Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar

doi: 10.3791/52722 Published: April 3, 2015

Summary

Bu protokol, 10 kadar ul serum örneklerinden, hücre dışı veziküller (EVS), hücrelerden salınan küçük zar parçacıkları izole etmek için bir yöntem göstermektedir. Bu yaklaşım, ultra-santrifüj ihtiyacını önlediği deney süresi sadece birkaç dakika sürer ve sınırlı hacim örneklerinden EV'lerin izolasyonunu sağlar.

Abstract

Ekstrasellüler veziküller (AGH), hücrelerin çeşitli salınan zar parçacıklar, klinik uygulamalar için büyük bir potansiyele sahip. Onlar nükleik asit ve protein kargo içeren ve giderek ökaryotun ve prokaryot hücreler hem tarafından kullanılan arası bir iletişim aracı olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, küçük boyutları için, EV'lerin izolasyonu için mevcut protokoller genellikle, zaman alıcıdır, zaman alıcıdır, ve bu, bir ultra santrifüj gibi büyük örnek hacimleri ve pahalı ekipman gerektirmektedir. Bu sınırlamaları gidermek için, biz, kolay, verimli ve 10 ul kadar düşük örnek hacimleri gerektiren EVs alt grupları ayırmak için kağıt tabanlı imünoafinite platformu geliştirdi. Biyolojik numuneler, kimyasal olarak belirli EV yüzey belirteçleri yüksek afiniteye sahip yakalama molekülü ile değiştirilmiş kağıdı test bölgeleri doğrudan pipetle edilebilir. Biz taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile tahlil doğrulamak, kağıt-tabanlı enzim-bağlı immunosorbent tahlilleri (p-ELISA) ve transcriptome analizi. Bu kağıt-tabanlı cihazlar sağlık ve hastalık EV fonksiyonları anlayışımızı ilerletmek yardımcı klinik ve araştırma ortamında EVs çalışma sağlayacaktır.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Operasyon prosedürünün genel şeması Şekil 1'de verilmiştir. Etik uygulamaları kullanarak, (sağlıklı bireylerde kan örnekleri toplandı ve İDD protokolleri onayladı Tayvan altında Taichung Gaziler General Hospital (TCVGH), Taichung aracılığıyla hastaların sulu mizah örnekleri elde KİK TCVGH No CF11213-1).

Kağıt Cihazların İmalatı 1.

  1. 96 oyuklu bir mikrotitre plakası gibi aynı düzeni sağlamak için, çapı 5 mm olan daireler halinde kromatografi kağıdı kesin. Kayıtlı geçiş delikleri, ve laminat iki polistren levhalar ile bu kağıt parçalarını sandviç.
  2. Aşağıdaki 28 adımları açıklanan kimyasal konjugasyon yöntemi kullanarak kağıt cihazları değiştirin.
    1. Bir plazma odasında oksijen plazmanın (100 mW, 1% oksijen, 30 sn) ile kağıt cihazları davranın.
      DİKKAT: 3-merkaptopropil trimetoksisilan ve N -γ-maleimidobutiriloksi sukkinimid ile çalışırken özel dikkat alınmalıdıresteri (GMBS), her ikisi de neme duyarlı ve zehirli olduğundan. Koruyucu eldiven giyin ve solumaktan kaçının veya deri ve göz ile temas. Sıkıca kapalı stok şişe tutun ve su yoğunlaşmasını önlemek için açmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Seçenek olarak ise, bir azot doldurulmuş eldiven torbası ya da kutu içinde hazır şişe açın. Küçük şişelere içine kısım stok şişe sık açılmasını önlemek için.
    2. Hemen 30 dakika süreyle etanol (200 proof) içinde 3-merkaptopropil-trimetoksi silan bir% 4 (hacim / hacim) çözeltide kağıt cihazları tedavi inkübe edin.
    3. Etanol ile kağıt cihazları yıkayın ve 15 dakika boyunca etanol içerisinde 0.01 umol / ml GMBS ile inkübe edilir.
    4. Etanol (200 proof) içinde yıkayın ve 4 ° C 'de 1 saat süre ile, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 10 ug / ml avidin çözeltisi ile kağıt cihazları inkübe edin. 4 ° C'de muhafaza eğer ihtiyaç ve 4 hafta içinde kullanın.
  3. (BSA 10 ul PBS sığır serumu albümini (ağ / hac),% 1 ihtiva eden her kağıdı test bölgeleri Islak) 3 x 10 dakika için yakalama molekülü biyotinile edilmiş 10 ul tespit önce 3 x 10 dakika karıştırıldı. Veya anneksin V (01:20, anneksin V bağlanması tampon içinde hac / hac), anti-CD63 antikoru kullanarak (PBS ağırlık / hacim) BSA ve% 0.09 (a / h) sodyum azid (w% 1 ihtiva eden 20 ug / ml) yakalama molekülleri.
  4. PBS sırasıyla, 3 x 1 dakika süreyle tampon çözeltileri bağlayıcı BSA veya anneksin V (ağ / hac),% 1 ihtiva eden tekabül eden 10 ul kullanılarak bağlanmamış anti-CD63 antikoru ya da bunun anneksin V molekülleri durulayın.

2. Serum ve Sulu Mizah Örnek Toplama ve İşleme

  1. Serum koleksiyon.
    1. Serum ayırma tüpleri Venipunktür periferik kan 10 ml toplayın ve hafifçe tüpü beş kez ters çevirin. Dikey konumda tüp ayarlama ve 30 dakika boyunca bekleyin.
    2. 15 dakika boyunca 1.200 × g santrifüj. 30 dakika süre ile 3000 x g 'de daha temiz bir tüpe üst tabakadan serum, ve santrifüj aktarın.
    3. 0.8 mikron fil ile süpernatant geçmekter. Kullanılana kadar -80 ° C'de örnek tutun.
  2. Sulu mizah koleksiyonu: kullanana kadar -80 ° C'de doğrudan prosedürler ve mağaza örnekleri invaziv aracılığıyla bir göz hekimi tarafından tanısı konulan hastalarda sulu mizah örnekleri toplamak.

Ekstrasellüler Veziküller 3. İzolasyonu

  1. 5 ul / dakikalık bir oranda, her bir kağıt test bölgesi üzerine Noktası örnekler.
  2. BSA veya anneksin V sırasıyla, anti-CD63 antikoru ya da bunun anneksin V molekülleri ile işlevselleştirilmiş kağıt cihazlar için 3 x 1 dakika süreyle tampon çözeltileri bağlanması (w / v) PBS,% 1 ihtiva eden tekabül eden 10 ul bağlanmamış EV'lerini durulayın. Aşağıdaki mansap deneyler yapın.

4. Alt Analiz Örneği 1: Tarama Electromicrographs

  1. 10 dakika için 10 ul 0.5 × Karnovsky en fiksatif kullanarak Fonksiyonlu kağıt testi bölgesinde çekilen AGH Fix.
  2. 2 × 5 dakika için yeterli PBS ile örnekleri durulayın.
  3. Kurutmak10 dakika sonra 2 x 10 dakika boyunca% 50 etanol, 2 x 10 dakika boyunca% 70 etanol, 2 x 10 dakika boyunca% 95 etanol ve 4 x 10 dakika boyunca% 100 etanol daha sonra% 35 etanol ile örnekler.
  4. Kuru Kritik ve kaplamaz paladyum / altın örnekleri sputter ve düşük elektron ivme geriliminde çalışan bir taramalı elektron mikroskobu kullanarak incelemek (~ 5 kV).

5. Aşağı Analiz Örneği 2: Paper-based ELISA

  1. 1 de, anti-CD9 birincil antikor ihtiva eden bir 5 ul çözeltisi ekleyin: 1000 seyreltme, PBS içinde yakalanan EV'lerini ihtiva eden, her bir test bölgesine. 1 dakika bekleyin.
  2. PBS 30 saniye boyunca 100 rpm'de çalkalandı ml 30 ile örnekleri durulayın.
  3. 5 ul çözüm içeren yaban turpu peroksidaz (HRP) 1 ikincil antikor -bağlanmış ekle: PBS 1.000 seyreltme ve 1 dakika bekleyin.
  4. PBS 30 saniye boyunca 100 rpm'de çalkalandı ml 30 ile örnekleri durulayın.
  5. Hidrojen peroksit An 1 hacim oranı: 1 ihtiva eden bir 5 ul kolorimetrik alt-tabakanın eklemed 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) ve bir masaüstü tarayıcı kullanarak tarayın.

6. Alt Analiz Örneği 3: RNA İzolasyon

  1. Yakalanan AGH parçalamak için bağlayıcı tampon / polivinilpirrolidon-tabanlı RNA izolasyonu yardımı 35 ul ve lizis 265 ul örnekleri daldırın. Vortex şiddetle.
  2. Lizata izolasyon kiti sağlanan 30 ul Homojenat ekleyin. Vortex şiddetle ve 10 dakika süreyle buz koymak.
  3. Aşağıdaki adımlarda tarif edilen asit, fenol-kloroform ayırıcısı kullanılarak RNA ekstrakte edin.
    1. Şişenin alt tabakasından fenol-kloroform 330 ul alın ve homojenat / lizat ekleyin. Vortex şiddetle.
    2. 5 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin. Temiz bir tüp sulu (üst) faz aktarın ve kaldırıldı hacmi not.
  4. Önceki adımda ve co uzaklaştırıldı, sulu faz 1.25 katı hacim hacim% 100 etanol ile total RNA çökeltilmesi95 ° C'ye kadar ön ısıtmaya tabi elüsyon çözeltisi RNA'yı llect.
  5. Konsantre hale getirin ve bundan başka, imalatçının protokolüne göre bir RNA temizleme kiti kullanılarak RNA'yı saflaştırmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

EVs alt grupları izole kağıt cihazın yeteneği verimli EV yüzey belirteçlerinin onun duyarlı ve özgül tanıma dayanır. yakalama molekülü ile kağıt liflerinin stabil bir modifikasyonunun başka bir yerde tarif edildiği gibi 28-30 avidin-biyotin kimyası kullanılarak elde edilir. fiziksel adsorpsiyon yöntemi kimyasal birleşme etkinliği ve floresans bazlı Bilgilerini kullanılarak değerlendirilir. Kağıt test bölgeleri aşama 1.3'de 20 ug / ml florofor R-fikoeritrin-konjüge biyotin-molekülü (PE-biyotin) ile değiştirildiği yakalama molekülü dışında protokolün adım 1) kullanılarak hazırlanır. Kağıt test bölgeleri, daha sonra, bağlanmamış PE-biyotin molekülleri uzaklaştırmak için PBS ile çalkalanır. Bunun aksine, PBS,% 1 ihtiva eden 10 | il 20 | ig / ml PE-biyotin (ağırlık / hacim) BSA ve% 0.09 (ağ / hac) sodyum azid ile doğrudan PBS, ardından 3 x 10 dakika için kağıt test bölgesinde damlatılır PE-biotin boya moleküllerinin fiziksorpsiyonla yürütülmesi için durulayın. Kimyasalmodifiye kağıt cihazları ("kağıt + çapraz bağlayıcı + boya") işlenmemiş kağıt cihazlarla birlikte ("kağıt"), PE-biyotin molekülleri ("kağıt + çapraz bağlayıcı") ve physisorbed kağıt cihazların uygulama olmadan aynı protokol ile modifiye kağıt cihazları PE-biyotin molekülleri ("physisorbed-boya") 540-560 nm uyarma ayarlanmış bir görüntü kayıt sistemi kullanılarak taranır, 575 nm-uzun pas emisyon ve veri 16 bit dosyaları şeklinde kaydedilir ve analiz edilir ImageJ yazılımı kullanılmıştır. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, fiziksel olarak kaplanmış kağıdı test bölgelerine göre, kimyasal konjügasyon yöntemi ile hazırlanan test bölgelerinin florasan yoğunluğu (p-değeri <0.0005, n = 5, Student t-testi), esas olarak daha yüksektir. Yakalama molekülleri PBS çözeltisi ile değiştirilir zaman birkaç AGH kağıt cihazı üzerinde tutulan Şekil 2B, C, örneklendiği gibi EV'lerin yakalanması da özgüdür.

AGH si heterojenzes, özel içeriği ve biogenesis yolları. Bunları bağlamak için, iki farklı EV yakalama molekülü, bir anti-CD63 antikorları ve anneksin V ile kaplanmış kağıt cihazlar hazırlanmıştır. CD63 tetraspanin ailesinin bir üyesi (CD9, CD63, CD81 ve CD82 molekülleri dahil olmak üzere), EV zar 31 ile zenginleştirilir ve Annexin V fosfatidilserin (PS), 32,33 için güçlü bir çekime sahiptir. Bu AGH hangi süreç normal hücre fosfolipid asimetri EV zarının dış broşürün üzerinde PS artan maruz yol kaybolur, erken apoptoz sırasında ya da stres koşulları altında kurucu serbest olduğu bulunmuştur. SEM görüntüleri analiz .The iki-kuyruklu Student t-testi, istatistiksel p değeri belirlemek için kullanılır CD63 + EVS ve PS + EVs boyutu dağılımları, ortalama 80 çap ve sırasıyla 43 nm ile farklı olduğu (Şekil 3) göstermektedir (p-değeri <0.0001). Şaşırtıcı, CD63 + AGH yuvarlak görünür ve biyolojik hangi ortalama + AGH PS daha büyükönemi aydınlatılamamıştır gerekmektedir.

Kağıt cihazda yakalanan AGH RNA elde edilebilir. Bir Bioanalyzer ile analiz CD63 + ve PS + EV'lerin (Şekil 4A) ekstrakte edilen toplam RNA için benzer bir genel profiller gösterdi. Sırasıyla iki kez serum örneğinin birim hacmi başına 39 kat daha fazla RNA daha küçük bir numune hacmi (Tablo 1) de olsa, kağıt cihaz kullanılarak ekstre edildi mikroakışkan ve ultra-santrifuj teknikler kullanılarak ekstre RNA miktarda karşılaştırılmıştır. P-ELISA EV'lerin saptanması için ifa edilebilir. Anti-CD9 birincil antikor HRP-konjüge edilmiş ikincil antikor Şekil 4B (PBS ile seyreltilmiştir), 10 ul PBS,% 50 serum ile tatbik edilen kağıt cihazlar için HRP enzimatik reaksiyon ile üretilen gri değer değişiklikleri gösterir. Bu çalışmada kullanılan veya 100 olan sırasıyla% serumu. gri değeri test serum örneklerinde aralığında doğrusal artar.

örneğin, ultra santrifüjleme, kullanılacak ise birlikte bir araya getirilmiştir. SEM görüntüleri görülebilir, anti-CD63 antikorları ile kaplı kağıt cihazları ile izole hasta aköz hümör örneklerinden AGH Şekil 5'de gösterdi.

Şekil 1,
Şekil 1. izolasyonu ve hücre dışı veziküllerin karakterizasyonu amaçlı kağıt bazlı deneylerin imalat ve işlem, (A). Filtre kağıdı istenen şekle kesilir ve lamine edilir. (B), kağıdın yüzey oksijen plazma kısa bir tedavi ile değiştirilmiş ve 3-merkaptopropil-trimetoksi silan, N <ile reaksiyona sokulur/ Em> -γ-maleimidobutiriloksi süksinimid ester ve NeutrAvidin, bu sırayla. Biyotinlenmiş yakalama molekülü, örneğin, antikorlar, daha sonra biyotin ve NeutrAvidin molekül arasında güçlü bir afinite ile hareketsiz hale getirilebilir. (C) Biosamples fonksiyonlandırılmış kağıt cihaz üzerine pipet olabilir. Hücre dışı veziküller izole edilebilir. (D) gibi SEM, transcriptome ve ELISA (gösterilen) gibi Mansap tahliller, yapılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Hücre dışı veziküller (AGH) iyi özgüllük ve duyarlılık ile fonksiyonlandırılmış kağıt cihazlarda yakalanabilir. (A) floresan etiketli biyotin molekülleri yüksek kağıda hareketsiz olanKimyasal çekimi sürecine fiziksel adsorpsiyon aksine ("kağıt + çapraz bağlayıcı + boya") ("physisorbed-boya") üzerinden cihaz. İşlenmemiş kağıt ("kağıt") ve konjugasyon molekülleri ("kağıt + çapraz bağlayıcı") floresan yoğunluğu az katkıda bulunur. Yakalama molekülü PBS BSA (w / v)% 1 ihtiva ile ikame edildiğinde (B) bir kaç EV'lerini gösteren temsili bir SEM görüntüsü spesifik olmayan kağıt cihazında yakalanır. (C) Birçok AGH, anti-CD63 antikorları ile kaplı kağıt cihazlarda korunur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3-merkaptopropil
Ekstrasellüler veziküllerin Şekil 3. alt grupları (AGH) farklı boyut dağılımları olabilir. (A)ve (B) yapıları sırasıyla, anti-CD63 antikorları ve Annexin V moleküller ile kaplanmış kağıt cihazları üzerinde ele EV'lerin temsili SEM görüntüleri bulunmaktadır. (C) CD63 + AGH Bu çalışmada kullanılan deneysel koşullar altında PS + AGH daha büyük görünür (p-değeri <0.0001, n, 124 ve 203, Student t-testi =). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Alt transcriptome ve ELISA deneyleri (A). Miyle ekstre floresan etiketli toplam RNA dağılımları yakalanan (nt) nükleotid (x-ekseni) yoğunluklarında (isteğe bağlı birimlerle ifade y-ekseni) ve boyutunu gösteren Bioanalyzer Eldeki Anti-CD63 ile ilgili antikor veya anneksin filtre kağıtları V-kaplı. 25 ° göç tepe nt temsil Bir iç standart. (B) 10 ul PBS örnekleri, (PBS ile seyreltilmiştir),% 50 serum ve% 100, serum numuneleri ile tatbik edilen kağıt cihazları için P-ELISA tahlilinde yabanturpu peroksidaz enzimatik reaksiyonu (HRP) tarafından üretilen Gri değeri değişir. tıklayın Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Şekil 5,
Sulu mizah örnekleri Şekil 5. Ekstrasellüler veziküller (AGH) örnek havuzu olmadan fonksiyonlandırılmış filtre kağıdı üzerinde yakalanabilir. Sulu mizah örneklerinde SEM izole CD63 görüntüleri + AGH hastalardan (A) yaşa bağlı makula dejenerasyonu, (B), diyabetik maküla ile ödem, sırasıyla (C) polipoidal koroid vaskülopatisi.yük / 52.722 / 52722fig5highres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

izolasyon yöntemi yakalama molekülü Serum Vol. (Ul) ekstre ortalama RNA (ng) Ortalama çıkarılan RNA / serum
(Pg / ml)
Ortalama RNA / serum oranı ref
mikroakışkan cihaz anti-insan CD63 400 4.14 10.4 20 20
Kağıt cihazı anti-insan CD63 72 1.49 ± 0.08 20.7 39 22
Kağıt cihazı anneksin V 72 0.99 ± 0.26 13.8 26 22
Ultrasantrifügasyon - 2,000 1.06 ± 0.64 0.53 1
serum - 72 1.23 ± 0.58 17 32 22

Sağlıklı gönüllülerden alınan serum örneklerinden ekstre Tablo 1. Toplam RNA'nın Bioanalyzer (tüm durumlar için, n = 4) ile analiz edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

dışı keseciklerin alt başarılı izolasyonu için en kritik adımlar şunlardır: kağıt 1) iyi bir seçim; Kağıt liflerinin yüzeyi üzerinde yakalama moleküllerinin 2) sabit ve yüksek kapsamı; 3) Numunelerin doğru kullanımı; ve 4), genel laboratuar hijyen uygulaması.

Gözenekli malzemeler, çok ucuz ve ekipman içermeyen deneylerde kullanılmıştır. Bu ayarlanabilir bir gözenek boyutu, çok yönlü özelliğe, düşük maliyet ve yüksek yüzey-hacim oranı, sıvıların pasif fitillenmesini izin olabilir. Biz esas olarak uygun gözenek boyutu ve düşük protein adsorpsiyonu için kromatografi selüloz kağıt notu 1 seçti. Başka bir yaygın olarak kullanılan gözenekli malzemeler, nitroselüloz ile karşılaştırıldığında, selüloz kağıt daha düşük spesifik olmayan protein adsorpsiyonu 34 yer alır. Biz de bu çalışmada AGH küçük nonspesifik yakalama bulmak. Buna ek olarak, partikül tutma seviyesi, 11 um, özel çekim sağlayan, EV'lerin 35 boyutundan daha büyük olduğuAGH fiziksel yakalama için kontrast. Burada biz, daha büyük AGH incelenmesi gereken zaman modifiye edilebilir aşaması, bir 0.8 mikron filtre içinden serum örnekleri geçirilmesiyle daha küçük boyutta EV'lerin odaklanmaktadır.

Kimyasal yüzey modifikasyonu EV izolasyon verimliliğini artırmak için bir araç olarak yüzeyde yakalama moleküllerinin istikrarlı ve yüksek kapsama ulaşmak için bir anahtar olabilir. Selüloz yüzey modifikasyonları 36,37 gözden geçirilmiştir. Orada yüksek hidroksil (-OH) sayısı grupları selüloz yüzeyinde bulunur ve oksijen plazma veya diğer yoğunlaşma işlemi ile aktive edildikten sonra kararlı kimyasal Si-OC bağı verecek şekilde silan ile reaksiyona girebilir. Bu çalışmada kullanılan silan (3-merkaptopropil) trimetoksisilan (MeO) 3 Si (CH2) 3 -SH olduğu. tiyol (-SH) grubuna kısa alan kol (0.73 mil) ve primer aminler ile çiftler bir çapraz bağlama grubu oluşturmak üzere, GMBS ile reaksiyona girebilir. Amin gruplarıyla yakalama molekülü konjuge edilebilirDoğrudan GMBS için. Bu çalışmada, ancak, bunun yerine NeutrAvidin biyotin-etiketli çeşitli yakalama molekülü olarak konjuge edifmesi için genel bir şema temin etmek üzere birleştirilir. Ancak, EV alt tipi-spesifik belirteçler üzerinde fikir birliği henüz 17 ulaşılacak gelmiştir. NeutrAvidin örneğin EV'lerin yüzeyine biyotine çok güçlü bir afinite ve bir yakın nötr izoelektrik noktaya (pH 6.3) negatif yüklü nesnelerle spesifik olmayan etkileşimleri minimize sahiptir. Bunun aksine, 10.5 bir izoelektrik noktasına sahip bir avidin nötr pH'de pozitif yük taşır. Anti-CD63 antikorunun daha yüksek bir konsantrasyonu, esas olarak uygulanan küçük bir hacme ve kağıt aygıtın büyük yüzey-hacim oranı, Chen et al. 20 daha kullanılmaktadır. Ancak bu miktar, ve kağıt liflerinin üzerine adsorbe protein bileşimleri, özelliği değil, örnek bağımlı olabilmektedir. Protein analiz sonuçlarını yorumlarken Bu nedenle, dikkat edilmelidir.

Toplanan biological örnekler hafifçe ele ve artifactually artan EV düzeylerini önlemek için hızla işlenmelidir. Bu, -80 ° C'de saklama öncesi, eğer varsa, hücreleri ve trombositler kaldırmak için tavsiye edilir. EV araştırma numune işleme güncel standardizasyon bu yorumu 17 bulunabilir.

Uygun laboratuvar hijyen uygulaması istihdam edilmelidir. Her zaman toz parçacıkları ve ribonükleazlara giriş aza indirmek için sık sık eldiven ve değişim eldiven giyin. AGH ultrasantrifüj yöntemi (yayınlanmamış) kullanılarak konsantre elde edilene kıyasla hücre kültürü koşullara göre EV'lerin RNA izolasyonu kağıt cihazları kullanarak fazla 70 kat daha fazla konsantrasyonlarda elde edilebilir.

Burada tarif edilen protokol EV'lerin farklı alt gruplara yalıtmak için yakalama molekülü ile kimyasal olarak modifiye edilmiş selüloz kağıt aygıtları kullanır. Numune hacmi sınırlı olduğunda yöntem olup, basit, verimli ve özellikle değerlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Acknowledgments

Bu çalışma Tayvan Ulusal Bilim Konseyi grants- MGK 99-2320-B-007-005-my2 (CC) ve MGK 101-2628-E-007-011-My3 (CMC), ve Gaziler Genel kısmen desteklenmiştir Hastaneler ve Tayvan Ortak Araştırma Programı Üniversite Sistemi (CC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chromatography Paper GE Healthcare Life Sciences 3001-861 Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane Sigma Aldrich 175617 This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
Ethanol Fisher Scientific BP2818 Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA) BioShop Canada Inc. ALB001 Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) Pierce Biotechnology 22309 GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
Avidin Pierce Biotechnology 31000 NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 Ancell 215-030 clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin V BD Biosciences 556418 Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibody System Biosciences EXOAB-CD9A-1 The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubes BD Biosciences 367991 Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding buffer BD Biosciences 556454 10x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent set BD Biosciences 555214 The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
Name Company Catalog Number Comments
RNA isolation kit Life Technologies AM1560 MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid Life Technologies AM9690 Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kit Qiagen Inc. 74004 MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamber March Instruments PX-250
Scanning electron microscope Hitachi Ltd. S-4300
Desktop scanner Hewlett-Packard Company Photosmart B110 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record system J&H Technology Co GeneSys G:BOX Chemi-XX8 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9 (2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86 (2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).
Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).More

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter