Summary
Bu protokolün amacı bir DNA oksidasyonu marker algılama, 8-okso-7,8-dihidro-2'-deoksiganozin kültürlenmiş hücreler ya da hayvan dokularından DNA (8-okso-dGuo) olarak hazırlanmıştır HPLC-ED ile.
Abstract
Oksidatif stres DNA dahil biomacromolecules oksidasyonu, yol, bir çok fizyolojik ve patolojik proses, hem de ksenobiyotik metabolizma ile ilişkilidir. Bu nedenle, DNA, oksidasyon etkin algılama tıp ve toksikoloji araştırması disiplinleri, çeşitli önemlidir. Oksidatif olarak hasar görmüş DNA ortak biyobelirteç 8-okso-7,8-dihidro-2'-deoksiganozin (8-okso-dGuo olduğu; genellikle hatalı olarak adlandırılır 8-hidroksi-2'-deoksiganozin (8-OH-dGuo ya da 8 -okso-dG)). Elektrokimyasal algılama (HPLC-ED), yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile 8-okso-dGuo ölçülmesi için bir çok protokol tarif edilmiştir. Bununla birlikte, bu temel pro-oksidanlar ile muamele saflaştırılmış DNA uygulanmıştır. Buna ek olarak, esas olarak analitik ekipman farklılıklara laboratuvarlar arasında metodolojik farklılıklar için, HPLC-ED 8-okso-dGuo tespiti için yayınlanan yöntemlerin benimsenmesi, her laboratuar tarafından dikkatli bir optimizasyon gerektirir. BirBöyle bir optimizasyon süreci anlatan kapsamlı protokol, eksiktir. Burada detaylı bir protokol, kültürlenmiş hücreler ya da hayvan dokularından DNA, HPLC ED ile 8-okso-dGuo tespiti için tarif edilmektedir. Bu DNA, örnek hazırlama, kolay ve hızlı bir şekilde numune hazırlama sırasında meydana gelebilecek istenmeyen bir DNA oksidasyonunu en aza indirmek için optimize edilebilir verilmektedir. Bu protokol, oksitleyici madde KBrO 3 ile muamele edilmiş kültürlenmiş insan alveolar adenokarsinoma hücreleri (örneğin, A549 hücreleri) 'de 8-okso-dGuo tespit ve polisiklik aromatik hidrokarbon dibenzo (def, s), krizen maruz kalan farelerin dalak gösterilmiştir (eski dibenzo (a, l) piren olarak bilinen DBC, DalP). Genel olarak, bu işlem, bir HPLC-ED metodolojisi kolaylıkla biyolojik örneklerde 8-okso-dGuo tespiti için optimize edilebilir verilmektedir.
Introduction
Kimin kararlı durum düzeyleri çok patolojik durumlarda ve xenotoxic metabolizma sırasında artırabilir Reaktif oksijen türleri (ROS), oksidatif DNA hasarı artan sıklığı katkıda bulunur. Birkaç olası nükleobazlar oksidasyon ürünleri arasında, oksidatif DNA hasarı hali hazırda sabit bir işaretleyici kullanılarak ölçülebilir 8-okso-7,8-dihidro-2'-deoksiganozin, 2 oksitlenmiş formlarından biridir (8-okso-dGuo), ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-okso-dGuo nedenle, birden fazla DNA oksidasyon ürünlerinin 3 varlığına rağmen, bir DNA oksidasyon biyomarker olarak daha ayrıntılı için çalışılmıştır, en bol bir DNA lezyon 2'dir ve. İnsanlarda, bu hasar 8-OxoGuanine glikozilaz 1 (hOGG1) 4 baz eksizyon tamiri üzerinden tamir edilebilir. Unrepaired bırakılırsa, 8-okso-dGuo baz çifti ikame mutasyon oluşumu (yani, G çaprazlamalar T için) katkıda bulunabilir 4. Önemli olarak, 8-okso-dGuo bir belirteçtir fo olduğubaşlatılması ve karsinogenez 2 tanıtımına ilişkin r DNA hasarı. Bu nedenle, 8-okso-dGuo doğru ölçümü oksidatif DNA hasarı 5 faydalı ve istenen biyomarkerdir.
Dahası, bileşik (ler) in doğru isim rutin oksidatif DNA hasarı 6 bir biyolojik belirteç olarak ölçülen oksidatif hasar görmüş 2-deoksiguanosin biçimleri ve doğru isimleri ile ilgili literatürde yaygın bir karışıklık vardır. 8-okso-dGuo (Şekil 1 'de gösterildiği gibi) arasında 6,8-diketo ve 6-enol, 8-keto totomerik formları, literatürde 5,7 tartışılan iki önemli tautomerleri vardır. 6,8-diketo formu 7.4, fizyolojik pH'da en önemli bir şekilde, ve en belirgin bir DNA oksidasyon ürünü 7'dir. Bu nedenle, 8-okso-dGuo yerine 8-hidroksi-dGuo Bu oksidasyon ürünü 6 için en uygun adıdır. Oldukça nucleob daha, yani 2-deoksiganozin (dGuo) dikkat etmek de önemlidirase guanin (Gua) ya da ribonükleosit guanozin (Guo), sırasıyla, çoğu yöntemlerle 6 tarafından tespit edilir.
Doğru algılama ve 8-okso-dGuo ölçümü nedeniyle zor: DNA numunesinin sindirimi i) değişkenlik, ii) tesadüfi numune hazırlama sırasında oluşabilir 8-okso-dGuo için dGuo oksidasyonu ve iii) ihtiyaç Analitik HPLC-ED yöntemi 8 etkin doğrulama için. Bu protokol, tam DNA sindirim için uygun, ve ii) dahil, metal kenetleyici ve kenetleme maddesi ile muamele edilmiş çözümler ve özel bir DNA izole reaktifi ile iii) sadece kısmen dahil edilmesi ile ele ise koşulları sağlayarak i) sağlamaya yönelik Pozitif kontrol eder ve böylece bir yöntem biyolojik örneklerde 8-okso-dGuo saptayabilen olması şartıyla. Daha fazla doğrulama bu yazının kapsamı dışındadır. Ancak, bu protokol prospektif yardımcı olacaktır eminizKullanıcıların oldukları resmen kendi amaçları bağlı protokol doğrulamak gerekir ölçüde belirler. Yöntemin resmi doğrulama için gerekli adımların bir listesini de sunulmaktadır. 8-okso-dGuo tespiti için bir yöntemin geliştirilmesi ve yerleştirilmesi sırasında, yayınlanmış yöntemler gözden geçirildi ve toplandı. Böylece, bu yöntem 8-okso-dGuo saptanması ve ölçülmesi için bir yöntem başarıyla kabul edilmiştir ise de test hızlı ve basit bir araç sunarken sık sık önemli deneysel ayrıntıları yoksun birkaç yayınlanmış kaynaklardan bilgi toplamak için gereğini ortadan kaldırır. Bu uyarlanmış yöntemi başarıyla kültüre hücreleri ve kemirgen dokudan DNA örnekleri analiz kullanılmıştır. Bu video makalede, HPLC-ED ile güvenilir algılama ve 8-okso-dGuo ölçümü için etkili bir yöntem kurulmasında diğer gruplara yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Emin olun tüm hayvancılık, konut, taşıma ve deney, yerel kurallara ve düzenlemelere uymak ve bu deney protokolleri bir çalışmaya başlamadan önce onaylanmıştır. Açıklanan deneyler için, hayvan bakımı, taşıma ve tedavi Health Canada Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. Tedarikçilerin bilgi için "Reaktifler tablosu" na bakınız.
1. Biyolojik Örnekleri Toplama
- Hücreler ya Hayvansal Dokular
- % 10 fetal sığır serumu, penisilin, 100 ünite / ml ve streptomisin, 100 ug / ml ihtiva eden F12-K ortam, insan alveolar adenokarsinoma A549 hücreleri büyütün.
- 10 cm'lik bir levha başına yaklaşık 1.000.000 hücre tohum hücreleri. Her deney için, enzimatik sindirim ve HPLC analizi için, toplam 12 plakalar (bir biyolojik tekrarında x dört doz başına üç levha) kadar DNA (80 ug) temin etmek üzere bir dizi kullanımı.
- Hücre yoğunluğu yaklaşık daha fazla olduğundaimately plaka yüzey alanının% 70, ortamını çıkarın ve fosfat-tamponlu tuzlu su içinde 4 ml (PBS), pH 7.4 ile iki kez yıkama hücreleri.
- Kültürden geçirilmiş hayvan hücreleri için bir pozitif kontrol olarak KBrO 3 kullanın.
Not: KBrO 3 konsantrasyon ve 8-okso-dGuo frekansı arasındaki pozitif doğrusal bir ilişki literatürde 9'da rapor edilmiştir. - PBS içinde KBrO 3 eritin. Hücre kültürü ortamı içinde nihai konsantrasyon un maruz kalan hücrelerin 8-okso-dGuo nisbetle istatistiksel olarak önemli bir artış elde etmek için daha büyük 1mM olduğundan emin olun. Dizi (örneğin, 12, 10 cm'lik bir levha) her bir plaka KBrO 3 aynı konsantrasyonda ekleyin.
- 37 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edin. Ortamı çıkarın ve bir kez PBS ile yıkayın.
- Tripsin çözeltisinin, 1 ml (stok konsantrasyonu 2.5 ug / ml) ilave edilir ve 37 ° C'de 3 dakika boyunca inkübe edin.
- Tek bir 50 ml konik polystyr içine koymak her birinden hücreleri toplamak, 4 ml PBS ile yıkayın4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 x g'de en santrifüj tüpü, ve santrifüjlenir.
- PBS çıkarın ve daha fazla analiz zamanına kadar -80 ° C 'de hücre pelletini saklayın. Başka bir yerde, 10 tarif edildiği gibi yapay bir DNA oksidasyonu ayrıca nükleer izolasyonu ile en aza indirilebilir.
- Hayvansal Dokular
- Gerektiğinde hayvanlar doz. Bu protokol, yetişkin (yaş 9 haftalık) zeytinyağı içinde eritilmiş 20 mg DBC / kg vücut ağırlığı başına günde üç gün üst üste her gün ağızdan sonda ile erkek Muta Fare davranın.
NOT: Bu transgenik hayvan limanlar işlenmiş E. λ-bakteriyofaj ve mutasyon raportör gen, lacZ E. coli 11 transjenik rodent mutasyon deneyleri 12 kullanılır. - Hayvan nekropsi örneğin gerçekleştirin, fareler izofluran kullanılarak ve daha sonra göğüs boşluğu açılması ardından servikal dislokasyon yoluyla ötenazi olabilir anestezi. Hemen sıvı azot içinde dondurularak dokuları yanıp söner. Analize kadar -80 ° C'de saklayın dokular.
Not: tedavi sonrası ötenazi zamanlaması diğer bir önemli değişken olabilir (örneğin, DNA, oksitleme, sıçan beyin ve karaciğer 13 gürültü maruz bırakıldıktan sonra 72 saat sonra maksimumdu).
- Gerektiğinde hayvanlar doz. Bu protokol, yetişkin (yaş 9 haftalık) zeytinyağı içinde eritilmiş 20 mg DBC / kg vücut ağırlığı başına günde üç gün üst üste her gün ağızdan sonda ile erkek Muta Fare davranın.
2. DNA Ekstraksiyon, Yağış ve Wash (Dokular 2.2 Doğrudan Devam için)
- Örneğin DNAzol DNA izole maddesinin 1 ml'si ile, 50 ml konik polistiren santrifüj tüpü içinde toplanmıştır hücreleri homojenize edilir. Çözüm homojen olana kadar hücre pelletini dağıtmak için 1.000 ul pipet kullanın. Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp Homojenat aktarın. 10-20 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin. 2.3 geçin.
- 500 ul DNA izole maddesi ihtiva eden 1 ml'lik bir el yapışkan olmayan bir cam homojenizatör içinde doku, 15-20 mg homojenize edilir. Yavaşça yükseltmek ve yaklaşık 1 dakika boyunca düşük homojenleştirici; yumuşak dokuların daha az zaman gerektirir. Hafif bir tedavi az DNA kesme sağlar. 10-20 dakika boyunca buz üzerinde Homojenat saklayın.
- Topak10,000 x g'de 10 dakika ve 1.5 ml konik bir mikrosantrifüj tüpü içinde 4 ° C'de santrifüje edilerek homojenat.
- Dikkatle pelet temas önlemek için dikkat ederek, yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine sonuçlanan süpernatant aktarın.
- Homojenat 1 ml başına 0.5 ml% 100 EtOH ilave edilerek homojenat DNA hızlandırabilir. Izole ayıraç sağlamak için boruları 10 kez ters çevirin ve EtOH yeterince karıştırılır.
- Bu noktada DNA çökelti (200 ul maksimum tutma kapasitesi olan, örneğin), plastik bir pipet ucu üzerine bobin ve daha sonra yeni bir 1.5 ml konik mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı, viskoz.
Not: Kısa santrifüj izole DNA kalan lisat çıkarmak için de kullanılabilir.
(DNA Yıkama ve Çözme) - Izole edilmiş DNA'da% 75 EtOH 1 ml ilave edilir. Tüpleri 10 kez ters yüz edilerek iyice DNA pelet Askıya.
- Dikkatle tüpten etanol süzün. O th olune DNA, tüpün yan çubukları pelet. 1-2 dakika boyunca dikey tüpler saklayın ve borunun altından herhangi bir aşırı EtOH kaldırmak için bir pipet kullanın.
- DNA bir kez daha yıkayın tekrarlayın ve (birkaç ay boyunca stabil) veya hemen sindirim devam -20 ° C'de EtOH örnek saklamak ya.
- Sindirim tamponu DNA (aşağıda tarif edilmiştir) içinde çözündürülür ve daha sonra (yani, 260 nm'de emicilik NanoDrop spektrofotometre kullanılarak) standart spektroskopik yöntemler kullanılarak miktarı belirlenir.
3. Enzimatik Sindirim
- Uygun hacimleri birleştirerek "sindirim tampon" Hazırlama monobazik Na-fosfat 50 mM Na-fosfat, dibazik (2.0 mM KCI, 1.0 mM Desferal (DFO) ve 200 mM MgCI2 ihtiva eden), 50 mM (numune sayısına bağlı olarak sindirilmiş olan) (aynı zamanda 2.0 mM KCI, 1.0 mM DFO, 200 mM MgCI2 ihtiva eder). Her örnek monobazik 4,0 ul ve 17.0 ul dibazik fosfat çözeltisi gerektirir. <li> yaklaşık 5 dakika boyunca boru ve hava-kuru numuneler altından kalan EtOH çıkarın. DNA, tamamen kurumasına değil emin olun.
- Sindirim tamponu 21.0 ul 80 ug ekstre DNA çözülür I sindirimi tamponu 2.0 ul içinde çözülmüş DNase 1 birim ekleyin.
- Vorteks hafifçe bir karışım elde etmek ve 37 ° C 'de 1.5 saat boyunca inkübasyona.
- İnkübasyon süresinin sonunda, 2.0 mM KCI, 1.0 mM DFO, 200 mM MgCI2 ihtiva eden iki işlevli 50 mM Na fosfat solüsyonu 216.4 ul ekle.
- Dibazik dokuz hacim, 50 mM Na-fosfat (2.0 mM KCI ile, 1.0 mM DFO ve 200 mM MgCI2) ile sindirim tamponu, bir hacim birleştirerek ", sindirim tamponu-2" hazırlayın.
- Fosfodiesteraz 0.025 birim (PDE) I sindirimi tampon-2 16.3 ul enzim ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı birkaç saniye, sonra hafifçe vorteks bir karışım elde etmek ve 37 ° C 'de 1.5 saat boyunca inkübasyona.
- 0 ekleSindirim tamponu-2'nin 8.0 ul alkalin fosfataz (AP) .4 birimleri. Pipet yukarı ve aşağı birkaç saniye, sonra hafifçe vorteks bir karışım elde etmek ve 37 ° C 'de 1.5 saat boyunca inkübasyona. 33.0 ul HPLC notu MeOH ekleyin.
- Oksidasyonunu en aza indirgemek için kullanılana kadar -80 ° C 'de hemen, aşağıda tarif edilen ya da deposu olarak, HPLC ile sindirilmiş DNA örnekleri çalıştırın. NOT: Bu tür aralıklarla dayanmaktadır Burada önerilen 1.5 saat sindirim adımları benzer protokoller tam DNA sindirimi 9 başarmak başka bir yerde 9 ve bulgulara önerdi. Bu nedenle, sadece sınırlayıcı faktör tam sindirim süresi ve enzim inhibisyonu ve örnek homojensizlik önemsiz idi ulaşmak için varsayılmıştır.
4. HPLC Run: Mobil Faz, Enstrümantasyon Kur ve Bakım hazırlanması
- Tüm tampon çözümleri hazırlamak için ultra saf su kullanın ve yüksek yapışma gücü reçine (örneğin, Chelex 100 ile tedavi: stiren divinylbeiminodiasetat ile benzodioksan kopolimer yüksek afinite ile şelat geçiş metalleri) numune hazırlama sırasında metal kontaminasyonu ve DNA oksidasyonu en aza indirmek için bu iyonlar.
- 250 mM Na fosfat tamponu, pH 6.2 hazırlanır. 1 bir oranı kullanarak: dibazik sodyum fosfat 3,6957 (FW = 177,99 g / mol), sodyum fosfat (FW = 119.98 g / mol) tek bazlı etmek.
Örnek: Bu nedenle, 3 L stok çözümü için, monobazik ve 70,81 gr ve çift bazlı toz 28.43 gr birleştirmek örneğin kadar su ekleyin, 2.8 L ve çözeltinin pH değeri 6.2 olduğunu doğrulayın. Konsantre asitler veya bazlar ayrı ayrı değil, hazırlanan 250 mM mono veya dibazik sodyum fosfat çözümleri ile pH ayarlayın. 10 mM KCI bir konsantrasyon elde etmek için KCI 2.24 g ekleyin. - Ihtiva eden, en az bir 1 L'lik, üç şişe, her mobil faz hazırlayın: solvent B - HPLC-dereceli metanol çözücü - Yatak ultra saf su ve çözücü C - adım 4.2 arasında fosfat tampon maddesi. Şişelere HPLC mobil faz besleme hortumunu takın; remaining tüpler de şişe birine (örneğin, çözelti, C) batırılmış ve karıştırılması için gerekli olmasa bile hazırlanması gerekmektedir.
- Çalışma sırasında, 2.0 mM KCI, 50 mM sodyum fosfat tampon maddesi (pH 6.2) ve% 6 MeOH nihai çözelti elde etmek için% 6 çözücü A,% 74 çözücü B ve% 20 çözücü madde C olarak mobil faz çözüm karıştırın.
- Elektrokimyasal dedektör elektrot ayırın onu ve elektrot temizleme solüsyonları ile temiz referans ve çalışma elektrotları ve üretici tarafından önerilen parlatma diskleri sökmeye. , Ultra saf su ile temizlenmelidir yüzeyleri durulayın nazikçe suyun silin ve dedektör sistemi açmadan önce kuru olduğundan emin olun.
- Dedektörü monte edin ve elektrot mobil faz girişi bağlayın. Akış açın ve mobil faz çıkış mobil faz tüp takmadan önce elektrot doldurmak için izin verir. Optimizasyonu başlamadan önce yeni bir sütun takın. Emin olun kurulum doğru yönde ve f iseTüm üreticinin öneriler ollows.
- Iyi öncesinde (örn 1 saat) numunenin HLPC enstrümantasyon açın dengeye izin ve bazal gürültüyü azaltmak için analiz eder. Önerilen ayarları için Tablo 1'e bakınız; geri basınç sınırı sütun zarar görmemesi için 3000 psi ayarlanmış olmalıdır. Degazör açın. Pompalar emişli ve çözücü degrade kurma devam edin.
- Kuru ana üreticinin talimatlarına uygun olarak pompalar. Mobil faz ikame edilmiş ya da hortumu giriş havasına maruz bırakıldığında hatları ıslak yapın.
- Astar diski bulun ve orada 10-15 ml'lik plastik şırınga yerleştirin. Şırınga tamamen çizgiyi açmadan önce takılı olduğundan emin olun. Açmak için çizgiler sadece bir tur için disk saat yönünün tersine çevirin.
- Uygun HPLC arayüzü seçimi ile asal başlayın. Yavaşça çizgiler içine sıvıyı çekmek için şırınga çekin. Sıvı akan sonra asal tamamlandı; Programı izinrun bitirmek. Tüm hatlarda (enstrüman bağlı genellikle dört) için tekrarlayın.
- Alternatif olarak, çizgiler zaten önceki bir kuru başbakan dan ıslanan ıslak asal (aşağıya bakınız).
NOT: zaman büyük miktarda kullanır (örneğin, 2 hafta veya daha fazla) arasında geçen zaman, kuru bir asal tavsiye edilir. - % 25 HPLC kullanıcı arabirimini kullanarak her mobil faz çözücü bileşenlerinin kompozisyonu değiştirin. Arayüzünde, ardından "Doğrudan Fonksiyonu" seçeneğini "Islak Başbakan" seçeneğini seçin. Bu, aynı zamanda başbakan tüm satırları olacaktır.
- Tüm hava atık konteyneri girerken ıslak asal çizgi gözlemleyerek sistemin dışında olduğundan emin olun. İyi bir asal sonra hiçbir kabarcıklar doğrultusunda kalmadığından emin olun. Kabarcıklar devam ederse, astar tekrarlayın.
- Pompa dolana sonra, HPLC mobil faz hareket etmeye başlar. Elle% 6 metanol (çözücü A) ve% 94 oranında mobil faz kompozisyonu değiştirmek için HPLC arayüzü kullanınsu (Çözücü B) ve 0.9 ml / dk'lık bir akış hızı seçin. 5 dk kolon temizleme aşamasından herhangi metanol temizlemek için izin verin.
- 5 dakika sonra,% 6 metanol (solvent A),% 74 su (solvent B),% 20 tampon (Çözücü C) bileşimi değiştirmek 1.0 ml / dak akış hızı artar. Tablo 1'de özetlenmiştir ve sütun zarar görmemesi için 3000 psi geri basınç sınırı ayarlamak gibi diğer parametreleri ayarlayın.
NOT: HPLC kurulumu ile potansiyel problemler sürüklenen taban çizgisini, split tepe ve azalmış sinyal yoğunluğu içerir. Bunlar genellikle her kullanımdan sık elektrot temizleme sonrası sütun temizlik ve tampon çözeltileri kontaminasyon serbest olmasını sağlamak aşılabilir (örneğin, partikül madde veya mikrobik büyüme). - Istikrarlı bir temel sinyalini elde etmek için yaklaşık 1-1.5 saat boyunca mobil faz çalıştırın.
- Enstrüman yazılım arayüzü kullanarak, Tablo 1'de belirtilen ve 15 dakika kadar çalışma süresi set olarak seçin parametreleri. Sam enjekteple. Karmaşık numuneler için artan çalışma sürelerini kullan (15 dk arayla ötesinde doruklarına varlığının veya yokluğunun gözlemleyerek ampirik Bunu belirlemek).
NOT: Gösterge yazılım autosampling örnek çalışma koşullarının programlama ve kurulum sağlar. - Çalışır tamamlandıktan sonra, dedektörün arabirimini kullanarak dedektör hücresi kapatın. Bu yanlış kullanım olarak dedektörü kapatmadan ilgili üreticinin tavsiyelerini uygulayın ve enstrüman zarar verebilir aşağı kapatmaya önemlidir. Cihaza zarar verebilir, bu kadar dedektör arkasına geçerek hücreyi kapatmak ETMEYİN.
- Elle% 6 metanol ve% 94 su mobil faz kompozisyonu değiştirmek. 5 dakika çalıştırın.
- El ile hemen, 0.7 mL / dk akış hızı azaltmak% 50 MeOH ve% 50 su bileşimi değiştirin. En az 20 dakika boyunca çalıştırın. Arıza kolon ve dedektör zarar görmesine neden olabilir önerilen süre için bu adımı çalıştırmak için. , Akış kapatın birDaha sonra gaz giderici kapatmak d.
Standartlar 5. hazırlanması
- Yukarıdaki adımlarda 4.1-4.3 belirtildiği gibi mobil faz tampon hazırlayın. Bu örnek, enjeksiyondan sonra farklı çözümler karıştırılmasından kaynaklanan pikler önlemek için standartlar hazırlanması için HPLC mobil faz kullanmak önemlidir.
- Ultra saf su, kullanımdan önce, beş, bu çözelti, bir seyreltilir ve nihai çözelti,% 6 MeOH içermelidir.
- dGuo Standart
NOT: dGuo tespiti için gerekli olan yüksek oksitleme potansiyeli elektro bileşikler parazit ölçüm riskini arttırabilir. Bu durum, örneğin, doğrulanabilir, standart 260 nm'de dGuo UV algılama eğrisi ve AT tespiti ile oluşturulan standart bir eğriye karşılaştırarak. Her ikisi de aynı hizaya (örneğin, Ek Şekil 1) ve örnek matris etkileri dikkate alınmıştır, tek yerine AK algılama daha 260 nm'de UV ile dGuo algılama ile devam edebilir.- DGuo kadar yüksek hızda Vortex tamamen erir. Bu birincil stok; birkaç hafta boyunca -20 ° C'de saklayın.
- İkincil dGuo stoku (0.5 mM) oluşturmak için, HPLC mobil fazı 857 ul primer dGuo stokunun 143 ul seyreltilir. Kullanılana kadar buz üzerinde saklayın ve günlük taze hazırlayın.
- Bir standart eğri oluşturmak için daha başka seyreltmeler yapmak (örneğin, Tablo 2). Buz üzerinde saklayın çözümleri ve günlük taze hazırlayın. Deneysel örnekleri ile seri olarak çalıştırın standartlar.
- Çalıştırmak için önce uygun voltaj bulmak için stokunun en yüksek konsantrasyonu kullanılarak dedektör gerilimi değişir.
- 8-okso-dGuo Standart
- 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 8-okso-dGuo 1.0 mg ölçün. 0.1 ml HPLC dereceli MeOH ekleyin. 8-okso-dGuo kadar yüksek hızda Vorteks tamamen erir. Bu 8-okso-dGuo birincil stok. Sev -20 ° C'de saklayıneral hafta.
- Ayrı bir tüp içinde, ana stoklar 2.9 ul ve HPLC hareketli faz tamponu, girdap 997,1 ul birleştirir. Bu, ikincil hisse senedi (10,000 nM) 'dir.
- Standart eğri (250 nM) için çalışan bir çözüm oluşturmak için, ikincil hisse senedi 24.4 ul ve mobil faz tampon 975,6 ul birleştirir.
- Standart bir eğri oluşturmak için gerekli çözümler sunmak için daha fazla dilüsyonları gerçekleştirin (örneğin, Tablo 3). Buz üzerinde saklayın çözümleri ve günlük taze hazırlayın. Deneysel örnekler ile çalıştırın standartları.
- Niceleme
- Için eğrinin altında kalan alan entegre iki 8-okso-dGuo (HPLC-bilgisayar arayüzü bir parçası olarak, Ek Şekil 2A 'ya bakınız) standart yazılımlar kullanılarak ve dGuo.
- Standart eğrinin denklemi kullanarak. Standart eğri (eğri (Ek Şekil 2B) altında kalan alan vs her bir analitin bilinen konsantrasyonunu Construct 8- için oranını hesaplamakokso-dGuo her numune için / dGuo.
6. Agaroz Jel Elektroforezi
Not: Agaroz jel elektroforez DNA parçalanması tamamlanmasını doğrulamak için gerçekleştirilebilir.
- 750 mi ultra saf su içinde 242 g Tris bazı (FW = 121.14) çözülmesiyle, 50x Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponu hazırlayın. 57.1 ml buzlu asetik asit ve 0.5 M EDTA, 100 ml ilave edilir (pH 8.0 EDTA, tamamen çözelti pH, mesela 8.0 NaOH ayarlandı zaman eriyecektir) ve oda sıcaklığında 1 L deposu bir son hacme ultra saf su ekleyin, Kullanmadan önce bu çözüm 50x sulandırmak.
- Agaroz, 1 g tartılır ve 1-2 dakika süreyle mikrodalgada 100 mi 1x TAE tamponunda, ısıtma içinde çözülür. Agaroz kaynar ile temasını engellemek için gözlük ve koruyucu ekipman kullanın.
- (: Mutajen dikkat) ve agaroz jel çalışan aparat içine dökün, yaklaşık 50 ° C'ye kadar çözüm soğutun, 5 ul etidyum bromür ekleyin. Tarağı yerleştirin.
- (Hacim tarak boyutuna bağlıdır, tipik, DNA örneği 10-20 ul yüklenir, 6x çalışan boya ile karışık görselleştirmek ve yüklemeyi kolaylaştırmak için), çözüm katılaşır kadar bekleyin jel üzerinde TAE tamponu dökün ve örnekleri yükleyin.
- Boya jel yaklaşık 2/3 uzunlukta geçirir kadar jel çalıştırın (örneğin, 45 dakika 150 V). UV ışığı altında, DNA bantları görselleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
dGuo 8-okso-dGuo yaklaşık 6.4 dakika boyunca (Şekil 2A ve B) bir tutma süresi ise 4.7 dakikalık bir tutma süresine sahip olduğu gözlenmiştir. Şekil 2C'de görüldüğü gibi, iki analitler arasında pik yükseklikleri ile ilgili olarak 1000 misli bir fark vardır. 8-okso-dGuo ve dGuo için voltamogramalrı +1.1 V +0.2 arasında bir çalışma potansiyelinde çalışan standartlarına göre elde edilmiştir 8-okso-dGuo için optimum çalışma potansiyeli, 0,5 V, ve 0,9 olduğu belirlendi dGuo V (Şekil 3). Bu potansiyeller literatürde 14,15 açıklanan diğer camsı karbon elektrot ile uyum içindedir. algılama ve 8-okso-dGuo ve dGuo elektrokimyasal algılama dinamik aralık sınırı, sırasıyla 8,9, femtomole ve nanomol aralığında olduğu bildirilmiştir. DGuo ve 8-okso-dGuo için standart eğriler, uygun bir konsantrasyon aralığında lineer algılama sağlanması ve doğru gerçekleştirmek için her gün çalıştırılmalıdıraygıtının oluşabilmesi (Şekil 4). Standart eğriler, bir standart eğri elde denklemden numunelerinde analit konsantrasyonunu hesaplamak sağlar, bilinen bir analit konsantrasyonu (Ek Şekil 2) 'in bir fonksiyonu olarak pik alanı işaretlenmesiyle inşa edilir.
Tam DNA parçalanması 8-okso-dGua frekansı ve çeşitli genomik DNA, sindirim yöntemleri, doğru ölçümleri için gerekli olan 8,15,16 önerilmiştir. Gerekli olduğunda, DNA ekstraksıyon ve sindirim etkinliği agaroz jel elektroforezi (Şekil 5A) ve HPLC-ED (Şekil 5B) kullanılarak kontrol edilebilir. Şekil 5A'da açık bir DNA, yayma bantlar da (örneğin, sütun 2, 4, 6, 9, 11, ve 13) sindirilmiş DNA fragmanları ile örnekleri jel kaçıp ve böylece tespit edilmemiş ise sindirilmemiş DNA'nın varlığını gösterir. Şekil 5B plato daha kuluçkalamadan belirtirsindirim enzimleri ile DNA'nın 1.5 saat, 1.5 saat sonra, hemen hemen tam bir sindirim öne tespit dGuo daha fazla miktarda sonuçlanmaz ötesindedir. Buna ek olarak, agaroz jel elektroforezi ve HPLC-ED de burada kullanılan fosfat-bazlı DNA sindirim tamponu yararlılığını test etmek için kullanıldı. Bu tampon de HPLC mobil faz ile eşleştirilir ve atfedilen farklı çözümler karıştırma arzu dedektör gürültü sebebiyet vermez (veri gösterilmemiştir). Bu nedenle, tampon anahtarı literatürde önerilen (örneğin, Tris-HCI 8) sodyum fosfat tamponuna (Şekil 5A'daki sağ tarafına karşı sağa) bu protokol için tavsiye edilir. DNA sindirim optimizasyonu için temel varsayımlar enzim inhibisyon ve örnek homojensizlik önemsiz olduğunu ve yukarıda belirtildiği gibi sindirim süresi, sadece sınırlayıcı faktör olduğunu olduğunu unutmayınız. Eksik DNA, sindirim dete için çok küçük olan parçalara yol açtığını bir olasılıkagaroz jel kalıntıları üzerinde cted. Böyle bir sistematik hata eşit tüm örnekleri etkileyecek olsa da, daha fazla deneyler (örneğin, bir radyoaktif işaretli pro-oksidan 10 kültür hücreleri tedavi) tamamen böyle bir olasılığı ekarte etmek için yapılan olabilir.
Standart çözümlerin aksine, sindirilmiş DNA, ister bir izole edilmiş hücre veya fare dokularından, birkaç ek tepe noktaları (Şekil 6A ve 6B) üretti. Bu 8-okso-dGuo ve dGuo tepe uzak, ama Tartışma belirtilen doğrulama testleri bir parçası olarak deneyler spike ek tepe noktaları (örneğin, matriks etkileri nedeniyle örnek safsızlığı, örneğin) ölçümü ile müdahale halinde gösterilmesi için . 8-okso-dGuo pik standart tutma süresi denk ile teyit edilmiştir; ve ayrıca, pro-oksidan tedavi uygulanan hücreler ya da hayvanların örnekleri (Şekil 7, 8-okso-dGuo tepe artış). Pro-oksidan KBrO 8-okso-dGuo formasyonu 17 yol açar guanin arasında bir elektron soyutlama 3 dahildir. Bu pro-oksidan stresin yokluğunda, 10 7 dGuo başına 8-okso-dGuo 2.4 molekülleri A549 hücrelerinde (Şekil 7A) tespit edilmiştir dikkat çekicidir. Bu alternatif, HPLC-ED yöntemi 9 potansiyel eksiklikleri gidermek için tasarlanan kütle spektrometresi tabanlı bir yaklaşım kullanarak gözlenen A549 hücrelerinde tespit 8-okso-dGuo / 10 7 dGuo 4,5 molekülleri ile karşılaştırılabilir. DBC tedavisi (yani, günde 20.0 mg DBC / kg vücut ağırlığı, günde üç gün süre ile), fare dalak DNA 8-okso-dGuo seviyelerini arttırmıştır. ROS, in vivo 8 polisiklik aromatik hidrokarbonların metabolizması sırasında üretilen bilinmektedir, bu durum, aynı zamanda beklenen bir sonucudur. gerilmemiş hayvanların dalak 8-okso-dGuo görece seviyeleri çok Agreemen olan 8,3-9,4 8-okso-dGuo / 10 6 dGuo (Şekil 7B), idiHPLC-ED 18 ile, standart koşullar altında, murin dalak hücrelerinde ölçüldü, dört 8-okso-dG molekülleri / 10 6 dGuo yayınlanan değerlerle t. taban seviyelerin üzerinde 8-okso-dGuo seviyeleri çok küçük olduğu 6 ve 7, Şekil . DNA, burada görülen daha düşük düzeylere oksitlenir Böylece eğer, 8-okso-dGuo seviyeleri prospektif protokol kullanıcılar tarafından akılda tutulmalıdır başlangıca, ayırt edilemeyebilir.
Şekil 1. 8-okso-dGuo yapısı ve totomer 8-OH-dGuo. 8-okso-dGuo yerine 8-OH-dGuo pH 7.4'te büyük bir tautomeri olduğuna dikkat edin.
DGuo (A) ve 8-okso-dGuo (B). HPLC-ED Şekil 2. Tutma süreleri kromatogramları ya dGuo bir 10.0 ul enjeksiyon elde edilen (1.0 nmol Toplam) ya da 8-okso-dGuo (1000 fmol toplam) ve 0.9 V (A) ya da 0.5 V (B) 'de tespit edilmiştir. dGuo tutma pik yaklaşık 4.7 dakika (A), ve bu 8-okso-dGuo oldu yaklaşık olarak 6.4 dakika (B) idi. 2-3 dk geniş tepe olasılıkla enjeksiyon bozukluklarının neden olduğu ve 8-okso dGuo konsantrasyonu ile (benzer yoğunlukta, yani, her zaman mevcut) etkilenmez edilir. (C) üst üste getirilmiş kromatogramlar iki ayrı (A) 'da tarif edilen enjeksiyon ve aralarından UV (260 nm) ile tespit (B). standartlar aynı çalışma koşulları kullanılarak aynı gün çalışıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
es / ftp_upload / 52697 / 52697fig3.jpg "/>
Şekil 3. Optimize dedektör voltajı. DGuo (A) voltogramda 0,7-1,1 V (B), 8-okso-dGuo bölgesinin voltogramda bir dizi HPLC-ED analizi ile tespit edildi (nihai konsantrasyon 1 nmol) (nihai konsantrasyon 500 fmol) Üç bağımsız deneyin 0,3-0,7 V araçları bir dizi HPLC-ED analizi ile tespit edildi (n = 3) standart sapma gösterilmektedir ±. Bazı durumlarda, hata çubukları çizim semboller daha küçüktür.
DGuo (A) ve 8-okso-dGuo (B). Enjekte edilir ve 0.9 V (A) ya da 0.6 V HPLC-ED ile ölçülmüştür dGuo veya 8-okso-dGuo ya On mikrolitre (B Şekil 4. Standart eğri ). Üç bağımsız deneyler araçları (N = 3) gösterilen standart sapmayı ±. Bazı durumlarda hata çubukları sm olankomplo semboller daha aller.
DNA parçalanması 5. Optimizasyonu Şekil. Tris-HCl 8 tarif edildiği gibi (A) salmon testis DNA'sı sekseni mikrogram sindirilmiş, glisin-asetat tampon maddesi (sol) veya sodyum fosfat tampon maddesi (sağ). Agaroz jel elektroforezi (% 1.0) 45 dakika boyunca 150 V'ta çalıştırılmıştır. Şerit 1 ve 8: DNA merdiveni; sütun 2, 4, ve 6: sindirilmemiş DNA; kulvarlar 3, 5 ve 7: sindirilmiş DNA; sütun 9, 11 ve 13: sindirilmemiş DNA (fosfat tamponu); 10, 12 ve 14 şeritleri. sindirilmiş DNA (fosfat tamponu) (B), Salmon testis DNA'sı (80 ug), 50, her bir adım başına 0.5-2.5 saat için, DNase I, PDE I ve AP ile inkübe edilmesi ile bu buluşa sindirilmiştir magnezyum klorid ve DFO ihtiva mM fosfat tamponu. Sindirilmiş DNA 7.3 ug ihtiva eden her bir örnek elli mikrolitre, (yani, 0.9 V ve 1 ml / dakika flo HPLC ile analiz edilmiştirw) dGuo tespit etmek. Şekil üç bağımsız deneyler (N = 3) ortalamanın standart hatasını ±. Araçlarını gösteren bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
A549 hücreleri, KBrO 3 ile muamele edilmiş ya da muamele edilmemiş, Şekil kültürlenmiş hücreler (A) ya da hayvan dokusu (B) 'de 8-okso-dGuo tespiti için 6. Kromatogramlar. (A), sindirilmiş DNA. (B), DBC dalağından sindirilmiş DNA ile tedavi edilen fareler. Peaks nedeniyle koruma sütunun kaldırılması için sola kaymıştır (nedeniyle aparat basınç birikmesi; konumları standartları ile teyit edildi). Standartlar ve örnekler aynı çalışma koşulunu kullanarak aynı gün çalışıldı1 ml / dakika akış hızı ve 0.5 sırasıyla dGuo ve 8-okso-dGuo için 0,9 V S ve 10 mi enjeksiyon hacimleri. Tıklayınız burada Panel A'da daha büyük bir versiyonu için; burada panel B için.
Şekil biyolojik numuneler içinde 8-okso-dGuo 7. miktarının belirlenmesi. Doruklar ve standart eğri (daha fazla ayrıntı için ek Şekil 2) KBrO 3 (ile muamele A549 hücreleri, DNA, 8-okso-dGuo seviyelerini elde etmek için karşılaştırılmıştır A), DBC ile tedavi edilmiş farelerde (B) dalak DNA bölgesi veya 8-okso-dGuo seviyeleri. Yıldız (*) istatistiksel anlamlılık göstermektedir (p <0Varyans, 05, tek-yönlü analizi (ANOVA) (A), Student t-testi (B)). Üç (A) ya da beş (B) ortalama ± standart hata bağımsız deneyin araçlar gösterilmektedir. Örnekler 4 toplanır ya da 3 günlük bir tedaviden sonra 24 saat bulundu.
| Mobil faz | 50.0 mM Na fosfat tamponu, pH 6.2,% 6 MeOH ve 2.0 mM KCI ihtiva eden |
| Mobil faz, debisi | 1.0 ml / dak |
| Kolon tipi | Gümrüklü küresel silika ile YMC-BASIC |
| Kolon uzunluğu | 15 cm |
| Kolon iç çapı | 3,5 mm |
| Kolon sıcaklığı | 35 ° C |
| Dedektör sıcaklığı | 29 ° C |
| 8-okso-dGuo için voltaj ayarı | +0.5 V |
| DGuo için gerilim ayarı | 0,9 V |
| Enjeksiyon hacmi | 10.0 mi |
HPLC-ED ile algılama ve 8-okso-dGuo ölçümü için Tablo 1. alet parametreleri.
| nmol | 100 nM standardı, ul | HPLC hareketli faz ul | Sulandırma, kat |
| 5 | 300 | 0 | 1 |
| 2.5 | 150 | 150 | 2 |
| 1 | 60 | 240 | 5 |
| 0.5 | 30 | 270 | 10 |
| 0.25 | 15 | 285 | 20 |
| 0.1 | 6 | 294 | 50 |
Tablo 2. </ DGuo için bir standart eğri, güçlü> hazırlanması.
| fmol | 250 nM standardı, ul | HPLC hareketli faz ul | Sulandırma, kat |
| 2500 | 300 | 0 | 1 |
| 1000 | 120 | 180 | 2.5 |
| 500 | 150 | 150 | 5 |
| 250 | 150 | 150 | 10 |
| 100 | 120 | 180 | 25 |
| 50 | 150 | 150 | 50 |
Tablo 8-okso-dGuo için bir standart eğri 3. hazırlanması.
Yudum tamamlayıcı görevlerdir Şekil elektrokimyasal (AK) ve dGuo UV-tabanlı algılama 1. karşılaştırılması. Standart eğri elektrokimyasal algılama (EC) veya UV algılama (260 nm) ile dGuo tespiti için oluşturuldu. Tepe alanlar her iki yöntem ile, yaklaşık olarak 4.7 dakika ile dGuo zirve için entegre edilmiştir. N = 3, ortalama ± standart sapma gösterilmektedir, anlamına gelir.
Standart eğriden dGuo bölgesinin tamamlayıcı Şekil 2. belirlenmesi. DGuo konsantrasyonu gösterilmiştir belirlemek için standart eğrinin kullanımının bir örneği. (A) Tepe alanı standart yazılımlar kullanılarak entegrasyonu ile belirlenebilir. (B), bu bilgi kullanılmaktadır örnek bilinmeyen analit konsantrasyonunun hesaplanması için hattın denklemi kullanmak için bir standart eğri oluşturmak için.52697 / 52697fig9large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
8-okso-dGuo DNA oksidasyon yararlı bir belirteç olarak rapor edilmiş olmasına rağmen, bu güvenilir bir miktar bir sorun teşkil edebilir. Birkaç yayınlanan yöntemler bulunmasına rağmen, bunların laboratuarlarında yöntem dağıtmak için araştırmacılar izin protokol kapsamlı, açıklayıcı bakış için bir ihtiyaç vardır. Burada 8-okso-dGuo tespiti ve ölçümü için etkili bir yöntem kurmak için yeni kullanıcılar izin verir HPLC-tabanlı protokol ayrıntılı bir bakış sunuyoruz.
8-okso-dGuo ölçümü için tarif edilmiş olan üç ana yöntem. Başka 9 tarif edilen ve bu da, HPLC-ED yöntemler, burada tarif edildiği gibi bu, ticari kitler 19, örneğin, sıvı kromatografisi / kütle spektrometrisi (MS) yöntemleri (testi (ELISA) immünosorban merkezli enzime bağlı bulunmaktadır. ELISA yöntemleri müdahalelerden muzdarip biyolojik numunelerde 19 belirli bileşikler ile. Genel olarak, sonuçlar kullanılarak elde Chromatographic teknikler ELISA tabanlı yöntemler 20 ile karşılaştırıldığında 8-okso-dGuo ölçümü için daha güvenilir olarak kabul edilir. MS tabanlı yöntemler ile HPLC-ED yöntemler karşılaştırıldığında, eski avantajı, nispeten pahalı olmayan ekipmanlar (MS-tabanlı yöntemler için ekipman daha az maliyetli büyüklük yani, yaklaşık bir düzen) 'dir. Eski elektroaktif bileşikler ile potansiyel etkileşimler eğilimli değildir ve izotopları 21 kullanılarak kesin nicel ölçümler sağlamak Buna ek olarak, HPLC-MS, HPLC-ED yöntemlerine üstündür.
Kaygılar 8-okso-dGuo ölçümü 22 için kullanılmak üzere, genomik DNA ekstraksiyonu için, geleneksel fenol çıkarma yöntemlerinin kullanımı ile ilgili olarak ortaya atılmıştır. Birçok araştırmacı, standart fenol ekstraksiyon ile ilişkili durumlar başlangıç seviyeleri 1,9 artan ve böylece istenmeyen dGuo oksidasyonu tanıtmak olduğunu kaydetti. Bu sorun, hücre ve anima gidermek içinl genomik DNA, ekstre edilmiş ve bir tadil edilmiş DNAzol protokolü 22 kullanılarak saflaştırılabilir. DNAzol guanidin tiyosiyanat yüksek konsantrasyonda içerir ve önceki çalışmalarda 9 DNAzol geleneksel fenol ve Nal-tabanlı ekstraksiyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında kullanılan alt bazal seviye 8-okso-dGuo oluşumunu kaydetti. demir kenetleme bileşiği, DFO numune hazırlama sırasında ROS üretimini ve DNA oksitlenmelerini en aza indirmek için kullanılır. Yukarıda işaret edildiği gibi, gerilmemiş A549 hücrelerinde (Şekil 7A) 'de 8-okso-dGuo seviyeleri bir MS-esaslı yöntemi 13 ile ölçülmüştür ne çok benzer idi. MS-tabanlı yöntemler 13 için tarif edilen tedbirlerin alınmasını da HPLC-ED ile hassas 8-okso-dGuo ölçümü elde etmek için, numune hazırlama ve analiz sırasında arzu edilmeyen bir DNA oksidasyon minimizasyonu izin verdiğini düşündürmektedir. 8-okso-dGuo seviyelerinin azalan burada görüldüğü gibi pro-oksidan tedavi sonrasında otopsi veya hasat kültür hücreleri Zamanlama, bir başka önemli faktör olabilirson tedaviden (Şekil 7B) sonra 24 saat vs 4 saat sonra dalak. Bu DNA hasarını ortadan kaldırmak için baz eksizyon onarım aktivasyonu nedeniyle olabilir.
tarif edilen metodun, iki açık kısıtlamalar aşağıdaki gibidir: (1) DNA oldukça büyük miktarlarda ihtiyacı (numune başına 80 ug, üç teknik çoğaltır elde etmek için) ve ko-elüsyon bileşiklerden (2) potansiyel girişim. Bu, sadece çok küçük (yani, yaklaşık 15 mg), dalak (toplam doku ağırlığının yaklaşık% 15) bir parça için doku yeterli miktarda bırakarak, DNA 80 ug elde etmek için yeterli olduğu bulunmuştur, diğer (örneğin, gen ekspresyonu) analiz eder. çıkarılan DNA miktarı artefakt DNA oksidasyonu 23,24,25 etkileyen bir başka önemli parametredir. Bu nedenle, biz burada öneririz oldukça büyük (~ 80 mg / numune) ile çalışan artefakt DNA oksidasyonu 25 en aza indirmek için> 30 mg kullanarak önceki tavsiyeleri ile uyumludur.Bu 2-3 koşular için yeterli olmalıdır çünkü küçük dokularda (örneğin, hipokampus), bir, 20-30 mikrogram DNA ile başlamak protokol küçültün olabilir. DNA Büyük miktarlar muhtemelen arka plan gürültü yukarıdaki piklerin çözünürlüğünü kolaylaştıracak, ancak bu deneysel olması potansiyel müdahale maddelerin varlığı bir vaka ile ayrı ayrı ele alınabileceği doğrulanmadı kalır ve her zaman gelen DNA örneği dahil etmek esastır in vitro veya oksidatif DNA hasarına neden olduğu bilinen bir pozitif kontrol ile in vivo tedavi aynı anda (Şekil 7).
Fosfat tampon fosfat, alkalin fosfataz aktivitesi azaltmak için rapor edilmiştir, ancak, bu yöntem optimizasyon deneyleri (Şekil 5) fosfat tampon maddesi kolaylıkla kullanılabilir doğruladı. Fosfat tamponu, mobil faz içinde ihtiva olduğu için, örnek hazırlanmasında kullanımı sol nedeniyle dedektör gürültü azaltılmışKarıştırma havalandırın. Dolayısıyla gerilim, tampon bileşimi, DNA izolasyonu ve sindirim optimize edilmiştir ve pozitif kontrol dahil edildi. Ayrıca, bu değişkenler daha bireysel laboratuvarlar tarafından optimize edilebilir nasıl özetleyen bir özeti verilmektedir. Amacımız 8-okso-dGuo saptanması ve ölçülmesi için bir tahlil geliştirme amaçlı uzman laboratuarlar için yararlı olabilir bir yöntem hazırlamaktır.
Ancak, biz analitik prosedürlerin doğrulanması (yani, ICH Q2 (İnsan Kullanımı (İSK) için İlaç Ruhsatlandırma Teknik Gereksinimleri Uyumlaştırılması Uluslararası Konferansı tarafından önerilen doğrulamaları adımlar altında belirtilen yöntemin resmi doğrulama gerekli olduğunu unutmayın R1) 26). Kısaca, kantitatif doğrulama unsurları Testi Yeni sitesinin incelemelidir: çivili-8-oxo-dGuo farklı miktarlarda numune dahil ederek gerçekleştirilebilir 1) doğruluğu (; ext genelinde 2) aralığı ve doğrusallık (doğrusal tepkiuçlu analit konsantrasyonu; 3) Hassas (tekrarlanabilirlik ve uyarlık); Algılama 4) sınırı (genellikle noktası, sinyal gürültü oranı daha yüksek veya 2-3 eşit, bu matris-bağlı) olabilir; Tepkisi, bazı önceden tespit edilen seviyelere, örneğin 2 x kontrol standart sapmasını karşılayan, 5) nicelendirme limiti (konsantrasyon Matris-bağlı) olabilir; Düzgün çözümleri karşı kompleks örneklerinde) analit tespit etmek 6) seçicilik / özgünlüğü (yeteneği; 7) uyarlık () farklı operatörler farklı laboratuvarlarında aynı sonucu elde etmek için yeteneği; ve 8) sağlamlık ve sistem uygunluk. ICH tarafından tavsiye edilen doğrulama amacı, "Onun amacına uygun" ve birçok laboratuarlar olasılıkla farklı amaçlara sahip olacak göstermek olduğundan, bu testin müstakbel kullanıcılar gerekli görülen ölçüde bu doğrulamak gerekir. 8-okso-dGuo Doğru ölçümü toksikoloji ve moleküler tıp günah arzu edilirnasıl oksidatif stres anlayış ve daha spesifik DNA oksidasyonu artırabilir ce, mekanistik ve ampirik olumsuz sağlık etkileri ile bağlantılıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu araştırma Health Canada Genomik Araştırma ve Geliştirme Girişimi (GRDI) ve Biyoteknoloji Kanada Yasal Stratejisi (CRSB) tarafından finanse edildi. Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması var.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details. |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E. coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH) |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
References
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
- Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
- Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
- Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
- Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
- Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3rd, Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
- Park, J. -H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
- Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
- Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
- Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
- Test No. 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays. , Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). Available from: http://www.oecd-ilibrary.org (2015).
- Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
- European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
- Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
- Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
- Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
- Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
- Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
- Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
- Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
- Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
- Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
- Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf (2015).
