Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Papieren Inrichtingen voor isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes

doi: 10.3791/52722 Published: April 3, 2015

Summary

Dit protocol Gegevens methode extracellulaire blaasjes (EV), kleine membraneuze deeltjes vrijgemaakt uit cellen te isoleren, van slechts 10 pl serummonsters. Deze benadering omzeilt de noodzaak van ultracentrifugatie, vereist slechts enkele minuten testtijd en maakt de isolatie van EV uit monsters van beperkte omvang.

Abstract

Extracellulaire blaasjes (EV's), membraneuze deeltjes die vrijkomen uit verschillende soorten cellen, het bezit van een groot potentieel voor klinische toepassingen. Zij bevatten nucleïnezuur en eiwit lading en worden steeds meer erkend als een middel van intercellulaire communicatie gebruikt door zowel eukaryote en prokaryote cellen. Vanwege hun geringe omvang huidige protocollen voor isolatie van EV vaak tijdrovend, omslachtig en grote monstervolumes en dure apparatuur, zoals een ultracentrifuge nodig. Om deze beperkingen aan te pakken, ontwikkelden we een papieren immunoaffiniteit platform voor het scheiden van subgroepen van EV's dat is gemakkelijk, efficiënt, en vereist monster volumes zo laag als 10 pi. Biologische monsters kunnen direct worden gepipetteerd op papier testzones die chemisch zijn gewijzigd met capture moleculen die een hoge affiniteit voor specifieke EV oppervlakte markers hebben. We valideren de test met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM), op papier gebaseerde enzym-gekoppelde immunosorbent assays (P-ELISA), en transcriptoomanalyse. Deze papieren apparaten zal de studie van EV's in de kliniek en de instelling onderzoek mogelijk maken om te helpen tot een beter begrip van de EV-functies in gezondheid en ziekte.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Een algemeen schema van de operatie procedure wordt gegeven in figuur 1. Met behulp van ethische praktijken, we verzamelde bloedmonsters van gezonde proefpersonen, en verkregen waterige humor monsters van patiënten via de Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan onder IRB goedgekeurde protocollen ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. Fabrication papier Devices

  1. Snijd chromatografie papier in kringen van 5 mm in diameter dezelfde opstelling als een 96-well microtiter plate. Sandwich deze papieren stukken met twee polystyreen platen met maatschappelijke doorgaande gaten, en laminaat.
  2. Wijzigen papier apparaten die gebruik maken van de chemische conjugatie methode in de volgende stappen 28 beschreven.
    1. Behandel papier apparaten met zuurstofplasma (100 mW, 1% zuurstof, 30 sec) in een plasmakamer.
      LET OP: Speciale voorzichtigheid moeten worden genomen bij het ​​werken met 3-mercaptopropyltrimethoxysilaan en N -γ-maleimidobutyryloxy succinimideester (GMBS), aangezien ze allebei vochtgevoelig en toxisch. Draag beschermende handschoenen en inademing vermijden of contact met de huid en ogen. Houd het flesje goed gesloten en laat het in evenwicht te RT voor de opening om condensatie van water te voorkomen. Als alternatief opent u het flesje in een met stikstof gevulde handschoen zak of doos. Aliquot in kleine flesjes te frequent openen van het flesje te vermijden.
    2. Onmiddellijk Incubeer behandelde papier inrichtingen in een 4% (v / v) oplossing van 3-mercaptopropyltrimethoxysilaan in ethanol (200 proof) gedurende 30 min.
    3. Spoel papier apparaten met ethanol en incubeer ze met 0,01 umol / ml GMBS in ethanol gedurende 15 min.
    4. Spoelen met ethanol (200 proof) en incubeer papier apparaten met 10 ug / ml avidine oplossing in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 1 uur bij 4 ° C. Bewaar bij 4 ° C indien nodig, en binnen 4 weken.
  3. Bevochtig elk document beproevingszones met 10 pl PBS dat 1% (w / v) runderserumalbumine (BSA) Gedurende 3 x 10 min voor spotting 10 pl gebiotinyleerd vangende moleculen gedurende 3 x 10 min. Met anti-CD63 antilichaam (20 ug / ml in PBS bevattende 1% (w / v) BSA en 0,09% (w / v) natriumazide) en annexine V (01:20, v / v in annexine V binding buffer) als capture moleculen.
  4. Spoel ongebonden anti-CD63 antilichaam of annexine V moleculen met 10 pi corresponderende PBS bevattende 1% (w / v) BSA of annexine V binding bufferoplossingen voor 3 x 1 min, respectievelijk.

2. Serum en kamerwater Sample verzamelen en verwerken

  1. Serum collectie.
    1. Verzamel 10 ml van perifeer bloed door venapunctie in serumafscheiding buizen en voorzichtig omkeren van de buis vijf keer. Zet de buis verticaal en wacht 30 minuten.
    2. Centrifugeer bij 1200 xg gedurende 15 min. Breng het serum van de toplaag naar een schone buis en centrifugeer opnieuw bij 3000 xg gedurende 30 min.
    3. Passeren de bovenstaande vloeistof op een 0,8 micrometer filter. Laat het monster bij -80 ° C tot gebruik.
  2. Kamerwater collectie: verzamel kamerwater monsters van patiënten gediagnosticeerd door een oftalmoloog rechtstreeks via invasieve procedures en bewaar monsters bij -80 ° C tot gebruik.

3. Isolatie van extracellulaire blaasjes

  1. Schepmonsters op elk papier testzone met een snelheid van 5 pl / min.
  2. Spoel ongebonden EV met 10 pi corresponderende PBS bevattende 1% (w / v) BSA of annexine V binding bufferoplossingen voor 3 x 1 min voor papier apparaten gefunctionaliseerd met anti-CD63 antilichaam of annexine V moleculen resp. Voer de volgende stroomafwaarts assays.

4. Downstream Assay Voorbeeld 1: Scannen Electromicrographs

  1. Fix EV's vastgelegd op gefunctionaliseerde papier testzone met behulp van 10 pi 0,5 × Karnovsky's fixatief gedurende 10 min.
  2. Spoel de monsters met ruime PBS gedurende 2 x 5 min.
  3. Dehydrateer demonsters latere 35% ethanol gedurende 10 min, 50% ethanol gedurende 2 x 10 min, 70% ethanol gedurende 2 x 10 min, 95% ethanol gedurende 2 x 10 minuten, en 100% ethanol gedurende 4 x 10 min.
  4. Kritische droog en sputteren vacht van de monsters met palladium / goud, en te onderzoeken met behulp van een scanning elektronenmicroscoop werkte bij lage elektron versnelling spanning (~ 5 kV).

5. Downstream Assay Voorbeeld 2: Papier-gebaseerde ELISA

  1. Voeg een 5 ul oplossing met anti-CD9 primair antilichaam op 1: 1000 verdunning in PBS aan elke test zone met gevangen EV's. Wacht 1 min.
  2. Spoel de monsters met 30 ml PBS geschud bij 100 rpm gedurende 30 sec.
  3. Voeg een 5 ul oplossing met mierikswortel peroxidase (HRP) -gebonden secundair antilichaam op 1: 1000 verdunning in PBS en wacht 1 min.
  4. Spoel de monsters met 30 ml PBS geschud bij 100 rpm gedurende 30 sec.
  5. Voeg 5 ul colorimetrisch substraat met 1: 1 volumeverhouding van waterstofperoxide eend 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) en scannen met behulp van een desktop scanner.

6. Stroomafwaarts Test Voorbeeld 3: RNA Isolation

  1. Dompel de monsters in 35 ul-polyvinylpyrrolidone gebaseerde RNA-isolatie hulp en 265 ul van lysis / binding buffer om EV's gevangen lyseren. Vortex krachtig.
  2. Voeg 30 ul homogenaat verschaft in de isolatiekit het lysaat. Vortex krachtig en zet op ijs gedurende 10 min.
  3. Extraheer het RNA met zuur fenol-chloroform scheiding in de volgende stappen beschreven.
    1. Neem 330 ui fenol-chloroform van de onderste laag van de fles en aan het homogenaat / lysaat. Vortex krachtig.
    2. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5 minuten. Breng de waterige (bovenste) fase naar een schone buis en noteer het volume verwijderd.
  4. Neerslag het totale RNA met 100% ethanol van het volume dat is 1,25 maal het volume van de waterfase verwijderd in de vorige stap en collect het RNA in de elutie-oplossing voorverwarmd tot 95 ° C.
  5. Concentreren en verder te zuiveren het RNA met een RNA cleanup kit volgens het protocol van de fabrikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het vermogen van het papier apparaat om subgroepen van EV's te isoleren efficiënt vertrouwt op haar gevoelige en specifieke erkenning van EV oppervlakte markers. De stabiele modificatie van papiervezels aan vangende moleculen is mogelijk door avidine-biotine chemie zoals elders 28-30 beschreven. De effectiviteit van chemische conjugatie en dat van de fysisorptie werkwijze wordt beoordeeld op basis fluorescentie gebaseerde uitlezingen. Het papier testzones worden bereid volgens het protocol stap 1), behalve de vangst molecuul wordt vervangen door 20 ug / ml fluorofor R-fycoerythrine-geconjugeerde biotine moleculen (PE-biotine) in stap 1.3. Het papier beproevingszones worden vervolgens gespoeld met PBS om ongebonden PE-biotine-moleculen te verwijderen. Daarentegen 10 ui 20 pg / ml PE-biotine in PBS bevattende 1% (w / v) BSA en 0,09% (w / v) natriumazide direct gespot op het papier testzone gedurende 3 x 10 min, gevolgd door PBS Spoel de uitvoering van de fysisorptie van PE-biotine kleurstofmoleculen. Scheikundiggewijzigde papier apparaten ("paper + verharder + kleurstof") samen met onverwerkte papier apparaten ("paper"), papier apparaten bewerkt met hetzelfde protocol zonder toepassing van PE-biotine moleculen ("paper + verharder") en papier apparaten met fysisch gesorbeerde PE-biotine moleculen ("fysisch gesorbeerde-dye") worden gescand met behulp van een foto-opname systeem ingesteld op 540-560 nm excitatie, 575 nm-lange-pass-uitstoot, en de gegevens worden opgeslagen in de vorm van 16-bits bestanden en geanalyseerd met ImageJ software. Zoals getoond in figuur 2A, fluorescentie-intensiteit van testzones bereid door chemische conjugatie werkwijze aanzienlijk hoger, vergeleken met fysisch gecoat papier beproevingszones (p-waarde <0,0005, n = 5, t-toets). Het vastleggen van EV's is ook specifiek zoals geïllustreerd in figuur 2B, C, waar weinig EV's op het papier apparaat worden bewaard als de capture moleculen worden vervangen door PBS oplossing.

EV's zijn heterogeen in siZes, specifieke inhoud, en biogenese routes. Om ze te binden, papier apparaten bekleed met twee verschillende EV invangmoleculen, anti-CD63 antilichamen en annexine V, werden voorbereid. CD63, een lid van de familie tetraspanine (die CD9, CD63, CD81 en CD82 moleculen bevat) verrijkt op EV membraan 31 en annexine V heeft een sterke affiniteit voor fosfatidylserine (PS) 32,33. Het blijkt dat EV constitutief vrijkomen tijdens vroege apoptose of onder stress omstandigheden, welke werkwijze normale cel fosfolipide asymmetrie verloren, leidend tot verhoogde blootstelling van PS op de buitenste laag van de EV membraan. Analyses van SEM beelden tonen de grootteverdeling van CD63 + EV en PS + EV zijn verschillend met gemiddelde diameters van 80 en 43 nm respectievelijk (figuur 3) .De tweezijdige t-toets wordt gebruikt om de statistische p-waarde te bepalen (p-waarde <0,0001). Verrassend, CD63 + EV's verschijnen ronder en groter dan de PS + EV gemiddeld, dat biologischebetekenis moet nog worden opgehelderd.

RNA van EV gevangen op het papier kan worden losgenomen. Analyses met een bioanalyzer vertoonden gelijkaardige algemene profielen totaal RNA geëxtraheerd van CD63 + en PS + EV (figuur 4A). In vergelijking met de hoeveelheden RNA geëxtraheerd met de microfluïdische en ultracentrifugatie technieken respectievelijk ongeveer twee keer en 39 keer meer RNA per volume-eenheid serummonster werd geëxtraheerd onder toepassing van de inrichting papier, zij met een kleiner monstervolume (Tabel 1). P-ELISA kan voor de detectie van EV uitgevoerd. Anti-CD9 primair antilichaam en HRP-geconjugeerd secundair antilichaam worden in deze studie. Figuur 4B toont grijze waarde verandert door de enzymatische reactie van HRP papieren inrichtingen toegepast 10 pl PBS, 50% serum (verdund met PBS), of 100 % serum resp. De grijswaarde lineair toeneemt binnen het bereik van serum getest.

bijvoorbeeld, ultracentrifugatie, moeten worden gebruikt. EV van patiënt kamerwater monsters geïsoleerd met papier inrichtingen bekleed met anti-CD63 antilichamen kunnen worden gezien in SEM beelden zoals getoond in figuur 5.

Figuur 1
Figuur 1. De fabricage en bedieningsprocedure van op papier gebaseerde testen ter isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes. (A) filterpapier wordt gesneden in de gewenste vorm en gelamineerd. (B) Het oppervlak van het papier is gemodificeerd met een korte behandeling van zuurstofplasma en omgezet met 3-mercaptopropyltrimethoxysilaan, N </ Em> -γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester, en neutravidine, in die volgorde. Gebiotinyleerd vangende moleculen, bijvoorbeeld antilichamen, kunnen dan worden geïmmobiliseerd via de sterke affiniteit van biotine en neutravidine moleculen. (C) Biosamples kan pipet op de gefunctionaliseerde papier apparaat. Extracellulaire vesicles kunnen worden geïsoleerd. (D) Downstream assays, zoals SEM, transcriptome, en ELISA (afgebeeld), kan worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. extracellulaire blaasjes (EV) kan worden vastgelegd op gefunctionaliseerd papier apparaten met goede specificiteit en gevoeligheid. (A) Fluorescerend gemerkte biotine moleculen sterk geïmmobiliseerd op het papierapparaat via chemische conjugatieproces ("paper + verharder + kleurstof") in tegenstelling tot fysische adsorptie ("fysisch gesorbeerde-dye"). Onbewerkte papier ("papieren") en vervoeging moleculen ("paper + verharder") weinig bijdragen aan de fluorescentie-intensiteit. Een representatief SEM afbeelding toont enkele EV (B) worden vastgelegd op het papier apparaat niet-specifiek wanneer de vangende moleculen wordt vervangen door PBS dat 1% (w / v) BSA. (C) Veel EV's op papier apparaten gecoat met anti-CD63 antilichamen behouden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3-mercaptopropyl
Figuur 3. De subgroepen van extracellulaire blaasjes (EV's) kunnen verschillende grootte distributies hebben. (A)en (B) zijn representatief SEM beelden van EV vastgelegd op papier toestellen gecoat met anti-CD63 antilichamen en annexine V moleculen resp. (C) CD63 + EV's groter lijken dan PS + EV's onder experimentele omstandigheden die in deze studie (p-waarde <0,0001, n = 124 en 203, t-toets). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Stroomafwaarts transcriptoom en ELISA assays. (A) Bioanalyzer data die de intensiteit (y-as, in arbitraire eenheden) en grootte (x-as, in nucleotiden (nt)) verdelingen van fluorescentie-gemerkt totaal RNA geëxtraheerd uit EV gevangen op anti-CD63 antilichaam of annexine V-gecoate papieren filters. Het migreren piek bij ~ 25 nt vertegenwoordigt interne standaard. (B) verandert Grey waarde geproduceerd door de enzymatische reactie van mierikswortelperoxidase (HRP) in de P-ELISA-bepaling voor papier inrichtingen toegepast 10 pl monsters van PBS, 50% serum (verdund met PBS) en 100% serum. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. extracellulaire blaasjes (EV's) in waterige humor monsters kunnen van patiënten worden vastgelegd op gefunctionaliseerde filterpapier zonder monster pooling. SEM beelden van geïsoleerde CD63 + EV's in waterige humor monsters met (A) leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, (B) diabetisch maculair oedeem, en (C) polypoidal choroïdale vasculopathie, respectievelijk.belasting / 52722 / 52722fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

isolatiemethode capture molecuul serum vol. (Pl) gemiddelde RNA geëxtraheerd (ng) gemiddelde geëxtraheerde RNA / serum
(Pg / pl)
ratio van de totale RNA / serum ref
microfluïdische apparaat anti-humaan CD63 400 4.14 10.4 20 20
papier apparaat anti-humaan CD63 72 1,49 ± 0,08 20.7 39 22
papier apparaat annexine V 72 0.99 ± 0.26 13.8 26 22
ultracentrifugeren - 2000 1.06 ± 0.64 0.53 1
serum - 72 1,23 ± 0,58 17 32 22

Tabel 1. Totaal RNA geëxtraheerd uit serummonsters van gezonde vrijwilligers onderzocht met een bioanalyzer (n = 4 voor alle omstandigheden).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De meest kritische stappen voor een succesvolle isolatie van subgroepen van extracellulaire blaasjes zijn: 1) een goede keuze van papier; 2) stabiele en hoge dekking van vangende moleculen aan het oppervlak van de vezels; 3) de goede behandeling van monsters; en 4) de algemene hygiëne in laboratoria praktijk.

Poreuze materialen zijn gebruikt in vele goedkope en apparatuur vrij assays. Zij kunnen afstembare poriegrootte veelzijdige toepassing, lage kosten en hoge oppervlakte-volume verhouding toelaat passieve wicking vocht. We kozen voor chromatografie cellulosepapier graad 1 voornamelijk voor de juiste poriegrootte en lage eiwitadsorptie. Vergeleken met andere veelgebruikte poreuze materialen, nitrocellulose, cellulose papier heeft veel lagere niet-specifieke eiwitadsorptie 34. We vinden ook weinig aspecifieke vangst van EV's in deze studie. Bovendien zijn de partikelretentie niveau 11 um, groter dan de grootte van EV 35, waarbij specifieke registratie integenstelling tot fysieke vangen van EV's. Hier richten we ons op EV's van een kleiner formaat door het passeren van serum monsters door een 0,8 um filter, die stap kan worden gewijzigd wanneer grotere EV's moeten worden bestudeerd.

Chemische modificatie van het oppervlak kan een sleutel tot een stabiele en hoge dekking van invangmoleculen bereiken op het oppervlak als een middel ter verbetering van de efficiëntie van de EV isolatie zijn. Oppervlakte modificaties van cellulose zijn beoordeeld 36,37. Er zijn grote aantallen hydroxyl (-OH) groepen op het oppervlak van cellulose en zij kunnen reageren met silaan stabiele chemische Si-OC bindingen geven bij activeerbaar met zuurstofplasma of andere condensatieproces. De silaan gebruikt in deze studie is (3-mercaptopropyl) trimethoxysilaan, (MeO) 3Si- (CH2) 3 -SH. De thiol (-SH) groep kan reageren met GMBS een korte arm (0,73 nm) en een verknoping groep die paren met primaire amines bieden. Vangende moleculen met aminogroepen worden geconjugeerddirect GMBS. In deze studie, maar geconjugeerd we neutravidine plaats daarvan een algemene regeling verschillende vangende moleculen die met biotine gemerkt zijn conjugaat. Echter, consensus EV subtype-specifieke markers is nog niet bereikt 17. Neutravidine heeft een zeer sterke affiniteit voor biotine en een bijna neutrale iso-elektrische punt (pH 6,3), minimaliseren niet-specifieke interacties met negatief geladen voorwerpen, bijvoorbeeld het oppervlak van EV. Daarentegen avidine met een iso-elektrisch punt van 10,5 draagt ​​positieve ladingen bij neutrale pH. Een hogere concentratie van anti-CD63 antilichaam wordt dan in Chen et al. 20, voornamelijk vanwege de kleine omvang toegepast en het grotere oppervlak-tot-volumeverhouding van papier apparaat. De hoeveelheid en samenstelling van eiwitten geadsorbeerd op de papiervezels werden niet bepaald, eventueel monster-afhankelijk is. Daarom is voorzichtigheid geboden bij het interpreteren van de resultaten van eiwit analyse.

Verzamelde bische monsters moet voorzichtig worden behandeld en snel verwerkt om artifactually verhoogde EV niveaus voorkomen. Het wordt aanbevolen om cellen en bloedplaatjes te verwijderen, eventueel voor opslag bij -80 ° C. Een huidige standaardisatie van behandelen van het monster in EV onderzoek zijn te vinden in deze beoordeling 17.

Goede hygiëne in laboratoria praktijk moet worden toegepast. Draag altijd handschoenen en verandering handschoenen regelmatig om de introductie van stofdeeltjes en ribonucleasen minimaliseren. Isolatie van RNA van EV in celkweek geconditioneerde media kan meer dan 70 keer hoger door gebruikmaking papier inrichtingen opbrengst vergeleken met die onttrokken EV geconcentreerd met de ultracentrifuge methode (ongepubliceerd).

De hier beschreven protocol gebruikt cellulosepapier apparaten chemisch gewijzigd met capture moleculen aan verschillende subgroepen van EV's te isoleren. De werkwijze is eenvoudig, efficiënt en bijzonder waardevol wanneer het monstervolume beperkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd mede ondersteund door de Taiwan National Science Council grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) en NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC), en de Veterans General ziekenhuizen en Universiteit Systeem van Taiwan Joint Research Program (CC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chromatography Paper GE Healthcare Life Sciences 3001-861 Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane Sigma Aldrich 175617 This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
Ethanol Fisher Scientific BP2818 Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA) BioShop Canada Inc. ALB001 Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) Pierce Biotechnology 22309 GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
Avidin Pierce Biotechnology 31000 NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 Ancell 215-030 clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin V BD Biosciences 556418 Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibody System Biosciences EXOAB-CD9A-1 The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubes BD Biosciences 367991 Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding buffer BD Biosciences 556454 10x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent set BD Biosciences 555214 The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
Name Company Catalog Number Comments
RNA isolation kit Life Technologies AM1560 MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid Life Technologies AM9690 Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kit Qiagen Inc. 74004 MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamber March Instruments PX-250
Scanning electron microscope Hitachi Ltd. S-4300
Desktop scanner Hewlett-Packard Company Photosmart B110 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record system J&H Technology Co GeneSys G:BOX Chemi-XX8 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9 (2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86 (2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).
Papieren Inrichtingen voor isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).More

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter