Summary
Microglia-activatie en microgliose zijn de belangrijkste reacties op chronische neurodegeneratie. Hier presenteren we werkwijzen voor in vivo visualisatietechnieken retinale CX3CR1-GFP + cellen door microgliale confocale Ophthalmoscopie, en drempel en morfometrische analyses worden geïdentificeerd en gekwantificeerd hun activering. We monitoren microglia veranderingen tijdens de vroege stadia van leeftijdsgebonden glaucoom.
Abstract
Microglia, die CNS-resident neuro-cellen zijn, te transformeren van hun morfologie en grootte in reactie op de CNS-letsel, schakelen naar een geactiveerde staat met verschillende functies en genexpressie profielen. De rollen van microgliale activering in gezondheid, verwondingen en ziekten blijven onvolledig begrepen vanwege hun dynamische en complexe regulering in reactie op veranderingen in hun micromilieu. Het is dus essentieel om niet-invasief bewaken en veranderingen in microgliale activering tijd in het intacte organisme te analyseren. In vivo studies van microglia activering zijn vertraagd door technische beperkingen aan het volgen van microglia gedrag zonder dat de CNS milieu. Dit is bijzonder moeilijk geweest tijdens chronische neurodegeneratie, waar de veranderingen op lange termijn moet worden gevolgd. Het netvlies is een CNS orgaan vatbaar is voor non-invasieve beeldvorming levende, een krachtig systeem te visualiseren en de dynamiek van microglia activatie karakteriseren tijdens chronische aandoeningen.
in vivo beeldvorming van retinale microglia, via confocale oftalmoscopie (cSLO) en CX3CR1 GFP / + reporter muizen te microglia met cellulaire resolutie te visualiseren. Ook beschrijven we methoden om de maandelijkse veranderingen in cel activatie en dichtheid in grote cel subsets (200-300 cellen per netvlies) te kwantificeren. Wij bevestigen het gebruik van Somal gebied als een nuttige metrische live volgen van microgliale activering in het netvlies door het toepassen van geautomatiseerde-drempel op basis van morfometrische analyse van in vivo afbeeldingen. Wij gebruiken deze live image registratie en verwerking strategieën om de dynamische veranderingen in microgliale activering en microgliose volgen tijdens de vroege stadia van retinale neurodegeneratie in een muizenmodel van chronische glaucoom. Deze benadering is handig voor de bijdragen van microglia neuronale en axonale afname van chronische CNS aandoeningen die de retina en optische zenuw invloed te onderzoeken.
Introduction
Microglia vormen neuroimmune cellen die uitsluitend bevinden in het centrale zenuwstelsel (CNS) sinds de vroege embryonale ontwikkeling en de volwassen leeftijd. Voorzien van een complex repertoire receptoren, microgliale activiteit en regionale heterogeniteit worden geregeld door de bidirectionele interactie met aangrenzende neuronen, glia, bloed-hersenbarrière en infiltrerende cellen neuroinflammatory 1,2. Basale microglia functies bijdragen aan fysiologische onderhoud en reparatie, omdat ze proeven op hun grondgebied voor verstoringen in de homeostase 3,4. Tijdens CNS verwonding of ziekte, microglia zijn de first responders om neuronale signalen die vervolgens leiden tot de overgang naar een reactieve fenotype, aangeduid als "geactiveerde microglia 2,5-7. Microglia-activatie gaat om een ingewikkelde cyclus van gen en eiwit expressie, die gekoppeld zijn aan de cel soma en proces resizen en remodeling 6-9. Microglia activatie, alsook cellen Redistributieclustering kan vergezeld de plaatselijke totale stijging van het aantal cellen (genoemd microgliosis). Dit kan het gevolg zijn van celproliferatie en zelfvernieuwing, al dan niet rekrutering van bloed monocyten 3,4,7,10-14. In een breed scala van leeftijdsafhankelijke, chronische CNS ziekten, aanhoudende microgliose en microglia-activatie parallel progressie van de ziekte 15-19. Hoe microglia invloed neurodegeneratie blijft onduidelijk, vooral omdat ze allebei neurobeschermend en schadelijke rollen die diverse bijdragen aan de ziekte ontstaan en de progressie kan hebben afgespeeld. Live-imaging studies gericht op het begrijpen chronische ziekte CNS hebben microglia gedrag in de beschadigde CNS diermodellen en mensen gecontroleerd en aangetoond dat microglia wijzigingen zijn detecteerbaar begin in de vroege stadia van de ziekte 15-17,19,20. Het is dus essentieel om benaderingen te sporen en te controleren microgliale activering in vivo ontwikkelen.
Niet-invasieve detectie van de regionale veranderingen in de hersenen microglia activering werd opgericht als een belangrijke in vivo indicator van neurodegeneratieve progressie van de ziekte, met behulp van moleculaire beeldvorming of bioluminescentie en positron emissie tomografie of magnetische resonantie beeldvorming 18,21,22. Deze zeer kwantitatieve en non-invasieve moleculaire en nucleaire beeldvorming opsporen gliosis regionale oplossing. Als alternatief, twee-foton confocale beeldvorming in CX3CR1 GFP / + muizen kon de observatie van de hersenen microglia met cellulaire resolutie 3,4,9,20,23-28. Deze benadering beperkt langdurige en herhaalde observatie van chronische microgliale veranderingen, daar het gevaar bestaat van hun gedrag verstoren door ten minste minimaal invasieve brain imaging procedures 29. Als alternatief, het netvlies biedt optimale omstandigheden voor directe, in vivo visualisatie en herhaalde controle van microglia in hun intact CNS niche gedurende veroudering, na acuut letsel, eneventueel tijdens chronische neurodegeneratieve aandoeningen. Zo hebben recente onderzoeken de haalbaarheid van een hoge-resolutie beeldvorming van het netvlies microglia die GFP bewezen door het aanpassen van de confocale laser scanning oftalmoscopie (cSLO) naar het live-CX3CR1 GFP / + muizen. Deze is gebruikt om wekelijks veranderingen in GFP + celaantallen in individuele muizen gedurende maximaal 10 weken volgen na acuut geïnduceerd letsel of oculaire hypertensie 30-36.
We hebben deze benadering uitgebreid tot langdurige imaging voeren gedurende enkele maanden, en kwantitatief veranderingen in microglia activatie basis van soma size middels morfometrische analyse volgen. Somal grootte werd gedefinieerd als nuttige metriek van microglia activatie in levende imaging studies met behulp van twee-foton confocale microscopie in corticale schijfjes te functioneren in vivo beeldvorming van CX3CR1-GFP + microglia 9. Deze en andere studies toonden ook het verband tussen Somal shape and Iba1 niveaus van eiwitexpressie, which verhoogt ook activatie 9,37. Aldus kan geactiveerde microglia worden geïdentificeerd levende muizen, en hun aantal en verdeling in de tijd gevolgd bij CNS gezondheid en ziekte.
Dit protocol beschrijft werkwijzen voor cSLO levende beeldacquisitie en analyse microgliale cel aantallen, distributie en morfologische activatie tijdens retinale ganglioncellen (RGC) degeneratie (figuur 1) bewaken. Aldus is deze studie gebruikt: 1) een muismodel van erfelijke glaucoom (DBA / 2J) die leeftijdsafhankelijke oogzenuw en netvlies neurodegeneratie en ondergaat toont opmerkelijke variatie in ziekteprogressie tussen 5 en 10 maanden 38,39, 2) maandelijkse cSLO in vivo imaging voor langdurige visualisatie van GFP + cellen in de retina en optische zenuw ongemyelineerde heterozygote CX3CR1 GFP / + DBA / 2J muizen 3-5 maanden, 3) levende beeldanalyse door het segmenteren en drempelwaarden naar cel somata en meten isoleren leeftijd deir gebied. Deze strategieën zijn toegepast om de kinetiek van retinale microgliale activatie toestanden beoordelen tijdens de vroege stadia van chronisch glaucoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In vivo beeldvorming wordt uitgevoerd in pathogeenvrije faciliteiten met protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Utah goedgekeurd.
Opmerking: Deze imaging protocol wordt gebruikt voor reporter muizen die retinale microglia en infiltrerende monocyten / macrofagen tot expressie groen-fluorescerend eiwit (GFP) onder de controle van de fractalkine receptor locus (CX3CR1).
1. In vivo beeldvorming van het netvlies GFP + Microglia door Confocale Laser Scanning Ophthalmoscopie (cSLO)
- Zet het water gecontroleerd verwarmingssysteem, ingesteld om de muis temperatuur tussen 35-37 ºC te stabiliseren tijdens de procedure, en sluit twee verwarming pads.
- Start de confocale laser scanning oftalmoscoop (cSLO) systeem (Figuur 2A). Open het cSLO programma, voer de informatie die de individuele muis zal identificeren en stel een hoornvlies kromming van 2 mm (Patiëntgegevens menu).
- Bereid je voor op imaGing. Veilig te passen een schone 55º wide-field objectief op zijn socket. Bereid de oftalmoscoop imaging platform door het veiligstellen van een verwarmingselement bedekt met schoon papier. Gebruik clips om de pad en papier plat en houd ze uit het blokkeren van de beweging van het objectief.
- Verdoven de muis door intraperitoneale injectie van 1,3% 2,2,2-tribroomethanol en 0,8% tert-amyl alcohol (250 mg / kg lichaamsgewicht; 0,5 ml / 25 g lichaamsgewicht) met een 30½ G naald bevestigd aan een 1 ml wegwerpbare syringe. Keer terug muis aan zijn kooi, hield meer dan een verwarmingselement.
LET OP: De levering van de narcose door injectie versus inademing maakt gemakkelijker positionering van de muis voor de beeldvorming en onbelemmerde toegang tot de ogen, vrij van de neus kegels en slangen. - Zodra het dier stopt met bewegen en niet reageert op de staart knijpen, opwekken pupilverwijding met Tropicamide en fenylefrine (0,5% elk), door het plaatsen van het dier vatbaar en die beide ogen met de druppels van 7 min.
- Na 5 min, pkant de muis gevoelig in het midden van de oftalmoscoop platform en fit contactlenzen boven de ogen, aanbrengen minimale druk.
OPMERKING: Contactlenzen zijn klein en fragiel, maar kan voorzichtig met de vingers worden behandeld, hoewel tang plaats 40 kan worden gebruikt. Het gebruik van contactlenzen is optioneel, maar aanbevolen als het minimaliseert droge ogen en blijft transparantie van het hoornvlies tijdens de beeldvorming. - Na 7 min, oriënteren de muis met het rechteroog tegenover de objectieflens en de baan evenwijdig aan de objectieflens, waardoor het dier ongebreidelde nabij de rand van het platform (Figuur 2B). Om afbeeldingen van vergelijkbare verzadiging en oriëntatie verzamelen steeds bezorgd om de afstand tussen oog objectieflens, en de uitlijning van het oog om het lichtpad gedurende beeldvorming sessies. Clip lange snorharen interfereren met observatie van het oog.
OPMERKING: Voor de volgende 8-10 min, zal de muis niet bewegen of knipperen, en zal de adem met zachte bewegingmenten, die worden gevolgd door de cSLO Eye Tracking ART (automatische real time) modus, die de scankop positie gebaseerd op fundus monumenten met een hoog contrast aanpast. Voorbij die tijd, beginnen muizen hijgen en te knipperen, waardoor beeldvorming onpraktisch. - Wanneer beeldvorming wordt uitgevoerd zonder contactlenzen toepassing PBS daalt tot beide ogen elke 2-3 min om uitdroging te voorkomen.
- Verzamel een fundus beeld van het retinale vaatstelsel en de optische schijf, gericht op de binnenste retina.
- Selecteer de infrarood-mode (IR) en de instellingen aan te passen aan 820 nm excitatie, 100% laservermogen, 40-60% gevoeligheid (Figuur 2C).
- Werken in high-speed modus (12,6 frame / sec), zoek het oog met behulp van de joystick naar de oftalmoscoop rijden. Bij lage vergroting, inspecteren het hoornvlies en lens voor letsel of ondoorzichtigheid, en sluiten van de studie ogen met gebreken of letsel dat zal invloed hebben op de beeldvorming van de retina (figuur 3A).
- Zoek de optische schijf gebied (het oppervlak vande oogzenuw hoofd, ONH) door dichter bij het oog brengen van de doelstelling, dan centreren het beeld op en vergrendel deze positie door schroeven van de joystick. Deze afstemming van het oog om de oftalmoscoop is de sleutel tot het verkrijgen zelfs concentreren en emissie over het beeld.
- Visualiseren inwendige vlakken van de retina, en het ONH, met de grote bloedvaten op het glasachtige oppervlak van het netvlies als referentie brandpuntsvlak (59 en 60 D), of dieper (55 D) in ogen tonen uitgegraven optic discs. De optimale nadruk moet oplossen circulerende bloedcellen binnen grote bloedvaten, met hun lumen en muren duidelijk onderscheiden.
- Optimaliseer image verzadiging door het aanpassen van de knop op het touch screen bedieningspaneel, totdat een witte halo van uniforme verlichting overspant in het grootste deel van het gebied 55º fundus rond de optische schijf (met behulp van een lichte overbelichting). Vervolgens laat de verzadiging contrast optimaliseren totdat bloedcellen bewegen langs de grote bloedvaten duidelijk worden opgelost. Als brandpunt donkergebieden blijven bestaan, niet te wijten aan het netvlies schade, opnieuw uitlijnen het oog van de camera tot een uniform helder beeld wordt verkregen. Deze aanpassing is fundamenteel voor reproduceerbare sets van de beelden vast te leggen in de positie en de kwaliteit.
- Verzamel een hoge-resolutie infraroodbeeld van de centrale retina (1,4-1,7 mm in diameter, afhankelijk van leeftijd), gemiddeld 30 frames direct (4,7 frames / sec, genormaliseerd), om signaal-ruisverhouding te verbeteren (figuur 2D ).
- Onmiddellijk een fluorescentiebeeld van GFP + microglia en / of infiltrerende monocyten gelokaliseerd in het binnenste vlakken van de retina en ONH verkrijgen.
OPMERKING: Optimalisatie van de IR fundus beeld van de retina bepaalt de resolutie van het fluorescentiebeeld van GFP + cellen alsmede de omvang van binnenste retina overspannen. Als de inwendige vlakken van de retina, die kan worden gedetecteerd door slechte resolutie van het vaatstelsel gericht, resulteert in gedimd GFP + cellen views (figuur 3B). Het niet IR satu passenrantsoen correct en uniform beïnvloedt de fluorescentie afbeelding (FA), de invoering van artefactuele variaties in GFP + cellen intensiteit en omvang (figuur 3C).- Swich naar imaging-modus (FA) fluorescentie in het touch screen panel, met blauw, 488 nm laser excitatie (460-490 nm barrière filter set), en overname-instellingen (100% laservermogen en 100-125% gevoeligheid), die worden gehandhaafd constante voor alle muizen (Figuur 2E).
- Verzamel een enkele tweedimensionale fluorescentie beeld van het netvlies xy-punt, en het beeld van een fundus onmiddellijk vast te leggen op dezelfde positie (100x scan gemiddelde; 55º scan hoek voor beide beelden; figuur 2F).
- Afbeelding van een multipoint vastleggen door het selecteren van "composiet" in het configuratiescherm (figuur 2G) en de oftalmoscoop rechts te verplaatsen en links, panning het netvlies over de neus-temporele as (figuur 2H).
NB: Na het één xy-point scannen (100x skan gemiddeld), de software automatisch gemiddelden nieuwe scans van hetzelfde en nieuwe gebieden (omcirkeld met een groene cirkel tijdens optimale scan, of rood als de scan is onhaalbaar), en steken alle xy-posities in real time. De resulterende samengestelde beeld omvat 1,5-1,7 mm op de horizontale as x 3-4 mm in de verticale as (55 ° x 120-124º scanhoek).
- Compleet beeldvorming van elke muis binnen 15 minuten na het induceren van anesthesie, voordat knipperen en beweging opnieuw gestart.
- Contactlenzen verwijderen, hydrateren ogen met PBS en de terugkeer van het dier aan zijn opgewarmd kooi, het controleren van het gedrag tot volledig herstel van de beweeglijkheid.
- Longitudinale studies met intermitterende cSLO-beeldvorming sessies hetzelfde individu muis, herhaal beeldvorming niet minder dan 3 dagen na elkaar op de cumulatieve toxiciteit van anesthesie, alsmede hoornvliesirritatie voorkomen.
2. Levende Image Processing and Analysis
- Sequential beelduitlijning:
- Richtende fundus beelden voor een tijdreeks van hetzelfde oog met behulp van het vaatstelsel en de optische schijf als oriëntatiepunten. Open alle afbeeldingen in een commerciële dia-show-programma, door het slepen van elk beeld over de voorgaande totdat hun optische schijven af te stemmen op het XY vlak (de bovenste afbeelding verschijnt semi-transparant terwijl wordt gesleept) en draai de bovenste afbeelding tot zijn grote bloedvaten overlappen met het vaatstelsel op de afbeelding hieronder (focus op schepen verst van de optische disc). Noteer de draaihoek voor elk beeld en bewaar deze tijdreeksen voor toekomstig gebruik, het bijhouden van de muis en oog identiteit.
- Lijn de corresponderende reeksen van één xy-point fluorescentiebeelden door toepassing van de geregistreerde hoek met de xy rotatie op elk tijdstip te corrigeren met een rasterafbeelding bewerkingsprogramma. Daarnaast passen resolutie tot 300 dpi (zonder herschalen) en achtergrond (in de RGB-modus, selecteer Levels en proeven van het lumen van een bloedvat zo zwart). Sla deze beeldenals TIF-bestanden, het toevoegen van "afgestemd" om hun namen.
- Microgliale cel segmentatie:
- Om GFP + cellen van het "in lijn" TIF-bestand die overeenkomt met het vroegste tijdstip / leeftijd te identificeren in de centrale retina, open in FluoRender. Zoomen op de afbeelding om het scherm te passen, hier de Render uitzicht (composiet, orthogonale, geïnterpoleerd) en de eigenschappen (0,58 gamma, 255 verzadigingspunt, 255 luminantie, 195 alpha en 1,00 arcering), het selecteren van zowel de RG kanalen als zichtbare (verberg B-kanaal door erop te dubbelklikken in de werkruimte beeld; Figuur 4A).
- Om individuele cellen, drempel het rode kanaal (moet worden gemarkeerd op de Workspace kader), door het verhogen van de lage drempel tot de meerderheid van de cellen worden gemaskeerd (wit) met minimale overlap en celprocessen (cyaan), terwijl de hoge drempel constante (255). De lage drempelwaarde varieert tussen 100 en 170, afhankelijk van de fluorescentie-intensiteit (Figuur 4B </ Strong>).
- Sla deze visie met de rode kanaal alleen zichtbaar (Capture commando) als nieuwe TIF-bestand, het toevoegen van "cellsegm" naar de oorspronkelijke naam (Figuur 4C). Met behulp van een generisch raster grafische editor software, omkeren zijn grijstinten en passen resolutie tot 300 dpi, zoals hierboven, en opnieuw opslaan als RGB (figuur 4D).
OPMERKING: Verwijder de mappen (projecten) automatisch door FluoRender, en sla de toegepaste drempel voor toekomstig gebruik.
- Microgliale soma segmentatie en morfometrie:
- Om GFP + cellen somata identificeren stippellijn kwantificering gebruik beeldanalyse software geautomatiseerde intensiteitmetingen en drempelwaarde mogelijkheden en drempelwaarde gebaseerde object tellen en meten. Open het "cellsegm" TIF-bestand en selecteer de herschalen methode (spline) en het rode kanaal (klik rode tab in RGB). Verbeter de visualisatie door de selectie "view channel in kleur" (klik met de rechtermuisknop op de rode RGTab B), en "vullen kleuren" te selecteren (Image / Beeld Aanpassen) aan de grijstinten te keren en bekijk de cellen in grijs / zwart op een witte achtergrond (figuur 4E).
- IJk het beeld om 1,4-1,7 mm, afhankelijk van de leeftijd, door het tekenen van een horizontale lijn over het hele beeld (Calibration, Quick Calibration).
- Segment individuele cel somata door toepassing intensiteit drempelwaarde (figuur 4B). Voor deze, het werk op de rode RGB-kanaal en open het Threshold Intensity functie (Object Graaf; selecteren "count-update" commando) om tweedimensionale parameters voor elk thresholded regio van belang (ROI) bijhouden vertegenwoordigen individuele somata.
- Definieer de intensiteitsdrempel in het histogram, door het selecteren van de laagste 50-60% van de 255 niveaus en verfijnen van de uiteindelijke drempelwaarde door visuele evaluatie van de overlap tussen de drempel kleurenmasker (blauw) en de cel soma perimeter (grijs) in individuele cellen (FIGUUR 4E).
- Schat de juistheid van de cel soma maskers om de Somal dimensies vertegenwoordigen door het meten van het gebied voor en na de segmentatie in 10 cellen en accepteer de geselecteerde drempel bereik als de metingen verschillen minder dan 10% (gebruik de Binary Toolbar en Geannoteerde Metingen).
- Handmatig identificeren Somal ROI die meerdere cellen omvatten en scheiden deze elementen (elimineren of afzonderlijke ROI met behulp van de Binary Toolbar controls, of Object Catalog), terwijl het schakelen aan / uit de binaire direct visualiseren de cellen (Figuur 4F).
- Classificeren microgliacellen als ROI met Somal gebieden groter en kleiner dan 50-60 micrometer 2 naar cel somata discrimineren overeenkomt met geactiveerde microglia en gedeactiveerd microglia respectievelijk door het gebruik van Area Beperking.
Opmerking: Elke cel Somal subset geïdentificeerd met een ander pseudocolored binaire laag, en kan verder worden gekarakteriseerd voor andere morfologische parameters (perimeter, circulariteit, etc.), en gekwantificeerd bij discrete retina sectoren (Figuur 4G). Sla de geanalyseerde afbeelding als een ND2 bestand. - Controleer het proces en de vertakking complexiteit in individuele geactiveerde microglia cellen, door overlappen de Somal masker en de single xy afbeelding -punt (contrast steeg 50%; figuur 4H). Handmatig tellen van de processen die direct uitstrekt vanaf de cel soma of de diameter van de veelhoek omvat het gereedschap (gebruik Binary werkbalk en geannoteerde metingen).
OPMERKING: Geactiveerde cellen missen processen of dragen weinig (<4) en korte (<2x Somal diameter) die, in tegenstelling tot niet-geactiveerde celprocessen, die een vertakte en uitgebreide arbor omvatten (> 3-10x Somal diameter) rond hun betrekkelijk kleine soma. - Handmatig cellen herkennen somata kleiner dan <20 urn 2 en / of GFP expressie onder de detectielimiet, die derhalve door onopgemerkt intensity drempelen. Gebruik de Taxonomie commando in Annotations handmatig geïdentificeerd elementen tellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze recente in vivo studies gebruikten deze levende beeldacquisitie en analysemethoden te visualiseren en volgen de kinetiek en patronen van ONH en retinale microgliale veranderingen tijdens vroege stadia van chronisch glaucoom en hun relatie tot eind neurodegeneratie 59. Hier tonen we een cSLO beeldacquisitie protocol microgliale cellen te visualiseren over een groot gebied van de centrale retina individuele jonge heterozygote CX3CR1-GFP DBA / 2J retina (Figuur 5). Op basis van de hoge resolutie cel, passen we live image thresholding en morfometrische analyses die de automatische segmentatie van afzonderlijke GFP + cellen en cellichamen (figuur 6) toe.
Om de ontwikkeling van lokale microgliosis en / of microglia activatie op leeftijd voorgaande detecteerbaar neurodegeneratie in dit model van chronische glaucoom controleren, maten we maandelijkse variaties van microglia totale celdichtheid in individuele jonge heterozygote Cx3CR1-GFP DBA / 2J netvlies (n = 10) tussen 3-5 maanden (figuur 7A). In overeenstemming met de variabele progressie van neurodegeneratie in afzonderlijke ogen 41-44, onze analyse blijkt sterk variëren netvlies microglia activatie en microgliose tussen ogen op elke leeftijdsgroep (figuur 7B) en dynamische veranderingen in de dichtheid van totaal en geactiveerde microglia binnen afzonderlijke netvliezen detecteert (Figuur 7C). Merkbaar, aantallen geactiveerde microglia worden losgekoppeld van gelijktijdige veranderingen in totale GFP + celdichtheid. Deze in vivo bevindingen bevestigen eerdere ex vivo analyse van microglia veranderingen in DBA / 2J muizen 45. Aldus cSLO levende detectoren van retinale microgliale activering kunnen dienen als indicatoren voor vroege ziekteprogressie binnen afzonderlijke ogen, en kunnen eventueel worden gekoppeld aan gebeurtenissen initiëren van glaucoom pathogenese.
Figuur 1:. Leef beeldacquisitie, verwerking en analyse workflow cSLO werd gebruikt om de afbeelding honderden GFP + microglia / perifere monocyten cellen gelokaliseerd in de centrale ~ 1,7 mm 2 van de muis innerlijke netvlies. Fluorescentie afbeeldingen (FA) werd maandelijks verworven voor dezelfde muizen, en uitgelijnd met behulp van infrarood (IR) fundus beelden van de retinale vasculatuur en glasachtige oppervlak referentie. Segmentatie van GFP + cellen en cellichamen voortgevloeid uit de toepassing van twee afzonderlijke stappen intensiteitsniveaus-drempelwaardebepaling FA retinabeelden. Morfometrische analyse van de binaire vertegenwoordigen cel somata toegelaten meting van afzonderlijke Somal gebieden. GFP + cellen met Somal bovenaan 50 urn 2 werden als geactiveerd. Dichtheid van de totale en geactiveerde GFP + cellen werd gemeten voor individuele netvlies FA afbeeldingen en onderzoek van prieel verlenging en vertakking complexiteit werd uitgevoerd door directe observatie van FA beelden.
Figuur 2: Leef beeldacquisitie controles in cSLO Spectralis (A) handmatige touch-screen panel display op de initiatie.. (B) cSLO software afbeeldingsvenster, waarin de kop van een levende muis. (C) Instellingen gekozen voor infrarood imaging (verlicht in het blauw). (D) Fundus beeld van het netvlies tijdens real-time acquisitie (linker paneel) en gemiddelde (rechter paneel). Normalisering commando aangegeven met zwarte cirkel. Slagaders en aders uitlopen van het oogzenuwuiteinde zichtbaar (tussen haakjes), evenals de optische axonale bundels (pijlen) tussen de bloedvaten. (E) Instellingen gekozen voor fluorescentie beeldvorming binnen één xy punt. (F) Single-point fluorescentie (FA, 488 nm) beeldvorming tijdens acquisitie (gemiddeld). THij kleinere afbeelding (links) toont een individuele scan, de grotere afbeelding (rechts) toont de voortgang van de intensiteit middeling. (G) instellingen geselecteerd voor de verwerving van het fluorescentie een multipoint (composiet). (H) Multipoint fluorescentiebeeldvorming overname, met de scan aan de gang, waarbij de software identificeert met een groene cirkel (of rood wanneer overname is niet mogelijk). Schaal balken geven ~ 5 mm (B) of 250 micrometer (DH) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. .
Figuur 3: Key oogaandoeningen en imaging fouten die juist cSLO beeldvorming van microglia cellen kan voorkomen (A - C) oogletsels of defecten, evenals beeldacquisitie fout.s kunnen betrouwbare beeldvorming van GFP + cellen gelokaliseerd in het binnenste vlakken van het netvlies voorkomen. (A) Een aantal grove oogafwijkingen gemakkelijk vast in fundus beelden, inclusief corneale of lensopaciteit of letsel en verdieping van het optische schijfoppervlak, die voorkomen duidelijke beeldvorming van GFP + cellen. (B) scherpstellen ofwel boven (de wanden van de vaten worden onderscheiden van de lumen) of onder het binnenoppervlak van het netvlies (de vaten nauwelijks zichtbaar) vermindert de detecteerbaarheid van GFP fluorescentie emissie van cellen die zich in de zenuwvezel en ganglioncel lagen. (C) Saturatieniveaus verkeerd of ongelijk te stellen kan resulteren in een lichte, maar oververzadigd beelden (met cellen zonder resolutie) of beelden met verduisterd gebieden. Schaal balk vertegenwoordigt 250 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Binary-drempelwaarden gebaseerde kwantificering van microglia cellen en Somal (A - D) Stappen van de cel segmentatie in FluoRender (A) Navigatie raam met uitzicht gerenderd een representatief single-point fluorescentie beeld van microglia van binnen de centrale retina.. (bovenste paneel); overeenkomstige renderen eigenschappen (onderste paneel). (B) Dezelfde afbeelding in een cel segmentatie routine, gezien als RGB, met bijbehorende drempel instellingen (onderste panelen). Thresholded cellen worden vertegenwoordigd door witte pixels en overtrok hun processen in cyaan. (C) Afbeelding van de cel maskers verkregen na cel segmentatie. (D) Vorige masker met omgekeerde grijswaarden voor verdere beeldverwerking. (E - H) Stappen van Somal drempeling en kwantificering. (E) Gebruik van de intensiteit drempel segment microglia somata op basis van hun vorige cel segmentatie. Het RGB histogram intensiteit (links) laat drempelwaarden door directe selectie van de onderste 50-60% bereik van intensiteiten (0 tot 127-153). Deze segmentatie ontstaat een kwantificeerbare masker dat individuele microglia somata (blauw) isoleert. Afbeeldingen worden geschaald met behulp van de spline-functie (ovaal rechts). (F) Automatic-drempel op basis van metingen van de individuele ROI / somata (bovenste paneel) en ROI silhouetten (Object Catalog, onderste paneel) gebruikt om overlappende ROI met behulp van Binary Gereedschap (rechter paneel) voor handmatige scheiding of erosie te corrigeren. (G) Classificatie van individuele Somal gebieden door Area Beperking (linker paneel). Gesegmenteerde somata worden geclassificeerd als ROI kleiner en groter dan 50-60 urn 2, en de binaire lagen voor elke klasse van somata toegewezen verschillende kleuren pixels (a greennd magenta, respectievelijk). (H) Overlay van de gesegmenteerde somata (groen) op de oorspronkelijke afbeelding (met verhoogde contrast) gebruikt voor directe observatie van de complexiteit van het proces in individuele geactiveerde cellen (linker paneel). Vergrote weergave van de cel priëlen. Schaal balken geven 250 pm (AH) of 50 micrometer (H, inzet). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De hoge-resolutie visualisatie van CX3CR1- GFP + microglia / monocyten gelokaliseerd in de binnenste muis netvlies live confocale laser scanning imaging (A) beeld Enige XY punt cSLO tonen GFP + cellen in de centrale. retina in 2 maanden oude DBA / 2J muizen (links). Vergrote weergave (rechts) met de ONH gebied (cirkel), bloedvaten (lijnen) bekleed met perivasculaire microglia / macrofagen en parenchymale microglia betegelen de centrale netvlies. Afbeelding (B) Multipoint, onmiddellijk verzameld na de single point om microglia visualiseren over een breder gebied netvlies (⅓ van het netvlies). (C, D) identieke beelden, getoond met omgekeerde grijswaarden optimaal observatie van celmorfologie en complexiteit (minimaal gecorrigeerd voor contrast en resolutie). Somal grootte en vorm kunnen worden opgelost in de meeste cellen (links). Arbor uitbreiding en mobiele vertakking kan worden opgelost in de cellen met grote somata (rechts, en 3 individuele cellen). (E) Infrarood fundus beeld van het vaatstelsel en de optische schijf gebruikt voor xy -vlak uitlijning van opeenvolgende beelden. Schaalbalken vertegenwoordigen 250 um (A, B en E) en 25 urn (C, uiterst rechts).es / ftp_upload / 52.731 / 52731fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:. Segmentatie van microgliale cel en somata (A) GFP + cellen gemaakt door segmentatie in 2D met FluoRender. (B) Overeenkomstige cel somata, gedetecteerd door drempelvorming behulp image confocale analyse software. (C) binaire masker cel somata vatbaar zijn voor kwantitatieve analyse. (D) Classificatie van gesegmenteerde cel somata per gebied te discrimineren geactiveerde microgliale cellen (> 50-60 urn 2, magenta) en niet-geactiveerde cellen (<50 um 2, groen). Dim en kleine cellen (<10-20 micrometer 2, geel asterisk) worden handmatig geïdentificeerd in het originele beeld met omgekeerde grijstinten (
Figuur 7:. Longitudinale volgen van microgliale celdichtheid en activering bij jonge DBA / 2J netvlies (A) Leven cSLO fundus en FA afbeeldingen van hetzelfde oog, verworven 3-5 maanden. Sequentiële FA afbeeldingen gebruikt om veranderingen in de tijd in totaal aantal CX3CR1-GFP + cellen gelokaliseerd in het centrale -1,7 mm 2 van netvlies kwantificeren. Telt opgenomen parenchymale en perivasculaire microglia, maar uitgesloten cellen geclusterd op het ONH (positie aangegeven met een witte cirkel). (B) tijdsverloop analyse van het netvlies microglia celdichtheid en activering op de leeftijd van voorgaandeneurodegeneratie in DBA / 2J chronisch glaucoom (n = 10 per netvlies leeftijd). Aantallen van de totale GFP + cellen en van geactiveerde microgliacellen (Somal gebied> 50 um 2) per mm 2 van de centrale netvlies. Elk gegevenspunt stelt een retina, en middelen voor elke leeftijd worden afgebeeld met een horizontale lijn. (C) Maandelijkse volgen aantallen totale GFP + cellen en geactiveerde microgliale cellen in één retina. Er zijn parallel maar kwantitatief verschillende veranderingen in totaal geactiveerde celdichtheid, met meer dynamische variatie in de dichtheid van morfologisch geactiveerde cellen. Schaal balk vertegenwoordigt 250 pm (A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Live bewaking van microgliale celaantal en morfologische activatie bij een neurodegeneratieve ziekte vereist het gebruik van niet-invasieve beeldvorming methoden dat de gedetailleerde visualisatie van cel functies mogelijk. Na beeldvorming, moet microgliale cellen worden geïsoleerd (gesegmenteerd) voor morfometrische analyse met gebruik van meervoudige drempel stappen Somal grootte en / of complexiteit van het proces als uitlezingen voor microglia activatie beoordelen. In dit protocol beschrijven we methoden voor livebeeld overname behulp cSLO en kwantitatieve analyse van microglia activering op basis van sequentiële cel en soma segmentatie. We passen deze strategieën om de kinetiek van retinale microglia activatie en microgliose beoordeelt dan 2 maanden in het kader van een chronische neurodegeneratieve aandoening van het netvlies.
Reporter muizen en microglia / perifere monocyten celtypes
Het gebruik van muizen die GFP onder de controle van de fractalkine receptor expressie (CX3CR1)locus 46 maakt betrouwbare identificatie van ingezeten microglia, en robuuste GFP expressie maakt opmerkelijke in vivo visualisatie 30-32,34,36. Hier gebruiken we een substam van DBA / 2J muizen, verkregen door terugkruisen C57BL / 6.129P- CX3CR1 tm1Litt / J muizen 46 in de DBA / 2J genetische achtergrond 59. Perifere monocyten en macrofagen, die het centrale zenuwstelsel kan binnendringen tijdens ziekte of letsel, ook uitdrukking aan de GFP-tag 15,46,47.
Live-imaging studies van microglia in het neurodegeneratieve retina
Onze in vivo volgen van CX3CR1-GFP / + retinale cellen middels cSLO bouwt verder op eerdere studies dat veranderingen in retinale GFP + celaantallen na acute verwonding tot 10 weken 30-32,34,48 gecontroleerd. Hier, visualiseren we CX3CR1-GFP / + microglia / perifere monocyten met cellulaire resolutie, door maandelijkse cSLO beeldvorming van het netvlies tijdens de vroege progressie van chronisch glaucoom. EENdditionally, maken we gebruik van livebeeld geautomatiseerde drempel gebaseerde analyse op te sporen en te kwantificeren cel resizen en remodeling met voldoende ruimtelijke en temporele resolutie op veranderingen in geactiveerd en totaal microglia tellingen binnen afzonderlijke ogen en tussen individuen te monitoren.
Technische beperkingen van cSLO beeldvorming van GFP + microglia in de retina
Hebben we beeldkwaliteit consistent en reproduceerbaar zijn, zoals blijkt uit vergelijking van eenmalige en meervoudige xy point verkregen beelden in een enkele zitting (figuur 5). Echter, consistente en reproduceerbare GFP + cell imaging overname, in een enkele sessie en na verloop van tijd, is kritisch afhankelijk van de selectie van stabiele parameters voor fundus en fluorescentie cSLO beeldvorming. Uitlijning van het oog en optische schijf naar de cSLO doel bepaalt de uniformiteit van verzadiging niveaus en de focus op de confocale vlak van belang 49. Onjuiste en / of ongelijkmatige specificatiop verzadiging niveaus kunnen artefactuele variaties in GFP detectie, autofluorescentie achtergrond, en cel en prieel resolutie te genereren. Correct gericht op microglia gelokaliseerd in de zenuwvezel en ganglioncel lagen, is het essentieel om te lijnen en focus op de retinale bloedvaten en axonale bundels het glasachtige oppervlak door IR imaging fundus. Dit verschaft een referentievlak de GFP + cellen door FA lokaliseren. De vereiste heroriëntering die nodig is voor het omschakelen van IR naar FA kan worden geleid door de overname van meerdere FA beelden op iets verschillende diepten (55-60 D) in elke experimentele sessie. Dit kan ook helpen compenseren voor anatomische verschillen als gevolg van leeftijd, pupilverwijding en pathologie (optische disc opgraving). Aangezien beeldresolutie en cellen detail afhankelijk van de optimale specificatie van verzadigingsniveaus gehele fundus en zorgvuldige uitlijning van het oog ten opzichte van de camera 49, beeldsequenties verworven tijd voor hetzelfde oog moet fundus IR beelden met c tonenonsistent en vergelijkbare scherpstelling, belichting, resolutie en het netvlies veld overspanning. Manuele tellingen van de totale GFP + cellen getallen in beelden verworven in een enkele sessie (1,5-1,7 mm 2 van netvlies, n = 13 netvliezen, 3-5 maanden oud) bevestigd consistente en reproduceerbare kwantificering van cellulariteit (3-4% variatie; data niet getoond). Dit is noodzakelijk voor afbeeldingen te vatbaar voor GFP + cellen segmentatie via drempelanalyse met een soortgelijk intensiteitsbereik, en vergelijking van de veranderingen in de tijd.
Drempel en morfometrische analyses van het netvlies microglia in levende cSLO beelden
Pas onlangs, heeft in vivo visualisatie van de hersenen microglia met hoge cellulaire resolutie door twee-foton confocale microscopie de kwantitatieve analyse van microglia soma en procesparameters, en de discriminatie van morfologisch geactiveerde microglia 9,50 ingeschakeld. Zoals getoond door deze auteurs, Somal grootte is de meest opvallende morfologischeparameter detecteerbaar tijd levend twee-foton confocale beeldvorming van de hersenen microglia, middels iteratieve intensiteit gebaseerde drempelwaarden voor signaal-ruis 9 variaties te verminderen. Bovendien Somal grootte veranderingen correleren met opregulatie van Iba1 expressie in geactiveerde cellen 9. Hier gebruiken we cSLO levende beelden en vergelijkbare opeenvolgende segmentatie van microgliale cellen en cellichamen, gevolgd door morfometrische analyse aantal totale kwantificeren passen en geactiveerde CX3CR1-GFP + cellen gelokaliseerd in het netvlies.
We gebruiken speciale confocale applicatiesoftware (FluoRender) segmenteren GFP + cellen in het centrale retina. Deze beelden worden verder thresholded met behulp van een commercieel beschikbare confocale beeldanalyse pakket, om uiteindelijk laat de automatische segmentatie en-drempel op basis van kwantificering van Somal omgeving. Onze livebeeld analyses bevestigde het gebruik van soma grootte als een morfologische metriek van microgliale activering in levende beeldanalyse 9. Somal-drempel op basis van tellingen liet de karakterisering van patronen en een toename van het netvlies microgliose, zoals eerder aangetoond door ex vivo beeldanalyse 50. We vinden dat cSLO detecteert GFP + microglia met de beste resolutie en detail binnen de muis centrale netvlies (<2 mm 2), waar de cellen kunnen worden afgebeeld op hetzelfde confocale vlak. Naar het netvlies periferie, het fluorescentiesignaal toont variabiliteit en vervormingen die identiek beeldverwerking en drempelanalyse als voor GFP + cellen waargenomen in de vlakkere centrale netvlies voorkomen. Tenslotte maken protocol duidelijk dat cSLO in vivo beeldanalyse van retinale microglia heeft een relatief hoge doorvoer. Het aantal parenchymale microgliale die visueel geïsoleerd en gekwantificeerd binnen het centrale retina kan worden gevarieerd tussen ~ 200-300 totale cellen en ~ 10-180 geactiveerde cellen. Aldus, de muis retinale microglia biedt een optimale populatie in vivo hun transformatie en rollen bestuderen dijdens de pathogenese van neurodegeneratie.
Toepassing op andere CZS chronische ziekten
De in vivo beeldanalyse methoden hier beschreven moet van toepassing zijn op acute of chronische microglia veranderingen in andere muis retinale aandoeningen en letsel modellen beoordelen. Bovendien kan dit protocol dienen om netvlies microglia / monocyten perifere veranderingen als gevolg van chronische CNS ziekten, zoals Alzheimer, Parkinson en multiple sclerose, aangezien de retina en optische zenuw zijn gericht op neurodegeneratie bij deze ziekten 51-56 evalueren. In lijn met deze, het gebruik van levende detectie van netvlies en ONH pathologie voor disease management vroege Alzheimer is onder intense studie 54,57,58.
Samenvattend zijn onze bevindingen suggereren dat levende longitudinale volgen en kwantificeren van veranderingen in retinale microglia aantallen en morfologische activatie kan betrouwbaar ne dienenuroimaging biomarkers voor ziekten intrede en vroege progressie detecteren. Deze in vivo beeldvorming en methodologie van toepassing op leeftijdsgebonden glaucoom, en mogelijk andere neurodegeneratieve ziekten die invloed hebben op het netvlies en de oogzenuw.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000671 and 00582 | Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift. |
| 30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe | BD, East Rutherford, NJ | 305106 and 309659 | |
| 2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T48402, 152463 and P4417 | Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week. |
| Heat therapy T/Pump | Gaymar Industries, Orchard Park, NY | TP-650 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 23-400-100 | |
| Tropicamide 1% | Bausch & Lomb, Rochester, NY | NDC 24208-585-64 | |
| PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center | Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK | G003709 | Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes. |
| HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software | Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA | Version 1.7.1.0 | |
| PowerPoint | Microsoft, Redmond, WA | Version 14.4.3 | |
| Adobe Photoshop | Adobe, San Jose, CA | Version CS3 | |
| FluoRender | Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah | Version 2.13 | Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html |
| NIS-Elements C | Nikon, Melville, NY | Version 4.30.01 |
References
- Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57 (6), 563-581 (1999).
- Jonas, R. A., et al. The spider effect: morphological and orienting classification of microglia in response to stimuli in vivo. PloS One. 7 (2), e30763 (2012).
- Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PloS One. 7 (2), 1-9 (2012).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Elmore, M. R., et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
- Solomon, J. N., et al. Origin and distribution of bone marrow-derived cells in the central nervous system in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 53, 744-753 (2006).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat. Neurosc. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Sapp, E., et al. Early and progressive accumulation of reactive microglia in the Huntington disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60 (2), 161-172 (2001).
- Maeda, J., et al. In vivo positron emission tomographic imaging of glial responses to amyloid-beta and tau pathologies in mouse models of Alzheimer's disease and related disorders. J. Neurosc. 31 (12), 4720-4730 (2011).
- Jacobs, A. H., Tavitian, B. Noninvasive molecular imaging of neuroinflammation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1393-1415 (2012).
- Ouchi, Y., et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease. Ann. Neurol. 57 (2), 168-175 (2005).
- Fuhrmann, M., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Trapani, A., Palazzo, C., de Candia, M., Lasorsa, F. M., Trapani, G. Targeting of the translocator protein 18 kDa (TSPO): a valuable approach for nuclear and optical imaging of activated microglia. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1415-1428 (2013).
- Venneti, S., Lopresti, B. J., Wiley, C. A. Molecular imaging of microglia/macrophages in the brain. Glia. 61 (1), 10-23 (2013).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat. Comm. 3 (1227), 1-15 (2012).
- Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), e17910 (2011).
- Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp. Neurol. 254 (214), 109-120 (2014).
- Nayak, D., Zinselmeyer, B. H., Corps, K. N., McGavern, D. B. In vivo dynamics of innate immune sentinels in the CNS. Intravital. 1 (2), 95-106 (2012).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), 1-16 (2010).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. J. Neurosci. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J. Vis. Exp. 19 (43), (2010).
- Alt, C., Runnels, J. M., L, T. G. S., P, L. C. In vivo tracking of hematopoietic cells in the retina of chimeric mice with a scanning laser ophthalmoscope. Intravital. 1 (2), 132-140 (2012).
- Eter, N., et al. In vivo visualization of dendritic cells, macrophages, and microglial cells responding to laser-induced damage in the fundus of the eye. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (8), 3649-3658 (2008).
- Liu, S., et al. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage. Investigative ophthalmology & visual science. 53, 6254-6262 (2012).
- Maeda, A., et al. Two-photon microscopy reveals early rod photoreceptor cell damage in light-exposed mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (14), E1428-E1437 (2014).
- Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
- Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45 (28), 3512-3519 (2005).
- Alt, C., Runnels, J. M., Mortensen, L. J., Zaher, W., Lin, C. P. In vivo imaging of microglia turnover in the mouse retina after ionizing radiation and dexamethasone treatment. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 55 (8), 5314-5319 (2014).
- Bosco, A., et al. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (4), 1437-1446 (2008).
- Anderson, M. G., et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30 (1), 81-85 (2002).
- Chang, B., et al. Interacting loci cause severe iris atrophy and glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 21 (4), 405-409 (1999).
- Smith, R. S., Korb, D., John, S. W. A goniolens for clinical monitoring of the mouse iridocorneal angle and optic nerve. Mol. Vis. 8, 26-31 (2002).
- Buckingham, B. P., et al. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28 (11), 2735-2744 (2008).
- Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 179 (7), 1523-1537 (2007).
- Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 171 (2), 313-325 (2005).
- Soto, I., et al. Retinal ganglion cells downregulate gene expression and lose their axons within the optic nerve head in a mouse glaucoma model. J. Neurosci. 28 (2), 548-561 (2008).
- Bosco, A., Steele, M. R., Vetter, M. L. Early microglia activation in a mouse model of chronic glaucoma. J. Comp. Neurol. 519 (4), 599-620 (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Broux, B., et al. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J. Autoimmun. 38 (1), 10-19 (2012).
- Paques, M., et al. In vivo observation of the locomotion of microglial cells in the retina. Glia. 58 (14), 1663-1668 (2010).
- Charbel Issa, P., et al. Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 53 (2), 1066-1075 (2012).
- Beynon, S. B., Walker, F. R. Microglial activation in the injured and healthy brain: what are we really talking about? Practical and theoretical issues associated with the measurement of changes in microglial morphology. Neuroscience. 225 (2012), 162-171 (2012).
- Chan, J. W. Recent advances in optic neuritis related to multiple sclerosis. Acta Ophthalmol. 90 (3), 203-209 (2012).
- Frost, S., Martins, R. N., Kanagasingam, Y. Ocular biomarkers for early detection of Alzheimer's disease. J. Alzheimer's Dis. 22 (1), 1-16 (2010).
- Guo, L., Duggan, J., Cordeiro, M. F. Alzheimer's disease and retinal neurodegeneration. Curr. Alzheimer Res. 7 (1), 3-14 (2010).
- Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 83 (9), 917-922 (2012).
- Kersten, H. M., Roxburgh, R. H., Danesh-Meyer, H. V. Ophthalmic manifestations of inherited neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 10 (6), 349-362 (2014).
- Kesler, A., Vakhapova, V., Korczyn, A. D., Naftaliev, E., Neudorfer, M. Retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 113 (7), 523-526 (2011).
- Petzold, A., et al. Optical coherence tomography in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 9 (9), 921-932 (2010).
- Satue, M., et al. Retinal thinning and correlation with functional disability in patients with Parkinson's disease. Br. J. Ophthalmol. 98 (3), 350-355 (2014).
- Bosco, A., Romero, C. O., Breen, K. T., Chagovetz, A. A., Steele, M. R., Ambati, B. K., Vetter, M. L. Neurodegeneration severity can be predicted from early microglia alterations monitored in vivo in a mouse model of chronic glaucoma. Dis Model Mech. , (2015).
