Abstract
Mekanismene som regulerer virkningen av thymus utvalg forblir dårlig definert. Metoden som presenteres her gjør in vivo analyser av utviklingen og utvalg av T-celler spesifikke for seg selv og fremmede antigener. Tilnærmingen innebærer implantasjon av tymiske grafts hentet fra ulike eldre mus inn immunsvikt SCID mottakere. I løpet av en relativt kort tidsperiode mottakerne er fullstendig rekonstituert med T-celler avledet fra den implanterte thymus pode. Bare thymocytter poding av thymus på tidspunktet for isolasjon gjennomgå seleksjon og utvikle seg til modne T-celler. Som sådan, kan forandringer i naturen og spesifisiteten til de innpodet T-celler som en funksjon av aldersavhengig tymiske hendelser bli vurdert. Selv om det teknisk kompetanse er nødvendig for vellykket thymisk transplantasjon, gir denne metoden en strategi for å studere in vivo et bredt spekter av patologier som skyldes eller et resultat av avvikende thymisk funksjon og / eller homeostaser.
Introduction
Thymus er et organ der kritiske hendelser i T celle utvikling oppstå en. Hørende thymocytter, ved omleiring av T-cellereseptoren (TCR) α og β gener, gjennomgår en serie av interaksjoner med lymphostromal og antigenpresenterende celler (APC) i de kortikale og medullære regioner av thymus 2. Tymisk positiv utvelgelse er mediert av kortikale tymiske epitel-celler (TEC) for å produsere tymocytter som gjenkjenner antigene peptider i sammenheng med verten hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I og II molekyler 2-3. Påfølgende thymic negativ seleksjon innebærer sletting av autoreaktive tymocytter, drevet av et samspill med medullær TEC eller dendrittiske celler (DC) som presenterer peptider som stammer fra selv proteiner bundet av MHC klasse I og II molekyler tre. Sluttresultatet av disse prosessene er etableringen av en pool av modent CD4 + og CD8 + T-celler i stand til å svare på et bredt spektrumav fremmede antigener mens utstilling minimal reaktivitet til selv proteiner fire.
Effektiviteten av tymiske utvalgs hendelser påvirkes av en rekke faktorer, inkludert thymic modning, hyppighet av medullær og kortikal TEC, undergruppe sammensetningen av thymic DC, og kilden til thymic forløpere tre. Spesielt, kan avvikende thymisk valg medføre autoimmune 5 eller immunsvikt patologier, som oppstår fra svekket negativ eller positiv seleksjon, respektivt. De molekylære hendelser som regulerer thymisk valg, men er dårlig forstått. In vitro tilnærminger som reaggregate tymiske organkulturer (RTOC) 6, har vist seg å være nyttig for å analysere grunn hendelser assosiert med thymus-utvalg, men mislykkes i å fullt ut rekapitulere dynamikken i løpende in vivo hendelser. Som et resultat ble det thymisk transplantasjon tilnærming etablert for å studere bedre thymocytt seleksjons hendelser in vivo 7
Denne protokollen beskriver transplantere thymus fra nyfødte og voksne donor mus inn immunsvikt scid resipientmus. Denne teknikken gjør det mulig å studere mekanismene som regulerer positive og negative thymisk valg, samt tymisk produksjonen av forskjellige T-celleundersett under ontogeny. I det siste har denne metode blitt benyttet for å demonstrere at effektiviteten av thymus-valget er begrenset tidlig etter fødselen hos mus fører til økt utvikling av autoreaktive T-celler, og en redusert T-cellerepertoaret spesifikk for fremmede antigener 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Murine studier ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of North Carolina Chapel Hill og alle dyr omsorg var i samsvar med de IACUC retningslinjer.
1. Utarbeidelse av nyfødte og Adult Thymi
- Forbered alle reagenser og utstyr før euthanizing giver mus.
- Sterilisere kirurgiske instrumenter ved autoklavering eller andre passende metoder. Alle kirurgiske prosedyrer må utføres under en laminær hette for å opprettholde sterile forhold og unngå forurensning. Montere de verktøyene som trengs for utvinning av thymus fra giver mus.
- Fyll en 60 mm tallerken med steril 1x PBS (pH 7,4) og legg på is på innsiden av panseret. Dette vil bli brukt til en kort butikken thymus fjernet fra donor mus før transplantasjon.
- Per etiske retningslinjer, avlive nyfødte giver mus ved halshogging og voksen donor mus ved CO 2 kvelning fulgt av halsdislokasjon.
- For removal av thymus: Lå musen i en rygg liggende posisjon på et sterilt absorberende tørkepapir og spray med 70% etanol før du gjør et snitt.
- Expose mage- og brysthulen ved å lage en midtlinjen snitt gjennom huden. Brett huden over brystet og forbein for å avsløre brysthula.
- Lag to laterale snitt gjennom membranen og brystkasse å avsløre den overlegne mediastinum og fremre brysthulen. Thymus skal være synlig som hvite to fliker umiddelbart over og tilstøtende til hjertet.
- Erte hverandre bindevevet rundt thymus med fin pinsett, gjøre visse ikke å forstyrre kapselen. Hold tilbake brystkasse med pinsett, bruker et andre par tang for å trekke ut de to fliker av thymus ved å plassere buet pinsett under organ og trekke vertikalt. Dette kan gjøres ved hjelp av en dissekere omfang for å trekke ut thymus fra nyfødte mus.
- Plasser thymus i 60 mm dish inneholdende sterilt 1 x PBS (pH 7,4) på is og separate thymus-lober ved å skjære gjennom binde isthmus. Fjern eventuelle rester fra thymus lapper gjør visst ikke å skade kapselen, og kuttet thymus inn riktig antall seksjoner for transplantasjon.
- Ikke manipulere thymus hentet fra nyfødte mus.
MERK: Brukes for maksimalt to resipientmus (en lapp per mottaker). - Transplantasjon ble thymus oppnådd fra voksne mus til et maksimum på 4-6 resipientmus. Ved hjelp av en pinsett, omhyggelig gripe en voksen thymisk lapp, som vist i figur 1, thymus skåret i tre like deler ved hjelp av kirurgiske sakser.
- Gjenta trinn 1.3 til 1.4 for hver donor mus. For å begrense tiden thymus er eksponert, fremstille en donor thymus på en gang.
2. Thymus Implantasjon Under nyrekapslen
- Montere pre-sterilisert utstyr oppført i tabell 1. Riktig aseptiskTeknikken bør benyttes i løpet av prosedyren for å hindre eksponering av transplantasjons-mottakere til forurenset verktøy eller reagenser.
- Før transplantasjonen, veie og merke hver mottaker mus.
- Sett opp disseksjonsmikroskop og anestesi krets i laminær hette.
- Ved hjelp av en elektrisk barberhøvel, barbere venstre side av mottakeren mus og sikre at ingen hår forblir rundt området som brukes til å lage snittet.
- Slå på isofluorane vaporizer og bedøve musen med en dose på mellom 1-2%. Fastslå riktig anesthetization før du starter den kirurgiske prosedyren ved å sjekke for et fravær av refleks følgende tå klype.
- Etter at musen er ordentlig bedøvet, gjelder veterinær salve til øynene av musen for å hindre tørrhet og forberede musen for transplantasjon som følger:
- Før musen under dissekere mikroskop i en høyre side liggende posisjon slik at det barberte side vender opp. Starting i sentrum av det kirurgiske området, dispensere i en sirkulær bevegelse ved hjelp av en engangsoverføring pipette 70% etanol, etterfulgt av povidon-jod (Betadine). Gjenta etanol / betadine behandling tre ganger før du gjør et snitt.
- Ved hjelp av disseksjonssaksen lage en 1-2 cm innsnitt flanke direkte over nyrene.
- Ved hjelp av mellom tang griper bindevev ved siden av nyre og løfte forsiktig nyrene slik at den ligger oppå muskulatur. For å holde nyrene eksponert og på plass over muskulaturen, setter en arm av mellom tang under nyrene, betaler spesiell oppmerksomhet for ikke å forstyrre den nyre ilium.
- For å forhindre uttørking vev, vanne nyren med sterilt 1 x PBS (pH 7,4) i løpet av hvert trinn helt til manipulering av nyre og nyrekapselen er fullført.
- Bruke fin pinsett klemme og løft kapselen nær kanten av nyre mest distalt binyrene til å skille den fra nyrene.
- Bruk en 18 gaugenål for å lage et snitt stort nok til å sette inn forberedt stykke donor thymus (Figur 2A). Vær sikker på å holde kapsel innsnitt så liten som mulig for å hindre forvridning av pode over tid.
- Samtidig som kapselen trekkes bort fra nyrene, bruker et andre par fin pinsett for å sette implantatet under kapselen og skyver thymus så langt fram fra kapsel innsnitt som mulig (figur 2B).
- Fjern tang fra undersiden av nyre, og returnere forsiktig nyrene tilbake på plass gjennom snittet.
- Lukke muskulaturen ved å sy peritoneal veggen og bruke betadine gang lukket. Etter suturering er fullført, gjelder sår klipp for å lukke dermis og bruke betadine til området rundt.
- Returner musen til et bur som har blitt varmet ved hjelp av en varmelampe.
- Overvåke hver postoperativ musen til det gjenvinner full bevissthet og mobilitet, og ikke plasser mus that er ikke utvinnes etter anestesi i et bur med andre dyr.
- Unn mus med postoperative smertelindring medikamenter etter behov. Gi mus med postoperative smertestillende som paracetamol i drikkevannet i en konsentrasjon på 1,6 mg / ml.
- Gjenta trinn 2.3 til 2.9 for hver mottaker mus.
- Sørg for at mus tilbake til normal aktivitet innen 1 time etter operasjonen. Overvåk postoperativ vekt, motoriske ferdigheter, samt drikking og foring aktivitet av hver mus for å bestemme komplikasjoner som oppstår som et resultat av transplantasjon prosedyre.
MERK: Postoperativ vekttap, sammenlignet med pre-operative vekt, samt endret mobilitet eller unnlatelse av å spise eller drikke kan tyde på komplikasjoner. - Overvåke T-celle tilberedning i perifert blod ved blødninger mus via tail nick etterfulgt av separasjon av lymfocytter ved hjelp Lympholyte celleseparering media i henhold til produsentens spesifikasjoner. Oppnå T-celle characterizasjon ved farging lymfocytter med fluorescently konjugerte antistoffer som er spesifikke for T-cellemarkører CD3, CD4, CD8 og, i tillegg til et levende døde diskriminator for eksempel en fluorescerende aktivert succinimidylester 8. Analyse, som vist i figur 3 kan oppnås via separasjon på singletter, levende celler, og CD3-positive celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Suksessen med denne fremgangsmåten er avhengig av minimal kirurgisk traume, så vel som nøyaktig posisjonering av implantatet under nyrekapselen. Den tymisk pode skal kuttes for å sikre riktig størrelse tymiske seksjoner for etterfølgende transplantasjon, som vist i figur 1. Etter skjematisk i figur 1, kan thymus fra nyfødte eller voksne mus anvendes for vellykket subkapsulære transplantasjon med konsistente og reproduserbare T-celle engraftment resultater. Som nevnt, er hensiktsmessig plassering av graftet under nyrekapselen viktig å opprettholde langtidsoverlevelse, funksjon og vaskularisering av graftet. Som vist i figur 2, bør thymisk transplantatet bli plassert på toppen av nyrene, nærmest binyrene (anterior av nyre), på den motsatte enden av det kapsulære innsnitt (posterior av nyre). En vellykket thymisk transplantasjon, når kombinert med en passende hematopoietisk miljø, kan REmain produktiv i overkant av 30 uker 7.
Etter transplantasjon, er innpoding vurdert ved strømningscytometrisk analyse av T-celler oppnådd fra perifert blod. Figur 3 og Tabell 2 viser de typiske nivået av T-celle-innpoding observert i perifert blod og organer hos en transplantatmottaker mottaker 6 uker etter transplantasjonen. Ved hjelp av denne teknikken, har vår gruppe tidligere vist kinetikken av CD4 + og CD8 + T-celle tilberedning i perifert blod over tid i resipienter av nyfødte og voksne thymus. I korte trekk, kan sirkulerende T-celler observeres i periferien innen en uke etter kirurgi og CD4 + og CD8 + T-celletall fortsetter å øke inntil den perifere T-celledelen er fullstendig rekonstituert i 5-6 uker etter transplantasjon 7.
Fig. 2: Plassering av kapsel innsnitt og plassering av tymisk pode en passe stor seksjon fremstilt fra donor thymus er satt inn i subkapsulære rom laget av et lite snitt i nyrekapselen på den bakre enden av nyrene (A). Anterior til nyrene, nærmest binyrene (ikke avbildet), og ved den motsatte enden fra capsular innsnitt, er den optimale posisjon for implantatet som er satt inn under kapselen, som vist i (B).
Figur 3. Bestemme vellykket engraftment via T-celle tilberedning i perifert blod og lymfoide organer. Strømningscytometriske data er representative for T-celle tilberedning observert 6 uker etter transplantasjon i en scid mottaker av et NB tymisk pode. Tilsvarende nivåer av T-celle-innpoding er observert i perifert blod, milt, bukspyttkjertel lymfeknute (PLN), og mesenteriske lymfeknute (MLN) etter vellykket transplantasjon av et transplantat tymisk.
| Fin dissekere tang |
| Medium dissekere tang (2) |
| Fin dissecting tang (buet tip) |
| Betadine Solution |
| 70% etanol |
| 18 gauge nål |
| Dissekere mikroskop m / lyskilde |
| Disposable transfer pipetter (2) |
| Legemidler for smertebehandling: Paracetamol |
| Sterile våtservietter |
| Varmelampe |
| Elektrisk barbermaskin |
| Isofluran og isofluran vaporizer |
| Sting (rask absorberende, vanlig gut) |
| Dissekere saks |
| 9 mm rustfritt stål Wound klipp |
| Sår klipp fjerningsverktøy |
| Steril 1x PBS |
| 60 mm Dish |
Tabell 1:. Materialer som trengs under kirurgisk thymic transplantasjon Liste over nødvendige materialer som brukes til å implantere thymus under nyrekapslen til mottakeren musen. Mengden av spesifiserte materialer er angitt i parentes.
| Total Antall CD4 T-celler | Totalt antall CD8 T-celler | |
| Blod | 1652 celler / υl | 351 celler / υl |
| Spleen | 11546617 | 4203299 |
| PLN | 1241789 | 364918 |
| MLN | 2182266 | 532059 |
Tabell 2. Totalt antall av T-celler i perifert blod og lymfoide organer hos en transplantatmottaker thymus. Totalt antall CD4 + og CD8 + T-celler gjenvunnet fra organer samt perifert blod fra en nyfødt tymisk transplantatmottaker 6 uker post- transplantasjon. Disse tallene er representative for CD4 + og CD8 + T-celle cellularity som vanligvis observert i vellykkede nyfødte og voksne thymic resipienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
- Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Schwartz, R. H.
- Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
- He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J.
- Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
- Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
- Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A.
- Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
- Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
- Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
- Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).
