This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.
De mekanismer som reglerar effekten av tymisk urval förblir dåligt definierad. Den metod som presenteras här tillåter in vivo analyser av utvecklingen och urval av T-celler specifika för sig själv och främmande antigener. Tillvägagångssättet innebär implantation av tymiska ympkvistar som härrör från olika äldre möss i immundefekta scid mottagare. Under en relativt kort tidsperiod mottagarna är helt upplösta med T-celler som härrör från den implanterade bräss transplantat. Endast tymocyter ympning tymus vid tiden för isolering genomgå selektion och utvecklas till mogna T-celler. Som sådan, kan förändringar i naturen och specificitet ympade T-celler som en funktion av åldersberoende tymiska händelser bedömas. Även om teknisk expertis som krävs för en lyckad thymic transplantation, ger denna metod en unik strategi för att studera in vivo ett brett spektrum av sjukdomar som beror på eller till följd av avvikande tymus funktion och / eller homeostasär.
Den bräss är ett organ där kritiska händelser i T-cell utveckling sker 1. Resident tymocyter vid omlagring av den T-cellreceptor (TCR) α och β gener, genomgå en serie av interaktioner med lymphostromal och antigenpresenterande celler (APC) i de kortikala och medullära regioner av tymus 2. Tymus positiv selektion förmedlas av kortikala tymiska epitelceller (TEC) för att producera tymocyter som känner igen antigenpeptider i samband med värden större histokompatibilitetskomplex (MHC) klass I- och Il-molekyler 2-3. Efterföljande tymisk negativ selektion innebär rening av autoreaktiva tymocyter, som drivs av en interaktion med medullär TEC eller dendritiska celler (DC) som presenterar peptider härledda från kroppsegna proteiner som är bundna av MHC klass I och II molekyler 3. Slutresultatet av dessa processer är inrättandet av en pool av mogna CD4 + och CD8 + T-celler kan svara på ett brett spektrumav främmande antigener samtidigt uppvisar minimal reaktivitet mot kroppsegna proteiner 4.
Effektiviteten av tymiska urvals händelser påverkas av en mängd faktorer, inklusive tymisk mognad, frekvensen av medullär och kortikal TEC, delmängd sammansättningen av tymus DC, och källan till tymiska prekursorer 3. Särskilt kan avvikande thymic val resultera i autoimmuna 5 eller immundefekta sjukdomar, som uppstår av nedsatt negativ eller positiv selektion, respektive. De molekylära händelser som reglerar tymisk val, dock dåligt kända. In vitro metoder såsom reaggregate tymiska organkulturer (RTOC) 6, har visat sig vara användbart för att analysera grundläggande händelser i samband med tymisk val, men misslyckas med att fullt ut sammanfatta dynamiken i pågående in vivo-händelser. Som ett resultat, var detta tymisk transplantation baserat tillvägagångssätt inrättas för att bättre händelser studie tymocyt urval in vivo 7 </supp>.
Detta protokoll beskriver trans Thymi från nyfödda och vuxna donatormöss i immunodeficienta scid recipientmöss. Denna teknik medger studier av mekanismerna som reglerar positivt och negativt tymisk val, såväl som tymisk produktion av olika T-cellunderuppsättningar under ontogeni. Senast har detta tillvägagångssätt använts för att visa att effektiviteten i thymic val begränsas tidigt efter födseln hos möss leder till ökad utveckling av autoreaktiva T-celler, och en minskad T-cellsrepertoar specifik för främmande antigener 7.
Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).
Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.2 |
Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
18 gauge needle | BD | 305195 | |
Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
1.2mL polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
5mL polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60mm x 15mm, Sterile |