyelsen buffer, tilsett 1 enhet av DNase oppløst i 2,0 mL av fordøyelsen buffer.
  3. Vortex lett å oppnå grundig blanding og inkuberes i 1,5 timer ved 37 ° C.
  4. Ved slutten av inkubasjonsperioden, tilsett 216,4 mL av tobasisk 50 mM Na-fosfat-løsning inneholdende 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO og 200 mM MgCl2.
  5. Klargjør "fordøyelse buffer-2" ved å kombinere ett volum av buffer fordøyelse med ni deler tobasisk, 50 mM Na-fosfat (med 2,0 mM KCl, 1,0 mM DFO og 200 mM MgCl2).
  6. Legg 0.025 enheter av fosfodiesterase (PDE) Jeg enzym i 16,3 mL av fordøyelsen buffer-2. Pipetter opp og ned i flere sekunder, og deretter vortex lett å oppnå grundig blanding og inkuberes i 1,5 timer ved 37 ° C.
  7. Legg 00,4 enheter av alkalisk fosfatase (AP) i 8,0 mL av fordøyelsen buffer-2. Pipetter opp og ned i flere sekunder, og deretter vortex lett å oppnå grundig blanding og inkuberes i 1,5 timer ved 37 ° C. Legg 33,0 mL HPLC-kvalitet MeOH.
  8. Kjør fordøyd DNA-prøver på HPLC, som beskrevet nedenfor, med en gang eller oppbevar ved -80 ° C til bruk for å redusere oksidasjon. MERK: 1,5-timers fordøyelse trinn som foreslås her er basert på slike intervaller foreslått andre steder 9 og på resultatene at lignende protokoller oppnå fullstendig DNA fordøyelsen 9. Det ble derfor antatt at den eneste begrensende faktor for å oppnå fullstendig nedbrytning var tid, og at enzymhemming og prøven inhomogenitet var ubetydelig.

4. HPLC Run: Utarbeidelse av Mobile Phase, Instrumentering oppsett og vedlikehold

  1. Bruk av ultrarent vann for å forberede alle bufferløsninger og behandlet med bindeevne harpiks (f.eks Chelex 100: styren divinylbenzene kopolymer med iminodiacetate ioner som chelat-overgangsmetaller med høy affinitet) for å minimalisere metallforurensning og DNA-oksidasjon under tillagingen.
  2. Forbered 250 mM Na-fosfatbuffer, pH 6,2. Bruker et forhold på 1: 3,6957 av dibasisk natriumfosfat (FW = 177,99 g / mol) for å monobasisk natriumfosfat (FW = 119,98 g / mol).
    Eksempel: Derfor, for en 3 L stamløsning kombinere 70,81 g enverdig og 28,43 g dibasisk pudder, tilsett vann opp til for eksempel 2,8 l og verifisere at oppløsningens pH-verdi er 6,2. Juster pH med 250 mm mono eller dinatriumfosfatheptahydrat løsninger, utarbeidet separat og ikke av konsentrerte syrer eller baser. Legg 2,24 g KCl for å oppnå en konsentrasjon på 10 mM KCl.
  3. Forbered mobil fase i tre flasker, minst en L hver, inneholdende: løsningsmiddel B - HPLC-grad metanol, løsningsmiddel - B ultrarent vann, og løsningsmidlet C - fosfatbuffer fra trinn 4.2. Sett HPLC mobil fase forsyning slangen inn flaskene; remaining rør må også dyppes i en av flaskene (f.eks oppløsning C) og primet selv om de ikke er nødvendige for å blande.
  4. Under kjøringen, blande den mobile fase løsninger som 6% løsningsmiddel A, 74% løsningsmiddel B og 20% ​​oppløsningsmiddel C for å oppnå en endelig løsning av 50 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,2) med 2,0 mM KCl, og 6% MeOH.
  5. Løsne elektroden fra den elektrokjemiske detektoren, demontere den og ren referanse og arbeidselektroder med elektrode renhold løsninger og polerskiver anbefalt av produsenten. Skyll rengjorte flater med ultrarent vann, tørk av vannet forsiktig og sikre detektoren er tørr før du slår på systemet.
  6. Sett sammen detektoren og kobler den mobile fasen innløpet til elektroden. Slå på strømmen og tillate den mobile fasen for å fylle opp elektroden før festing av utløpsrøret mobile fasen. Sett inn en ny kolonne før du starter optimalisering. Sørg for at installasjonen er i riktig retning, og fOLLOWS alle produsentens anbefalinger.
  7. Slå på HLPC instrumentering god tid (for eksempel 1 time) for prøveanalyser for å tillate likevekt og for å redusere baseline støy. Se tabell 1 for foreslåtte innstillinger; mottrykket grensen bør settes til 3000 psi for å unngå skade på kolonnen. Slå på avgasser. Fortsett med grunning pumpene og sette opp løsemiddel gradient.
  8. Kles prime pumpene i henhold til produsentens instruksjoner. Gjør dette for å fukte linjene når en mobilfase har blitt erstattet eller røret innløpet er eksponert for luft.
  9. Finn priming disken og setter en 10-15 ml plastsprøyte der. Sørg for at sprøyten er satt helt inn før du åpner linjen. Slik åpner linjene bare slå platen mot klokken for en runde.
  10. Start prime med riktig valg HPLC-grensesnitt. Trekk forsiktig i sprøyten for å trekke væske inn i linjene. Når væsken strømmer, er det viktigste komplett; la programmetfullføre løp. Gjenta for alle linjer (vanligvis fire, avhengig av instrument).
  11. Alternativt våt prime når linjene er allerede fuktet fra en tidligere tørr prime (se nedenfor).
    MERK: Når en stor mengde tid har gått mellom bruker (f.eks 2 uker eller mer), er en tørr prime anbefales.
  12. Endre sammensetningen av den mobile fase løsningsmiddelkomponenter til 25% hver ved hjelp av HPLC brukergrensesnittet. Fra grensesnittet velge "Direct Function" alternativet, og deretter velge "Wet Prime" alternativet. Dette vil prime alle linjene på samme tid.
  13. Sørg for at all luft er ute av systemet ved å observere den våte prim linje som den kommer inn i avfallsbeholderen. Etter en god prime, sikre at ingen bobler er igjen i linjen. Hvis bobler vedvarer, gjentar grunning.
  14. Når pumpen er etterfylt, begynne å bevege den mobile HPLC-fase. Bruk HPLC grensesnitt for å endre sammensetningen av den mobile fase manuelt til 6% metanol (løsningsmiddel A) og 94%vann (løsningsmiddel B), og velge en strømningshastighet på 0,9 ml / min. Tillat fem minutter for å fjerne eventuelle metanol fra kolonnen rengjøringstrinnet.
  15. Etter 5 min, endre sammensetningen til 6% metanol (løsningsmiddel A), 74% vann (løsningsmiddel B), 20% buffer (oppløsningsmiddel C), å øke strømningshastigheten til 1,0 ml / min. Angi andre parametere som oppsummert i tabell 1, og sett tilbake trykkgrensen til 3.000 psi for å unngå kolonne skader.
    MERK: Potensielle problemer med HPLC oppsettet inkluderer drivende baseline, splittet topp og redusert signalintensitet. Disse kan vanligvis løses ved å rense kolonnen etter hver bruk, hyppig elektrode rengjøring, og sikre at bufferløsninger er fri for forurensning (for eksempel svevestøv eller mikrobiell vekst).
  16. Kjør den mobile fasen i ca. 1-1,5 timer for å oppnå en stabil basislinje signal.
  17. Bruk av instrumentet programvare-grensesnitt, velger parametre som angitt i tabell 1 og satt kjøretid til 15 min. Injisere sample. Bruk økt kjøretider for komplekse prøver (fastslå dette empirisk ved observasjon av nærvær eller fravær av topper utover 15-min intervall).
    MERK: Instrument programvaren tillater programmering av prøven kjøre forhold og oppsett for autosampling.
  18. Etter løpene er fullført, slår detektoren cellen ved hjelp av grensesnittet til detektoren. Det er viktig å følge produsentens anbefalinger om å slå av detektoren som feilaktig håndtering og avslåing kan skade instrumentet. IKKE slå av mobil ved å bytte baksiden av detektoren, da dette kan skade instrumentet.
  19. Manuelt endrer mobilfasesammensetning til 6% metanol og 94% vann. Kjør for 5 min.
  20. Manuelt redusere strømningshastigheten til 0,7 ml / min, umiddelbart endre sammensetningen til 50% MeOH og 50% vann. Kjør i minst 20 min. Unnlatelse av å kjøre dette trinnet for den anbefalte tiden kan føre til skade på kolonnen og detektoren. Slå av strømningen, end deretter slå av gassutskiller.

5. Utarbeidelse av standarder

  1. Forbered mobilfase buffer som beskrevet i trinn 4.1 til 4.3 ovenfor. Det er viktig å bruke HPLC mobil fase for utarbeidelse av standarder for å unngå toppene som resulterer fra blanding av ulike løsninger etter prøveinjeksjon.
  2. Fortynne denne løsningen en av fem med ultrarent vann før bruk, og den endelige løsningen må inneholde 6% MeOH.
  3. dGuo Standard
    MERK: Høy oksydasjonspotensial nødvendig for dGuo påvisning kan øke risikoen for å måle forstyrrende electro forbindelser. Dette kan verifiseres ved å, for eksempel, en standardkurve for UV-påvisning av dGuo ved 260 nm, og å sammenligne den med standardkurve opprettet med EC-påvisning. Hvis både justerer også (f.eks, Supplementary figur 1) og Prøvematrisen effektene har blitt tatt i betraktning, kan man fortsette med dGuo deteksjon ved UV ved 260 nm, i stedet for EC-påvisning.
    1. Vortex i høy hastighet før dGuo oppløses fullstendig. Dette er den primære lager; oppbevar ved -20 ° C i flere uker.
    2. For å skape den sekundære dGuo lager (0,5 mm), fortynne 143 mL av primær dGuo lager i 857 mL av HPLC mobil fase. Oppbevar på is inntil bruk og forberede fersk daglig.
    3. Foreta ytterligere fortynninger å lage en standardkurve (f.eks tabell 2). Butikkløsninger på is og forberede fersk daglig. Kjør standarder i serien med eksperimentelle prøver.
    4. Før løpe, variere detektoren spenning med den høyeste konsentrasjonen av massen for å finne optimal spenning.
  4. 8-oxo-dGuo Standard
    1. Mål 1,0 mg av 8-oxo-dGuo i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 0,1 ml HPLC-kvalitet MeOH. Vortex på høy hastighet til 8-oxo-dGuo oppløses fullstendig. Dette er den primære lager av 8-oxo-dGuo. Oppbevares ved -20 ° C for sevtater uker.
    2. I et eget rør, kombinere 2,9 mL av primær lager og 997,1 mL av HPLC mobil fase buffer, vortex. Dette er den sekundære lager (10.000 nM).
    3. Å skape en fungerende løsning for standardkurven (250 nM), kombinerer 24,4 mL av sekundær lager og 975,6 mL av mobilfase buffer.
    4. Utføre videre fortynninger for å gi løsninger som kreves for å opprette en standardkurve (for eksempel, tabell 3). Butikkløsninger på is og forberede fersk daglig. Kjør standarder med de eksperimentelle prøver.
  5. Kvantifisering
    1. Integrere arealet under kurven for både 8-oxo-dGuo og dGuo ved hjelp av standard programvare (som en del av HPLC-maskin-grensesnitt, se Utfyllende Figur 2A).
    2. Konstruere standardkurve (kjent konsentrasjon av analytt hvert vs. areal under kurven (Supplementary figur 2B). Ved å bruke ligningen for standardkurven, beregne forholdet for 8-okso-dGuo / dGuo for hver prøve.

6. agarosegelelektroforese

MERK: agarosegel-elektroforese kan bli utført for å bekrefte den fullstendige DNA-fordøyelse.

  1. Forbered 50x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer, ved oppløsning 242 g Tris base (FW = 121,14) i 750 ml ultrarent vann. Legg 57,1 ml iseddik og 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0; EDTA vil oppløses fullstendig når oppløsningens pH justeres til 8,0 med for eksempel NaOH) og tilsett ultrarent vann til et sluttvolum på 1 L. Oppbevares ved romtemperatur fortynne denne løsningen 50x før bruk.
  2. Vei opp 1 g agarose og oppløse den i 100 ml 1x TAE buffer, oppvarming i mikrobølgeovn i 1-2 min. Bruk vernebriller og verneutstyr for å unngå kontakt med kokende agarose.
  3. Avkjøl løsningen ned til ca 50 ° C, tilsett 5 mL ethidiumbromid (advarsel: mutagen) og hell den i agarosegel kjører apparat. Sett kammen.
  4. Vent til løsningen stivner, hell TAE buffer over gel og laste prøvene (volum avhenger av kammen størrelse, vanligvis er 10-20 ul DNA-prøve lastet, blandet med 6x kjører dye å visualisere og forenkle lasting).
  5. Kjør gelen inntil fargestoffet vandrer omtrent 2/3 av lengden av gelen (f.eks, 45 minutter ved 150 V). Visualisere DNA-bånd under UV-lys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

dGuo ble observert å ha en retensjonstid på 4,7 minutter, mens 8-oxo-dGuo hadde en retensjonstid på ca. 6,4 min (figur 2A og B). Det er omtrent 1000-ganger forskjell i topphøydene mellom de to analytter, som vist i figur 2C. Voltammograms for 8-oxo-dGuo og dGuo ble oppnådd ved å kjøre standarder ved et arbeidspotensial i området fra 0,2 til 1,1 V. Den optimale arbeidspotensialet for 8-oxo-dGuo ble bestemt til å være 0,5 V, og 0,9 V for dGuo (figur 3). Disse potensialene er i overensstemmelse med andre glassaktig karbonelektroder beskrevet i litteraturen 14,15. Deteksjonsgrensen og dynamisk område av 8-oxo-dGuo og dGuo elektrokjemisk deteksjon er rapportert å være i femtomole og nanomol område, henholdsvis 8,9. Standardkurver for dGuo og 8-oxo-dGuo skal kjøres daglig for å sikre lineær deteksjon over et passende konsentrasjonsområde og riktig utføregen av instrumentet (figur 4). Standardkurver ble konstruert ved plotting av topparealet som en funksjon av kjent analyttkonsentrasjon (Supplementary figur 2) som gjør det mulig å beregne analyttkonsentrasjonen i prøvene fra den ligning som genereres fra standardkurver.

Fullstendig DNA-spaltning er nødvendig for nøyaktige målinger av 8-oxo-dGua frekvens og flere genomiske DNA oppslutningsfremgangsmåter er blitt foreslått 8,15,16. Der det er nødvendig, kan virkningen av DNA-ekstraksjon og fordøyelse verifiseres ved hjelp av agarosegel-elektroforese (figur 5A) og HPLC-ED (figur 5B). Baner med åpenbare DNA smøre i figur 5A (f.eks baner 2, 4, 6, 9, 11 og 13) indikerer tilstedeværelse av ufordøyd DNA mens prøver med fordøyd DNA-fragmenter kjøre av gel og var dermed uoppdaget. Platået i figur 5B indikerer at ytterligere incubatividere av DNA med fordøyelsen enzymer utover 1,5 timer ikke resulterer i større mengde av dGuo detektert, noe som tyder på nesten fullstendig spaltning etter 1,5 timer. I tillegg ble både agarose gel-elektroforese og HPLC-ED brukes til å teste anvendeligheten av fosfatbaserte DNA-fordøyelse buffer anvendes her. Denne bufferen er godt tilpasset til HPLC mobil fase og ikke gir opphav til uønsket støy-detektor som skyldes blanding av ulike løsninger (data ikke vist). Derfor bryteren fra bufferen foreslått i litteraturen (dvs. Tris-HCl 8) til natriumfosfatbuffer anbefales for denne protokoll (til venstre i forhold til høyre side av figur 5A). Vær oppmerksom på at de underliggende forutsetningene for optimalisering av DNA fordøyelsen var at enzyminhibering og prøve inhomogeneity var ubetydelig og fordøyelse tid var den eneste begrensende faktor, som nevnt ovenfor. En mulighet for at ufullstendig DNA-fordøyelse resulterte i fragmenter som er for små til å være Detected på agarosegelen restene. Selv om en slik systematisk feil vil påvirke alle prøvene like, ytterligere forsøk (f.eks behandling av dyrkede celler med en radioaktivt merket pro-oksidant 10) kan bli utført for å fullstendig utelukke en slik mulighet.

I motsetning til standard løsninger, det spaltede DNA, enten fra isolerte celler eller musevev, produsert flere ytterligere topper (figur 6A og 6B). Disse var fjernt fra 8-oxo-dGuo og dGuo topper, men skyter eksperimenter som en del av validerings øvelser som er skissert i diskusjonen er nødvendig for å undersøke om ytterligere topper (dvs. prøven urenhet på grunn av matrise effekter, for eksempel) interferere med kvantifisering . Den 8-oxo-dGuo topp ble bekreftet ved korrespondanse av retensjonstiden med standard; og dessuten øke i 8-oxo-dGuo topp for prøver fra celler eller dyr som gjennomgikk pro-oksidant behandling (figur 7). Prooksidant KBrO tre er med i ett-elektron abstraksjon fra guanin som fører til 8-oxo-dGuo formasjon 17. Det er bemerkelsesverdig at i fravær av det pro-oksidant stress, var 2,4 molekyler av 8-oxo-dGuo per 10 7 dGuo detektert i A549-celler (figur 7A). Dette kan sammenlignes med 4,5 molekyler av 8-oxo-dGuo / 10 7 dGuo detektert i A549-celler observert ved anvendelse av en alternativ, massespektrometri tilnærming utformet for å håndtere eventuelle mangler av HPLC-metode 9 ED. DBC behandling (dvs. daglig 20,0 mg DBC / kg kroppsvekt per dag i tre dager) steg 8-oxo-dGuo nivåer i musemilt DNA. Dette er også et forventet resultat, ettersom ROS er kjent for å bli produsert i løpet av metabolismen av polysykliske aromatiske hydrokarboner in vivo 8. De relative nivåene av 8-oxo-dGuo i milten av trykksvake dyr var 8,3 til 9,4 8-oxo-dGuo / 10 6 dGuo (figur 7B), som er i utmerket agreement med publiserte verdier av fire 8-oxo-dG-molekyler / 10 6 dGuo målt i murine miltceller under standardbetingelser ved hjelp av HPLC-ED 18. Figurene 6 og 7 viser at nivåene av 8-oxo-dGuo over grunnlinjen er svært små . Således hvis DNA er oksidert til lavere nivåer enn observert her, kan nivåene av 8-oxo-dGuo være umulig å skille fra baseline, som bør holdes i bakhodet av potensielle protokoller bruker.

Figur 1
Figur 1. Struktur av 8-oxo-dGuo og dens tautomer 8-OH-dGuo. Legg merke til at 8-oxo-dGuo stedet for 8-OH-dGuo er hoved tautomer ved pH 7,4.

Figur 2
Figur 2. Retensjonstider for dGuo (A) og 8-oxo-dGuo (B). HPLC-ED Kromatogrammene ble oppnådd fra en 10,0 ul injeksjon av enten dGuo, (1,0 nmol totalt) eller 8-oxo-dGuo (1000 fmol totalt), og detektert ved 0,9 V (A) eller 0,5 V (B). Tilbakeholdelses topp for dGuo var ca. 4,7 min (A), og at det for 8-oxo-dGuo var ca. 6,4 min (B). Den brede topp ved 2-3 min er sannsynligvis forårsaket ved injeksjon forstyrrelser og er upåvirket (dvs. alltid til stede på tilsvarende intensitet) ved konsentrasjonen av 8-oxo dGuo. (C) overlagret kromatogrammene fra to separate injeksjoner som beskrevet i (a) og (B) påvist ved UV (260 nm). Standardene ble kjørt på samme dag ved hjelp av identiske kjøre forhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

es / ftp_upload / 52697 / 52697fig3.jpg "/>
Figur 3. Optimalisering detektorspenningen. (A) Voltammogram av dGuo (sluttkonsentrasjon 1 nmol) detektert ved HPLC-analyse ED i et område på 0,7 til 1,1 V. (B) Voltammogram av 8-oxo-dGuo (sluttkonsentrasjon 500 fmol) påvist ved HPLC-analyse ED i et område på 0,3 til 0,7 V. hjelp av tre uavhengige eksperimenter (n = 3) ± standardavvik er vist. I noen tilfeller feilfelt er mindre enn plotting symboler.

Figur 4
Figur 4. Standardkurve for dGuo (A) og 8-oxo-dGuo (B). Ti mikroliter av enten dGuo eller 8-oxo-dGuo ble injisert og målt ved hjelp av HPLC-ED på 0,9 V (A) eller 0,6 V (B ). Hjelp av tre uavhengige eksperimenter (n = 3) ± standardavvik er vist. I noen tilfeller feilfelt er smaller enn plotting symboler.

Figur 5
Figur 5. Optimalisering av DNA fordøyelsen. (A) Åtti mikrogram av lakse testes DNA ble spaltet som beskrevet 8 i Tris-HCl, glycin-acetat-buffer (venstre) eller natriumfosfat-buffer (til høyre). Agarosegel-elektroforese (1,0%) ble kjørt ved 150 V i 45 minutter. Felt 1 og 8: DNA-stige; baner 2, 4 og 6: ufordøyd DNA; baner 3, 5 og 7: fordøyd DNA; baner 9, 11 og 13: ufordøyd DNA (fosfatbuffer); banene 10, 12, og 14:. spaltet DNA (fosfatbuffer) (B) Salmon testiklene DNA (80 ug) ble digerert heri ved inkubering med DNase I, PDE I, og AP for 0,5 til 2,5 time pr hvert trinn, i 50 mM fosfatbuffer inneholdende magnesiumklorid og DFO. Femti mikroliter av hver prøve, inneholdende 7,3 ug spaltet DNA, ble analysert ved HPLC (dvs. 0,9 V og 1 ml / min flow) for å oppdage dGuo. Figuren viser hjelp av tre uavhengige forsøk (N = 3) ± standard feil av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6A
Figur 6B
Figur 6. Kromatogrammer av 8-oxo-dGuo deteksjon i dyrkede celler (A) eller animalsk vev (B). (A) i samle DNA fra A549-celler, behandlet eller ubehandlet med KBrO 3. (B) i samle DNA fra milten av DBC behandlede mus. Toppene forskyves til venstre på grunn av fjerning av beskyttelseskolonne (på grunn av trykkoppbygging i apparatet, deres posisjon ble bekreftet med standarder). Standarder og prøver ble kjørt på samme dag ved hjelp av identiske løp tilstands og 10 ml injeksjonsvolum, 1 ml / min strømningshastighet og 0,5 og 0,9 V for dGuo og 8-oxo-dGuo, henholdsvis. Klikk her for en større versjon av panel A; her for panel B.

Figur 7
Figur 7. Kvantifisering av 8-oxo-dGuo i biologiske prøver. Peaks ble integrert og sammenlignet med standardkurver (se Utfyllende Figur 2 for mer informasjon) for å gi 8-oxo-dGuo nivåer i DNA fra A549 celler, behandlet med KBrO 3 ( A), eller 8-okso-dGuo nivåer i DNA fra milten av DBC-behandlede mus (B). Stjerner (*) indikerer statistisk signifikans (p <0.05, Enveis variansanalyse (ANOVA) (A), t-test (B)). Hjelp av tre (A) eller fem (B) uavhengige forsøk ± standardfeil for gjennomsnittet er vist. Prøver ble samlet 4 eller 24 timer etter tre dagers behandling.

Mobilfase 50,0 mM Na-fosfatbuffer, pH 6,2, inneholdende 6% MeOH og 2,0 mM KCl
Mobil fase strømningshastighet 1,0 ml / min
Kolonnetype YMC-BASIC med limt sfærisk silika
Kolonne lengde 15 cm
Kolonne indre diameter 3,5 mm
Kolonnetemperatur 35 ° C
Detektor temperatur 29 ° C
Spenningsinnstilling for 8-oxo-dGuo 0,5 V
Spenningsinnstilling for dGuo 0,9 V
Injeksjonsvolum 10,0 ml

Tabell 1. Instrument parametere for påvisning og kvantifisering av 8-oxo-dGuo ved HPLC-ED.

nmol 100 nM standard, ul HPLC mobil fase, ul Fortynning, brett
5 300 0 1
2.5 150 150 2
1 60 240 5
0.5 30 270 10
0,25 15 285 20
0.1 6 294 50

Tabell 2. </ Strong> Utarbeidelse av standardkurve for dGuo.

fmoles 250 nM standard, ul HPLC mobil fase, ul Fortynning, brett
2500 300 0 1
1000 120 180 2.5
500 150 150 5
250 150 150 10
100 120 180 25
50 150 150 50

Tabell 3. Fremstilling av standardkurven for 8-oxo-dGuo.

Figur 8
Sup leggs Figur 1. Sammenligning av elektrokjemisk (EF) og UV-basert gjenkjenning av dGuo. Standard kurve ble opprettet for dGuo deteksjon av elektrokjemisk deteksjon (EF) eller UV-deteksjon (260 nm). Peak områder ble integrert for dGuo topp på ca 4,7 min med begge metodene. N = 3, middelverdier ± standardavvik er vist.

Figur 9
Supplerende Figur 2. Kvantifisering av dGuo fra standardkurven. Et eksempel på bruk av standardkurven for å bestemme konsentrasjonen av dGuo vises. (A) toppareal kan bestemmes ved integrering ved hjelp av standard programvare. (B) Denne informasjonen blir brukt å konstruere en standardkurve for å bruke ligningen for linjen for å beregne den ukjente analyttkonsentrasjonen i prøven.52697 / 52697fig9large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om 8-oxo-dGuo har blitt rapportert som en nyttig biomarkør av DNA oksidasjon, kan dens pålitelig kvantifisering en utfordring. Selv om flere publiserte metoder eksisterer, er det behov for en omfattende, beskrivende oversikt over protokoll for å tillate forskere å distribuere metoden i deres laboratorier. Her presenterer vi en detaljert oversikt over en HPLC-basert protokoll som vil tillate nye brukere å etablere en effektiv metode for 8-oxo-dGuo deteksjon og kvantifisering.

Tre viktige metoder som er blitt beskrevet for kvantifisering av 8-oxo-dGuo. Disse inkluderer enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) -basert kommersielle sett 19, væskekromatografi / massespektrometri (MS) metoder (f.eks, som beskrevet andre steder 9 og HPLC-ed metoder, slik som den som er beskrevet heri. ELISA-metoder kan lide av interferenser med visse forbindelser i biologiske prøver 19. Generelt er resultatene oppnådd ved anvendelse av Chromatographic teknikker er ansett som mer pålitelig for 8-oxo-dGuo kvantifisering i sammenligning med ELISA-baserte metoder 20. I sammenligning av HPLC-ED metoder med MS-baserte metoder, er fordelen med den tidligere relativt billig utstyr (dvs. omtrent en størrelsesorden mindre kostnadskrevende enn utstyr for MS-baserte metoder). I tillegg HPLC-MS er overlegen til HPLC-ED metoder som det tidligere ikke er utsatt for potensielle forstyrrelser med electro forbindelser og gi entydige, kvantitative målinger ved hjelp av isotoper 21.

Det har vært reist med hensyn til bruk av tradisjonelle fenolekstraksjon metoder for ekstraksjon av genomisk DNA som skal brukes for 8-oxo-dGuo 22 kvantifisering. Flere forskere har registrert at forholdene knyttet til standard fenolekstraksjon kan introdusere uønskede dGuo oksidasjon og dermed øke baseline nivå 1,9. For å løse dette problemet, celle og animal genomisk DNA kan bli ekstrahert og renset ved bruk av en modifisert protokoll DNAzol 22. DNAzol inneholder høye konsentrasjoner av guanidintiocyanat, og tidligere studier 9 har konstatert lavere basalnivået 8-oxo-dGuo dannelse når DNAzol anvendes sammenlignet med tradisjonell fenol- og Nal-baserte ekstraksjonsmetoder. Jernet chelaterende forbindelse DFO ble anvendt for å minimalisere ROS produksjon og DNA-oksidasjon under tillagingen. Som angitt ovenfor er 8-oxo-dGuo nivåer i ubetonte A549-celler (figur 7A) var svært lik det som ble målt ved hjelp av en MS-baserte metode 13. Dette tyder på at inkorporering av forholdsregler som er beskrevet for MS-baserte metoder 13 tillater minimalisering av uønskede DNA-oksidasjon under prøvepreparering og analyse for å oppnå nøyaktig 8-oxo-dGuo kvantifisering ved HPLC-ED. Timing av obduksjons eller høsting kultur celler etter prooksidant behandling kan være en viktig faktor, som sett her ved fallende 8-oxo-dGuo nivåeri milten hos 24 timer sammenlignet med fire timer etter den siste behandlingen (figur 7B). Dette kan være på grunn av aktivering av base excision reparasjon for å fjerne DNA-skade.

De to klare begrensninger av den beskrevne fremgangsmåten er: (1) behovet for ganske store mengder av DNA (omtrent 80 ug per prøve for å oppnå tre tekniske replikat), og (2) potensiell forstyrrelse fra co-eluering forbindelser. Det ble funnet at bare en svært liten (dvs. ca. 15 mg) stykke milt (ca. 15% av totalvekten vev) var tilstrekkelig for å oppnå 80 ug DNA, slik at en tilstrekkelig mengde av vev etter andre (f.eks genekspresjon) analyser. Mengden av ekstrahert DNA er en annen viktig parameter som påvirker kunstig DNA oksydasjon 23,24,25. Derfor arbeider med ganske stor (~ 80 mg / sample) som vi foreslår her er i tråd med tidligere anbefalinger ved bruk av> 30 mg for å minimere kunstig DNA oksidasjon 25.For mindre vev (for eksempel hippocampus), kunne man skalere ned protokollen til å begynne med 20-30 mikrogram DNA, siden dette bør være tilstrekkelig for 2-3 runs. Større mengder DNA ville antagelig lette oppløsning på topper over bakgrunnsstøy, men dette gjenstår å være eksperimentelt verifisert Tilstedeværelsen av stoffer potensielt forstyrrende kan rettes på en sak-til-sak basis, og det er viktig å alltid inkludere DNA-prøve fra samtidig in vitro eller in vivo behandling med en positiv kontroll som er kjent for å indusere DNA-skade oxidative (se figur 7).

Selv om fosfat i fosfatbuffere har blitt rapportert å redusere aktiviteten av alkalisk fosfatase, metode optimeringsforsøk (figur 5) bekreftet at fosfatbuffer kan lett anvendes. Siden fosfatbuffer inneholdes i den mobile fasen, dets anvendelse i prøvepreparering redusert detektor støy som skyldes sollufte blanding. Således spenning, buffersammensetning, DNA ekstraksjon og fordøyelse ble optimalisert og positive kontroller ble inkludert. Videre er en oppsummering som beskriver hvordan disse variablene kan bli ytterligere optimalisert av private laboratorier gitt. Vårt mål var å produsere en metode som kan være nyttig for spesialist laboratorier som tar sikte på å utvikle en analyse for 8-oxo-dGuo deteksjon og kvantifisering.

Men vi oppmerksom på at formell validering av metoden er nødvendig, som skissert under valideringer trinnene anbefalt av internasjonale konferansen om harmonisering av tekniske krav til registrering av legemidler for mennesker (ICH) for validering av analytiske prosedyrer (dvs. ICH Q2 ( R1) 26). Kort beskrevet, bør elementene i kvantitative valideringen undersøke analysen er: 1) nøyaktighet (som kan bli oppnådd ved å ta prøver med forskjellige mengder av 8-oxo-dGuo tilsatt-i, 2) område og linearitet (lineær respons over extended analyttkonsentrasjonen; 3) presisjon (repeterbarhet og reproduserbarhet); 4) deteksjonsgrense (vanligvis, ved hvilken signal-til-støy-forholdet er et punkt høyere eller lik 2-3, og dette kan være matriks avhengig); 5) grensen for kvantifisering (konsentrasjon ved hvilken reaksjonen tilfredsstiller en forutbestemt nivå, for eksempel 2 x standardavvik for kontroll, kan være matrise avhengig); 6) selektivitet / spesifisitet (evne til å oppdage analytten i komplekse prøver versus pene løsninger); 7) reproduserbarhet (evnen til å få samme resultat i forskjellige laboratorier med ulike operatører); og 8) robusthet og system egnethet. Ettersom hensikten med validering anbefalt av ICH er å vise at det er "egnet for sine tiltenkte formål» og mange laboratorier vil sannsynligvis ha flere formål, vil den potensielle brukere av denne analysen må validere denne i den utstrekning det anses nødvendig. Nøyaktig kvantifisering av 8-oxo-dGuo er ønskelig i toksikologi og molekylær medisin syndce det kan øke forståelsen av hvordan oksidativt stress, og mer spesifikt DNA oksidasjon, er mekanistisk og empirisk knyttet til negative helseeffekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denne forskningen ble finansiert av Health Canada Genomics Research and Development Initiative (GRDI) og den kanadiske Regulatory strategi for bioteknologi (CRSB). Forfatterne har ingen interessekonflikt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-oxo-dGuo standard Cayman Chemical Company 89320 Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details.
Alkaline phosphatase Sigma-Aldrich P5931 From E. coli
Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylate Sigma-Aldrich D9533
dGuo standard Sigma-Aldrich D7145
Dibasic sodium phosphate Sigma-Aldrich S9390
DNA from salmon sperm Sigma-Aldrich D1626 Sodium salt
DNase I Sigma-Aldrich D4527 TypeII, from bovine pancreas
DNAzol Invitrogen 10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E4884 The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH)
F12-K media ATCC 30-2004
Foetal bovine serum ATCC 30-2020
Guard column Chromatographic Specialties YBA 99S03 0204GC Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Monobasic sodium phosphate Sigma-Aldrich S9638
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122
Phosphate buffered saline Invitrogen 15190-250
Phosphodiesterase I enzyme  Sigma-Aldrich P3243 Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizer Thomas Scientific 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
Trypsin Invitrogen 15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silica Chromatographic Specialties YBA 99S03 1546WT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
  2. Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
  3. Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
  4. Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
  5. Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
  6. Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
  7. Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3rd, Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
  8. Park, J. -H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
  9. Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
  10. Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
  11. Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
  12. Test No. 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays. , Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). Available from: http://www.oecd-ilibrary.org (2015).
  13. Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
  14. European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
  15. Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
  16. Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
  17. Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
  18. Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
  19. Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
  20. Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
  21. Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
  22. Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
  23. Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
  24. Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
  25. Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
  26. Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf (2015).

Tags

Chemistry utgave 102 oksidativt stress DNA-skade 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanosin 8-hydroksy-2'-deoksyguanosin xenobiotiske Metabolism Human Health
HPLC Måling av DNA Oksidasjon Biomarker, 8-okso-7,8-dihydro-2&#39;-deoksyguanosin, i dyrkede celler og dyrevev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chepelev, N. L., Kennedy, D. A.,… More

Chepelev, N. L., Kennedy, D. A., Gagné, R., White, T., Long, A. S., Yauk, C. L., White, P. A. HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues. J. Vis. Exp. (102), e52697, doi:10.3791/52697 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter