Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics

Published: May 11, 2015 doi: 10.3791/52731
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Neurobiology & Anatomy, University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah

Summary

Mikroglia aktivasyonu ve mikroglioz kronik nörodejenerasyona önemli tepkilerdir. Burada, in vivo, konfokal oftalmoskopi retinal CX3CR1-GFP + mikroglial hücreleri uzun süreli görselleştirme için yöntemler sunmak ve eşik ve morfometrik için belirlemek ve aktivasyonunu ölçmek için analiz eder. Biz yaşa bağlı glokomun erken evrelerinde mikrogliyal değişiklikleri takip.

Abstract

CNS-resident nöroimmün hücreleri mikroglia, farklı fonksiyonları ve gen ekspresyon profilleri ile aktive durumuna geçiş, MSS hasarı yanıt olarak kendi morfolojisi ve boyutunu dönüşümü. Sağlık, yaralanma ve hastalık mikrogliyal aktivasyon rolleri tam olarak nedeniyle mikroçevresinin değişikliklere tepki olarak dinamik ve karmaşık düzenlemeye anlaşılamamıştır. Bu nedenle, non-invaziv monitör için çok önemlidir ve bozulmamış organizmada zamanla mikrogliyal aktivasyon değişiklikleri analiz eder. In vivo mikrogliyal aktivasyon çalışmaları CNS ortamı değiştirmeden izleme mikrogliyal davranış teknik sınırlamalar gecikmelidir edilmiştir. Bu uzun vadeli değişiklikler izlenir gereken kronik nörodejenerasyon sırasında özellikle zor olmuştur. Retina, non-invaziv canlı görüntüleme için uygun bir CNS organ görselleştirmek ve kronik hastalık sırasında mikroglia aktivasyonu dinamiklerini karakterize için güçlü bir sistem sunmaktadır.

in vivo görüntüleme, hücresel çözünürlük ile mikroglia görselleştirmek için, konfokal oftalmoskopi (cSLO) ve CX3CR1 GFP / + raportör fareler kullanmak için yöntemler açıklar. Ayrıca, biz büyük hücre alt hücre aktivasyonu ve yoğunluğu aylık değişimleri (retinanın başına 200-300 hücre) ölçmek için yöntemler açıklanmaktadır. Biz in vivo görüntülerin otomatik eşik tabanlı morfometrik analizi uygulayarak retinada mikrogliyal aktivasyon canlı izleme için yararlı bir metrik olarak lizozomal alanının kullanımını doğrulamaktadır. Biz bu canlı görüntü alımı kullanmak ve kronik glokom bir fare modelinde retina nörodejenerasyon erken aşamalarında mikrogliyal aktivasyon ve mikrogliyozu dinamik değişiklikleri izlemek için stratejiler analiz eder. Bu yaklaşım retina ve optik sinir etkileyen kronik CNS rahatsızlıkları nöronal ve aksonal düşüş mikroglia katkılarını araştırmak için yararlı olacaktır.

Introduction

Mikroglia sadece erken embriyonik gelişim beri ve yetişkinlik boyunca merkezi sinir sistemi (MSS) ikamet nöroimmün hücrelerdir. Reseptörlerinin karmaşık bir repertuar ile donatılmış, mikrogliyal aktivite ve bölgesel heterojenlik komşu nöronlar, glia, kan-beyin bariyeri ve nöroenflamatuar hücreleri 1,2 infiltre ile çift yönlü etkileşimi tarafından düzenlenir. Onlar homeostazisi 3,4 olarak tedirginlikler için kendi topraklarını örnek olarak bazal mikrogliyal fonksiyonlar, fizyolojik bakım ve onarım katkıda bulunmaktadır. CNS yaralanma ya da hastalık sırasında, mikroglia sonra reaktif fenotip onların geçişi tetikler nöronal sinyalleri ilk müdahale var, "mikroglia 2,5-7 aktif olarak adlandırılan. Mikroglia aktivasyonu, hücre soma ve süreç yeniden boyutlandırma ve 6-9 biçimlenme kuple edilir geni ve protein ifadesi, karmaşık bir döngüsünü içerir. Mikroglia aktivasyonu, aynı zamanda, hücre yeniden dağıtım vekümeleme, hücre sayısının (adlandırılır mikroglioz) yerel genel bir artış eşlik edebilir. Bu ya da kan-kaynaklı monosit 3,4,7,10-14 işe olmayan hücre proliferasyonu ve kendini yenileme, kaynaklanabilir. Yaşa bağlı kronik CNS hastalıkları geniş bir yelpazede, mikroglioz ve mikrogliya aktivasyon paralel hastalığın ilerlemesini 15-19 sürdürmüştür. Nasıl Mikroglia darbe nörodejenerasyon onlar hastalığın başlangıcı ve ilerlemesine farklı katkıları olabilir hem nöroprotektif ve zararlı roller oynamaya başlıca nedeni, belirsizliğini koruyor. Kronik CNS hastalığı anlamaya yönelik canlı görüntüleme çalışmaları hayvan modellerinde ve insan merkezi sinir sistemi hasar görmüş mikrogliyal davranışı gözlenir ve mikroglial değişiklikler hastalığın erken aşamalarında 15-17,19,20 saptanabilen bir başlangıç ​​olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, tespit etmek ve in vivo olarak mikroglial aktivasyon izlemek için yaklaşımlar geliştirilmesi kritik öneme sahiptir.

Non-invaziv deteBeyin mikroglia aktivasyonu bölgesel değişikliklerin ction moleküler görüntüleme veya biyolüminesans ve pozitron emisyon tomografisi veya manyetik rezonans görüntüleme 18,21,22 kullanarak, nörodejeneratif hastalığın ilerlemesi in vivo göstergesi önemli bir olarak kurulmuştur. Bu son derece nicel ve non-invaziv moleküler ve nükleer tıp görüntüleme yöntemleri bölgesel çözünürlükte gliozis algılar. Alternatif olarak, CX3CR1 GFP / + farelerde iki foton konfokal görüntüleme hücresel çözünürlükte 3,4,9,20,23-28 beyin mikroglia gözlenmesi izin verdi. Ancak, bu yaklaşım bile minimal invaziv beyin görüntüleme prosedürleri 29 kendi davranışlarını rahatsız potansiyel risk göz önüne alındığında, uzun vadeli ve kronik mikrogliyal değişiklikler tekrarlanan gözlem sınırlar. Alternatif olarak, retina, akut yaralanma sonrası in vivo görselleştirme doğrudan için en uygun koşulları ve yaşlanma boyunca bozulmadan MSS niş içinde mikrogliya tekrarlanan izleme sunar vePotansiyel kronik nörodejeneratif hastalıklar sırasında. Böylece, son çalışmalar görüntüye konfokal tarayıcı laser oftalmoskopi (cSLO) canlı CX3CR1 GFP / + fareler uyarlayarak GFP ifade retina mikroglia yüksek çözünürlüklü görüntüleme fizibilite kanıtlamıştır. Bu akut kaynaklı yaralanma ya da oküler hipertansiyon 30-36 Aşağıdaki kadar 10 hafta için tek tek farelerde GFP + hücre sayıları haftalık değişimleri izlemek için kullanılmıştır.

Biz birkaç ay içinde uzun vadeli görüntüleme gerçekleştirmek ve kantitatif morfometrik analizi kullanılarak soma boyutuna göre mikroglia aktivasyonu değişiklikleri izlemek için bu yaklaşımı artırdık. Somal boyutu CX3CR1-GFP + mikroglia 9 in vivo görüntüleme gerçekleştirmek için kortikal dilim iki foton konfokal mikroskopi kullanılarak canlı görüntüleme çalışmalarında Mikroglia aktivitesi için faydalı bir ölçüt olarak tanımlandı. Bunlar ve diğer çalışmalarda da, WH lizozomal büyüklüğü ve Iba1 protein ekspresyonu düzeyleri arasında korelasyon gösterdiIch, aktivasyon 9,37 ile artar. Bu nedenle, aktif mikroglia canlı farelerde tespit edilebilir, ve bunların sayısı ve dağılımı MSS sağlık ve hastalık sırasında zaman içinde izlenebilir.

Bu protokol cSLO canlı görüntü toplama ve analiz yöntemleri mikrogliyal hücre sayıları, retina ganglion hücre (RGH) dejenerasyonu (Şekil 1) sırasında dağılımı ve morfolojik aktivasyon izlemek için açıklanır. Böylece, bu çalışma kullanır: 1) yaşa bağlı optik sinir ve retina ve nörodejenerasyonunun uğrar miras glokom (DBA / 2J) bir fare modeli yaş 38,39 5 ile 10 ay arasında hastalığın ilerlemesinde kayda değer değişkenlik gösterir, 2) aylık Uzun vadeli retinada GFP + hücrelerin görselleştirme ve 3-5 ay, hücre somata ve ölçü izole etmek segmentasyon ve eşikleme 3) canlı görüntüleme analizi yaşlı heterozigot Cx3cr1 GFP / + DBA / 2J farelerin miyelinsiz optik sinirin için cSLO in vivo görüntülemeIR alanı. Bu stratejiler, kronik glokom erken evrelerinde retina mikrogliyal aktivasyonun durumlarının kinetiğini değerlendirmek için uygulanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

İn vivo görüntüleme Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokoller kullanılarak patojensiz tesislerinde yapılır.
NOT: Bu görüntüleme protokolü retina mikroglia ve infiltre monositler / makrofajlar fractalkine reseptör lokus (CX3CR1) kontrolü altında, yeşil fluoresan protein (GFP) ifade eden raportör fareler için kullanılır.

Konfokal Tarayıcı Lazer Oftalmoskopide tarafından Retina GFP + mikroglia Vivo Görüntüleme 1. (cSLO)

  1. İşlem sırasında 35-37 ºC arasında fare sıcaklığını dengelemek için ayarlanmış su kontrollü ısıtma sistemi, açın ve iki ısıtma pedleri bağlayın.
    1. Konfokal tarayıcı laser oftalmoskop (cSLO) sistemi (Şekil 2A) başlatın. Bireysel fare tanımlamak ve 2 mm (Hasta Veri menüsü) bir kornea eğriliğini koyacaktır bilgileri girin, cSLO programını açın.
  2. Ima hazırlanınging. Güvenli yuvasından temiz bir 55º geniş alan objektif lens takınız. Temiz kağıdı ile kaplı bir ısıtma yastığı güvence altına alarak oftalmoskop görüntüleme platformu hazırlayın. Ped ve kağıdı düzleştirmek ve objektif lens hareketini engelleme onları tutmak için klipler kullanın.
  3. % 1.3 2,2,2-tribromoetanol ve% 0.8 tert-amil alkol intraperitoneal enjeksiyonu ile fare anestezisi (250 mg / kg vücut ağırlığı; 0.5 ml / 25 g vücut ağırlığı), bir 1 ml tek kullanımlık takılan bir 30½ G iğne kullanılarak Şırınga. Kendi kafesine fare dönün, bir ısıtma yastığı üzerinde tuttu.
    NOT: Teneffüs karşı enjeksiyon yoluyla anestezi teslim burun koni ve boru ücretsiz görüntüleme ve gözlere engelsiz erişim için fare, daha kolay konumlandırma izin verir.
  4. Hayvan hareket durur ve kuyruk tutam tepkisiz sonra, eğilimli hayvan konumlandırılması ve 7 dakika boyunca damla her iki gözlerini kapatarak, tropikamid ve fenilefrin (% 0.5 her biri) ile öğrenci dilatasyon neden olur.
  5. 5 dk, p sonraMinimal basınç uygulayarak, her iki gözlerinin üzerinde oftalmoskop platformun ortasına eğilimli fare ve fit kontakt lensler dantel.
    NOT: forseps yerine 40 kullanılabilmesine rağmen Kontakt lensler, küçük ve kırılgan ama dikkatle parmaklarınızla ele alınabilir. o göz kuruluğu en aza indirir ve görüntüleme sırasında kornea saydamlığını koruyan olarak kontakt lens kullanımı isteğe ama tavsiye edilir.
  6. 7 dakika sonra, platformun (Şekil 2B) kenarına yakın sınırlanmadığı hayvan tutarak, objektif lens ve objektif lens yörünge paralel bakan sağ gözü ile fare yönlendirmek. Karşılaştırılabilir doygunluğu ve yönlendirme görüntüleri toplamak için sürekli objektif lens gözün mesafe yanı sıra görüntüleme oturumları boyunca ışık yolu göze hizasını korumak. Gözün gözlem müdahale uzun bıyıkları Clip.
    NOT: Bir sonraki 8-10 dakika için, fare taşımak veya yanıp ve nazik hareket ile olacak nefes olmazyüksek kontrastlı fundus yerlerinden dayalı tarama kafası konumunu ayarlar cSLO Göz İzleme ART (otomatik gerçek zamanlı) modu ile izlenir likte. O zaman geçmiş, fareler görüntüleme pratik yapma, nefes nefese ve yanıp sönen başlar.
  7. Görüntüleme kontakt lens kullanmadan gerçekleştirilirse, PBS her iki göze kurumasını önlemek için her 2-3 dakikada damla uygulayın.
  8. Retina damar sistemi ve optik diskin fundus görüntüsünü toplayın, iç retina üzerinde duruldu.
    1. Kızılötesi modu (IR) seçin ve 820 nm uyarma,% 100 lazer gücü,% 40-60 duyarlılık (Şekil 2C) ayarları yapın.
    2. Yüksek hız modunda (12,6 kare / sn) Çalışma, oftalmoskopu sürmek için joystick'i kullanarak göz bulun. Düşük büyütmede, yaralanma veya opaklık için kornea ve lensi incelemek ve retina (Şekil 3A) görüntüleme etkileyecek kusurları ya da yaralanma ile çalışma gözlerinden dahil değildir.
    3. Optik disk alanını (yüzeyini bulunyakın göz hedefi getirerek optik sinir başı, OSB), sonra bunun görüntüsünü ortalamak ve joystick vidalanarak bu pozisyonu kilitleyin. Oftalmoskop Gözün bu hizalama bile elde resmin üzerinde odaklanmak ve emisyon anahtarıdır.
    4. Kazılan optik gösteren gözünde bir referans odak düzlemi (59 ve 60 D), ya da daha derin (55 D) olarak retina vitreus yüzeyinde bulunan büyük kan damarlarını kullanarak, OSB yanı sıra, retinanın iç uçakları görselleştirmek diskler. Optimal odak açıkça belirgin onların lümeni ve duvarlar ile büyük kan damarları içinde kan hücreleri dolaşan çözmelidir.
    5. Üniforma aydınlatma beyaz halo (hafif aşırı pozlamayı kullanarak) optik disk etrafında 55º fundus alanında çoğunda yayılan kadar dokunmatik kontrol paneli üzerindeki düğmeyi ayarlayarak görüntü doygunluğu optimize edin. Sonra, büyük damarlar boyunca hareket kan hücreleri açıkça çözülebilir kadar kontrast optimize etmek için doygunluğu düşük. Fokal karanlık Eğeralanlar değil nedeniyle retina hasarı, bir homojen parlak bir görüntü elde edilinceye kadar kameraya göz realign, devam etmektedir. Bu ayar konumuna ve kalite görüntülerin tekrarlanabilir setleri yakalamak için esastır.
    6. Gerçek zamanlı olarak 30 kare (4.7 kare / sn; normalize) ortalama (yaşa bağlı olarak, çapı 1,4-1,7 mm), merkezi retina yüksek çözünürlüklü IR görüntüsü toplamak sinyal-gürültü oranını geliştirmek için, (Şekil 2D ).
  9. Hemen, GFP + mikrogliya ve / veya retina ve OSB iç uçakları lokalize sızan monositler bir floresan görüntü kazanır.
    Not: retina İR fundus görüntüsünün Optimizasyonu GFP + hücrelerinin floresan görüntü çözünürlüğünü, hem de yayılmış iç retina belirlemektedir. Damarsal kötü kararı ile tespit edilebilir retinanın, iç uçakları odaklanmak için başarısızlık, soluk GFP + hücre görünümleri (Şekil 3B) neden olur. IR Satu ayarlamak için başarısızlıkoranı düzgün ve eşit olarak GFP + hücre yoğunluğu ve boyutu (Şekil 3C) artefakt varyasyonları sokulması, floresan görüntü (FA) etkilemektedir.
    1. Korunur mavi, 488 nm lazer uyarma (460-490 nm bariyer filtre seti) ve satın alma ayarlarını (% 100 lazer gücü ve 100-125% duyarlılık) kullanarak, dokunmatik ekran panelinde görüntüleme modu (FA) floresan Swich Tüm fareler (Şekil 2E) için sabittir.
    2. Tek bir xy noktası, retinanın iki boyutlu floresan görüntü toplayın ve hemen özdeş pozisyonda bir fundus görüntü yakalamak (100x tarama ortalama, her iki görüntüler için 55º tarama açısı; Şekil 2F).
    3. Burun-zamansal ekseni (Şekil 2H) karşısında retina kaydırma, kontrol paneli (Şekil 2G) 'de "kompozit" seçme ve oftalmoskop sağa hareket ve sol tarafından bir çoklu görüntü yakalamak.
      NOT: Tek bir xy noktası görüntü taradıktan sonra (100x sgerçek zamanlı yazılım otomatik olarak optimum tarama veya tarama olanaksız olduğunda kırmızı sırasında ortalamalar yeşil bir daire ile sınırlı aynı ve yeni alanlara (yeni taramalar), ve dikişleri tüm xy-pozisyonları,) ortalamasını yapabilirsiniz. Elde edilen kompozit görüntü dikey eksende (55º x 120-124º tarama açı) yatay eksen x 3-4 mm üzerinde 1.5-1.7 mm açıklıklı.
  10. Yanıp sönen ve hareket yeniden başlatıldığında daha önce, anestezi uyaran sonra 15 dakika içinde her farenin Komple görüntüleme.
  11. PBS ile kontakt lensler, hidrat gözleri çıkarın ve motilite tam iyileşme kadar davranışını kontrol etmek, onun ısındı kafesine hayvan dönün.
  12. Aynı bireysel fare aralıklı cSLO görüntüleme oturumları kullanarak uzunlamasına çalışmalar için, anestezi kümülatif toksisite yanı sıra korneal tahrişi önlemek için en az 3 gün arayla görüntüleme tekrarlayın.

2. Canlı Görüntü İşleme ve Analizi

  1. Sıralı görüntü hizalama:
    1. Hizalamanirengi noktaları gibi damarsal ve optik disk kullanarak aynı gözün bir zaman serisi için fundus görüntüleri. Ticari bir slayt gösterisi sunumu programında, kendi optik diskler karboksi- uçağa hizaya gelene kadar bir önceki (üst resim sürüklenen olurken yarı saydam görünür), o zamana kadar üst görüntüyü döndürmek üzerinde her görüntüyü sürükleyerek tüm görüntüleri açın onun büyük kan damarları (uzak optik diskten gemiler odaklanan) aşağıdaki resimde damarsal örtüşüyor. Her resim için döndürme açısını kaydetme ve fare ve göz kimliğinin takip, ileride başvurmak üzere bu zaman serisi kaydedin.
    2. Her zaman noktasında xy dönüşünü düzeltmek için kaydedilen açı uygulamanın bir raster grafik editörü programını kullanarak tek xy noktası floresan görüntülerin gelen dizi aynı hizaya getirin. Ayrıca, 300 (yeniden ölçekleme olmadan) dpi ve arka plan çözünürlüğü ayarlamak (RGB modunda seçin Düzeyleri ve siyah bir kan damarının lümeni örnek). Bu görüntüleri kaydetmeTIF dosyalarını olarak, kendi adlarına "hizalanmış" eklenerek.
  2. Mikrogliyal hücre segmentasyon:
    1. FluoRender açık, merkezi retinada en erken zaman noktası / yaşa tekabül "hizaya" TIF dosyası GFP + hücreleri tespit etmek. Ekrana sığacak şekilde görüntüyü yakınlaştırma, daha sonra (sakla görünür olarak RG kanalları hem seçerek, Render görünümü (kompozit, dik, değerli) ve özelliklerini (0.58 gama, 255 doyma noktası, 255 parlaklık, 195 alfa ve 1.00 gölgeleme) tanımlamak çift ​​tıklayarak Çalışma Alanı çerçeve içinde tarafından B kanalı; Şekil 4A).
    2. Sürekli yüksek eşiği tutarken hücrelerin çoğunluğu asgari örtüşme ve hücre süreçlerinin (mavi) ile (beyaz) maskeli kadar düşük eşiği artırarak, (Workspace çerçeve üzerinde vurgulanmış olmalıdır) tek tek hücrelerin, eşik kırmızı kanalı seçmek için (255). Düşük eşik değeri floresan yoğunluğu (Şekil 4B <bağlı 100 ve 170 arasında değişmektedir/ Strong>).
    3. Özgün adı (Şekil 4C) için "cellsegm" ekleyerek, yeni bir TIF dosya olarak görünür kırmızı kanalda sadece (Yakalama komutu) ile bu görünümü kaydedin. Genel raster grafik editörü yazılımı kullanarak, onun gri tonlama ters ve yukarıdaki gibi 300 dpi çözünürlüğü ayarlamak, ve RGB (Şekil 4D) olarak yeniden kaydedin.
      NOT: Otomatik FluoRender tarafından oluşturulan klasörler (proje) silin ve ileride başvurmak için uygulanan eşiği kaydedin.
  3. Mikrogliyal soma segmentasyonu ve morfometri:
    1. Alan ölçümü için GFP + hücre somata belirlemek için, otomatik yoğunluk ölçümleri ve eşik yetenekleri yanı sıra, eşik-tabanlı nesne sayma ve ölçümü ile görüntü analiz yazılımı kullanın. "Cellsegm" TIF dosyasını açın ve rescaling yöntemi (spline) ve kırmızı kanalı seçin (RGB kırmızı sekmesini tıklatın). "Renkli görünüm kanalı" seçimi kaldırarak görselleştirme geliştirin (kırmızı RG sağ tıklayınB sekmesi) ve "renkleri tamamlayacak" seçerek (Resim / gri tonlama ters ve beyaz arka plan (Şekil 4E) üzerinde siyah / gri hücreleri görmek için) Resmi ayarlayın.
    2. Tüm görüntü (Kalibrasyon, Hızlı Kalibrasyon) boyunca yatay bir çizgi çizerek, yaşa bağlı olarak 1,4-1,7 mm görüntüyü ayarlayın.
    3. Yoğunluk eşikleme (Şekil 4B) uygulayarak Segment bireysel hücre somata. Bunun için, kırmızı RGB kanalında iş ve Eşik Yoğunluk fonksiyonu açın (Object sayın; "sayım update" komutunu seçerek) ayrı somata temsil faiz (ROI) her eşiklenir bölge için iki boyutlu parametreleri izlemek için.
    4. 255 seviyeleri düşük% 50-60 seçme ve görsel eşik renk maskesi (mavi) ve hücre soma çevre (gri) içinde arasındaki örtüşme değerlendirerek nihai eşik değeri detaylandırarak, yoğunluk histogram yoğunluk eşiği tanımlayın tek tek hücreler (FŞEKIL 4E).
    5. Ölçümler% 10'dan daha az (İkili Araç Çubuğu ve Açıklamalı Ölçüleri kullanın) farklı ise 10 hücrelerinde segmentasyon önce bölgeyi ölçerek ve daha sonra lizozomal boyutlarını temsil ve seçilen eşik aralığı kabul hücre soma maskeleri doğruluğunu tahmin edin.
    6. Manuel birden çok hücre bulunur ve doğrudan hücreler (Şekil 4F) görselleştirmek için ikili açma / kapama geçiş yaparken, bu elementler (İkili Araç Çubuğu denetimleri veya Nesne Kataloğu kullanarak ortadan kaldırmak veya ayrı ROI) ayırmak lizozomal ROI'ları belirlemek.
    7. Lizozomal alanları büyük ve daha küçük 50-60 mikron 2 aktif mikroglia karşılık gelen hücre somata ayrımcılık ve Alan Kısıtlama kullanarak, sırasıyla mikroglia devre dışı etmek ile ROI olarak mikrogliyal hücreleri sınıflandırır.
      NOT: Her bir hücre lizozomal alt küme farklı yalancı bir ikili tabaka ile tespit edilir, ve daha sonra diğer morfolojik parametrelerin karakterize edilebilir (perimeter, dairesellik, vb) yanı sıra ayrık retinal sektörlerde (Şekil 4G) içinde sayısal olarak. Bir ND2 dosyası olarak analiz görüntüyü kaydedin.
    8. Lizozomal maske ve tek xy -point görüntü yazdırarak, bireysel aktive mikroglial hücrelerinde süreci ve dallanma karmaşıklığı doğrulayın (Şekil 4H kontrast% 50 arttı). El ile doğrudan hücre soma uzanan süreçleri saymak ya da çardak (İkili Araç Çubuğu ve Açıklamalı Ölçüleri kullanın) kapsayan poligonun çapını ölçün.
      Not: Aktif hücre süreçleri eksikliği ya da birkaç ayı (<4) ve kısa (<2x lizozomal çap) olanları, bir dallanmış ve detaylı mili ihtiva aktif olmayan hücre süreçlerinin aksine, (> 3-10x lizozomal çap) göreceli olarak çevrelerinde küçük soma.
    9. El ile, bu nedenle de tarafından tespit edilmemiş olan algılanma limitinin altındadır; somata daha küçük <20 um 2 ve / veya GFP ekspresyonu ile hücreleri tanımlamakyoğunluklu bir eşikleme. Elle tespit elemanları saymak için Detaylandırmalar içinde Taksonomi komutunu kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bizim son in vivo çalışmalar görselleştirmek ve geç nörodejenerasyona 59 kronik glokom ve ilişkilerinin erken aşamalarında kinetik ve OSB ve retinal mikrogliyal değişiklikler kalıplarını izlemek için bu canlı görüntü toplama ve analiz yöntemleri kullanılır. Burada bireysel genç heterozigot Cx3CR1-GFP DBA / 2J retina merkezi retina (Şekil 5) geniş bir alan boyunca mikrogliyal hücreleri görselleştirmek için bir cSLO görüntü elde etme protokolünü gösterir. Yüksek hücre karara istinaden, biz canlı görüntü eşikleme uygulamak ve morfometrik bireysel GFP + hücreleri ve somata (Şekil 6) otomatik bölümleme izin vermesini analiz eder.

Yerel mikrogliyozu ve / veya kronik glokom bu modelde saptanabilir nörodejenerasyonu önceki yaşlarda mikroglia aktivasyonu gelişimini izlemek için bireysel genç heterozigot Cx toplam mikrogliya hücre yoğunluğu aylık değişimleri ölçülmüştür3CR1-GFP DBA / 2J retinalar yaşı (Şekil 7A) 3-5 ay arasında (n = 10). Bireysel gözünde 41-44 nörodejenerasyon değişken ilerlemesi ile uyumlu olarak, bizim analiz her yaşta (Şekil 7B) gözlerin karşısında retina mikroglia aktivasyonu ve mikrogliyozu değişken seviyelerde ortaya çıkarır ve toplam yoğunluğu dinamik değişiklikleri ve bireysel retina içinde aktif mikroglia algılar (Şekil 7C). Gözle, aktif mikroglia sayısı toplam GFP + hücre yoğunluğu eşzamanlı değişikliklerden ayırdıysanız edilir. Bunlar in vivo bulgular DBA / 2J farelerinde 45 mikrogliyal değişikliklerin önceki ex vivo analizi doğrulamaktadır. Böylece cSLO canlı algılama ve retina mikrogliyal aktivasyon ölçümü bireysel gözlerinin içinde erken hastalığın ilerlemesi göstergesi olarak hizmet edebilir, ve potansiyel glokom patogenezinde olayları başlamadan bağlantılı olabilir.

"Şekil Şekil 1:. Canlı görüntü alma, işleme ve analizi akışı cSLO fare iç retina merkez ~ 1.7 mm 2 lokalize GFP + mikroglial / periferal monosit hücre görüntüsü yüz için kullanılmıştır. Floresan görüntüleri (FA), aynı fareler için aylık kazanılmış ve referans olarak retina damarsal ve vitreal yüzeyin kızılötesi (IR) fundus görüntüleri kullanılarak hizalanmış edildi. GFP + hücreleri ve somata segmentasyon FA retina görüntüleri yoğunluk-eşikleme iki ayrı adım uygulayarak kaynaklanmıştır. Ikili temsil hücre somata morfometrik analizi, bireysel lizozomal alanlarının ölçümü izin verdi. Aktive edilmiş, 50 um 2. Yukarıdaki lizozomal alanı ile GFP + hücreler sınıflandırılmıştır. Toplam ve aktif GFP + hücrelerin yoğunluğu bireysel retina FA görüntüleri için ölçülen ve çardak uzantısı muayene ve dallanma karmaşıklık FA görüntüleri doğrudan gözlem tarafından gerçekleştirilen edildi. Şekil 2,
Şekil 2: cSLO Spectralis Canlı görüntü elde etme denetimleri (A) başlandıktan Manuel dokunmatik ekran panel ekranı.. Canlı fare kafasını gösteren (B) cSLO yazılım görüntüleme penceresi. Kızılötesi görüntüleme için seçilen (C) Ayarlar (mavi yanar). Gerçek zamanlı edinimi (sol panel) ve ortalama (sağ panel) sırasında retinanın (D) Fundus görüntü. Normalleştirme komutu siyah daire ile gösterdi. Kan damarları arasındaki optik aksonal demetleri (oklar) olarak arterler ve optik sinir başı yayılan damarlar, (parantez arasında) görebilir. (E) Ayarlar tek xy noktası içinde floresan görüntüleme için seçildi. (F) Tek noktalı floresan (FA, 488 nm) iktisap (ortalama alma) esnasında görüntüleme. TO küçük görüntü (solda) bireysel tarama gösterir, büyük resim (sağ) yoğunluk ortalamasından ilerlemesini gösterir. (G) Ayarlar çok noktaya (kompozit), floresan görüntü alınması için seçildi. (H) Çoklu floresan görüntüleme edinimi, yazılım yeşil bir daire ile tanımlayan devam taramayı gösteren (veya kırmızı edinimi mümkün olmadığı durumlarda). Ölçek çubukları ~ 5 mm (B) veya 250 mikron (DH) temsil eden bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. .

Şekil 3,
Şekil 3: mikroglial hücrelerin doğru cSLO görüntüleme önleyebilir Anahtar göz kusurları ve görüntüleme hataları (A - C) Göz hasarı veya kusurları yanı sıra görüntü elde etme hatası.s retinanın iç uçakları lokalize GFP + hücrelerin güvenilir görüntüleme önleyebilir. (A) Bazı brüt göz kusurları, kornea veya lens donukluk, veya yaralanma da dahil olmak üzere ve optik disk alanının derinleşen fundus görüntüleri kolayca saptanabilir hepsi GFP + hücrelerin net görüntüleme önler. (Damarlarının duvarları lümeni ayırt edilemeyecek) üstünde ya da retinanın (damarlar neredeyse görebilir) iç yüzeyinin altında, ya Odaklama (B), sinir lifi ve ganglion hücre yer alan hücrelerden GFP floresans emisyonunun tespit edilebilirliğini azaltan Tabakalar. (C) Doygunluk düzeyleri yanlış veya düzensiz belirsiz alanlar veya görüntüleri (çözünürlük eksik hücreler) ile parlak ama doygun görüntüler neden olabilir ayarlayın. Ölçek çubuğu 250 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


Şekil 4: mikroglial hücre sayımları ve lizozomal alanının İkili eşikleme dayalı miktar (A - D), merkezi retina içinde mikroglia temsili tek noktadan floresan görüntü render manzaralı FluoRender hücre segmentasyon Adımlar (A) Navigasyon penceresi.. (üst panel); oluşturma özellikleri (alt panel) tekabül eder. Eşik ayarları (alt paneller) karşılık gelen, RGB olarak inceledi (B) hücre segmentasyon rutini sırasında aynı görüntü. Eşiklenir hücreler beyaz piksel temsil ve camgöbeği kendi süreçlerine üst üste. Hücre segmentasyon sonra elde edilen hücre maskeleri (C) Görüntü. (D) ileri görüntü işleme için ters gri tonlama değerleri ile önceki maske. (E - H) Lizozomal eşikleme ve miktar tayini aşamaları. Önceki hücre segmentasyonu dayalı bölüm mikroglia somata için yoğunluk eşiğinin (E) kullanın. RGB histogram yoğunluk (solda) yoğunlukları düşüktür% 50-60 aralığında (127-153 0) doğrudan seçimiyle eşikleme verir. Bu segmentasyon bireysel mikrogliyal somata (mavi) izole eden ölçülebilir maskesi oluşturur. Görüntüler (sağda oval) kama fonksiyonu kullanılarak rescaled. (F) bireysel ROI / somata (üst panel) ve manuel ayırma veya erozyon İkili Araçlar (sağ panel) kullanılarak örtüşen ROI'leri düzeltmek için kullanılır ROI siluetleri (Object Kataloğu, alt panel) Otomatik eşik-tabanlı ölçümler. Alan Kısıtlaması (sol üst panel) bireysel lizozomal alanlarının (G) Sınıflandırma. Segment somata ROI küçük olarak sınıflandırılır ve daha büyük 50-60 mikron 2 ve somata her sınıf için ikili katmanlar farklı renk pikseller atanır (yeşil birnd eflatun, sırasıyla). Bireysel aktif hücrelerde proses karmaşıklığı doğrudan gözlem (sol panel) için kullanılır (yüksek kontrastlı), orijinal görüntü ile ilgili bölümlere ayrılmış somata (yeşil) (H) Kaplama. Hücre milleri görünümünü Büyütülmüş. Ölçek çubukları temsil 250 mikron (AH) ya da 50 mikron (H, ek). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5: CX3CR1- GFP + mikroglia Yüksek çözünürlüklü görüntüleme / monositler canlı konfokal tarayıcı laser görüntüleme ile iç fare retinanın lokalize (A) Tek karboksi- nokta cSLO görüntü merkezi içinde GFP + hücreleri gösteren. 2 aylık DBA / 2J mouse (solda) retina. OSB alanı (daire) gösteren büyütülmüş görünüm (sağ), kan damarları (hat) perivasküler mikroglia / makrofajlar ve merkezi retina döşeme parankimal mikrogliya ile kaplı. (B) Çoklu görüntü, daha geniş bir alana retina (retina ⅓) karşısında mikroglia görselleştirmek için tek noktadan hemen sonra topladı. (C, D) hücre morfolojisi ve karmaşıklığı optimal gözlem için ters gri tonlama ile gösterilen Özdeş görüntüler, (minimal kontrast ve çözünürlük için ayarlanmıştır). Somal boyutu ve şekli en hücrelerin (solda) çözülebilir. Arbor uzatma ve hücre dallanma büyük somata (sağda ve 3 ayrı hücreler) hücrelerin çözülebilir. (E) sıralı görüntülerin xy -Plane hizalama için kullanılan damarlar ve optik disk Kızılötesi fundus görüntüsü. Ölçek çubukları 250 um (A, B ve E) ve 25 um (Cı, sağda) temsil etmektedir.es / ftp_upload / 52731 / 52731fig5highres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6:. Mikrogliyal hücre ve somata Segmentasyon (A) GFP + hücreler FluoRender kullanarak 2B segmentasyon tarafından verilen. Konfokal görüntü analizi yazılımı kullanılarak eşikleme ile tespit (B) karşılık gelen hücre somata. (C) kantitatif analiz için somata mükellef hücrenin İkili maske. Bölgelere göre parçalı hücre somata (D) Sınıflandırma mikrogliyal hücreleri (> 50-60 mikron 2, kırmızı) ve aktif olmayan hücreler (<50 mikron 2, yeşil) aktive ayrımcılık için. Dim ve küçük hücreler (<10-20 mikron 2, sarı yıldız) ters gri tonlama ile orijinal görüntü (elle tespit edilir Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Şekil 7:. Genç DBA / 2J retina mikrogliyal hücre yoğunluğu ve aktivasyonu Boyuna izleme (A) yaş 3-5 ay alınan aynı gözün cSLO fundus ve FA görüntüleri, canlı. Sıralı FA görüntüleri retinanın merkezi ~ 1.7 mm 2 lokalize toplam CX3CR1-GFP sayıları + hücrelerde zamanla değişimleri ölçmek için kullanıldı. Sayımlar parankimal ve perivasküler mikroglia, ancak OSB de kümelenmiş hariç hücreleri (pozisyon beyaz daire ile belirtilir) dahil. (B) Yukarıdaki yaşta retina mikroglia hücre yoğunluğu ve aktivasyon zamanlaması analiziDBA / 2J kronik glokom (n = yaş başına 10 retina) 'de nörodejenerasyon. Toplam GFP + hücreler ve merkez retina mm 2 başına aktif mikroglial hücreleri (lizozomal alan> 50 mikron 2) Sayılar. Her bir veri noktası, tek bir retina temsil eder ve yatay bir çizgi ile temsil edildiği her yaş için araçlar. Toplam GFP + hücrelerinin ve tek bir retinada mikroglial hücrelerinin sayısının (C) 'aylık izleme. Morfolojik aktive hücre yoğunluğu daha dinamik varyasyon ile toplam ve aktif hücre yoğunluğu paralel ama nicelik farklı değişiklikler vardır. Ölçek çubuğu 250 mikron (A) temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nörodejeneratif bir hastalık sırasında mikrogliyal hücre sayısı ve morfolojik aktivasyon canlı izleme hücre özelliklerinin ayrıntılı görselleştirme izin non-invaziv görüntüleme yöntemlerinin kullanılmasını gerektirir. Görüntüleme sonra, mikroglial hücreler Mikroglia aktivitesi için çıktılan olarak lizozomal boyutu ve / veya işlem karmaşıklığını değerlendirmek için çok sayıda eşik adımlarının kullanımı ile morfometrik analiz için (bölünmüş) izole edilmelidir. Bu protokol, biz cSLO kullanılarak canlı görüntü elde etme ve ardışık hücre ve soma segmentasyonu dayalı mikrogliyal aktivasyon kantitatif analiz yöntemleri açıklanmaktadır. Biz retinanın kronik nörodejeneratif hastalık bağlamında 2 ay boyunca retina Mikroglia aktivitesi ve mikrogliyozu da kinetik değerlendirme için aşağıdaki strateji uygulanır.

Raportör fare ve mikroglia / periferal monositler hücre tipleri

fractalkine reseptörünün kontrolü altında GFP ifade farelerin kullanılması (CX3CR1)lokusu 46 ikamet mikroglia güvenilir belirlenmesini sağlar ve sağlam GFP in vivo görselleştirme 30-32,34,36 dikkate değer verir. Burada, biz DBA / 2J genetik arka plan 59 içine C57BL / 6.129P- Cx3cr1 tm1Litt / J fareleri 46 geri çaprazlanması ile elde edilen DBA / 2J farelerin bir alt türünün, kullanın. Hastalık ya da yaralanma sırasında MSS istila edebilir Çevresel monositler ve makrofajlar, aynı zamanda GFP etiketi 15,46,47 ifade eder.

Nörodejeneratif retinada mikrogliya Canlı görüntüleme çalışmaları

CSLO kullanarak CX3CR1-GFP / + retina hücrelerinin Bizim in vivo izleme kadar 10 hafta 30-32,34,48 akut yaralanma sonrası retina GFP + hücre sayılarında değişiklik izlenen önceki çalışmalara dayanmaktadır. Burada, biz CX3CR1-GFP / + mikroglia / kronik glokomun erken ilerlemesi sırasında retinanın aylık cSLO görüntülemesi ile hücresel çözünürlük ile periferik monositleri görselleştirmek. Birdditionally, biz algılamak ve hücre yeniden boyutlandırma ölçmek için canlı görüntü otomatik eşik tabanlı analiz kullanımı ve bireysel gözlerinde ve bireyler arasında aktif ve toplam mikroglia sayılarındaki değişiklikleri izlemek için yeterli uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip biçimlenme.

Retinada GFP + mikrogliya cSLO görüntüleme teknik sınırlamalar

Tek oturumda elde edilen çok xy noktası görüntüleri (Şekil 5) karşı tek bir karşılaştırma gösterildiği gibi, görüntüleme kalitesi tutarlı ve tekrarlanabilir bulundu. Ancak, tutarlı ve tekrarlanabilir GFP + hücre görüntüleme edinimi, tek bir oturumda ve zamanla, eleştirel fundus ve floresan cSLO görüntüleme için kararlı parametrelerin seçimine bağlıdır olduğunu. CSLO amaca göz ve optik disk Hizalama doyma seviyelerinin tekdüzelik ve ilgi 49 konfokal düzlemde odağı belirler. Hatalı ve / veya düzgün olmayan bir SPECIFICATIdoygunluk düzeyleri üzerine GFP tespiti, otofloresan arka plan, hücre ve çardak çözünürlükte artefakt varyasyonlar oluşturabilirsiniz. Doğru sinir lifi ve ganglion hücre katmanları lokalize mikrogliya odaklanmak için, uyum ve retinal kan damarları ve IR fundus görüntüleme ile vitreus yüzeyinde aksonal demetleri odaklanmak önemlidir. Bu FA tarafından GFP + hücreleri bulmak için bir referans düzlemi sağlar. FA IR geçiş için gerekli gerekli refocusing her deneysel oturumda biraz farklı derinliklerde (55-60 D) birden fazla FA görüntüleri edinimi rehberlik edilebilir. Bu nedeniyle de yaş, öğrenci dilatasyon ve patoloji (optik disk kazı) anatomik farklar telafi yardımcı olabilir. Görüntü çözünürlüğü ve hücre detay fundus boyunca doygunluk düzeyleri optimal şartname ve kameraya 49 göz göreceli dikkatli uyum bağlı olduğu için, görüntü dizileri c fundus IR görüntüleri göstermek gerekir, aynı göz için zamanla edinilenonsistent ve karşılaştırılabilir odak, aydınlatma, çözünürlük ve retina alan yayılma. Tek oturumda (1.5-1.7 mm retina 2, n = 13 retinalar, yaşlı 3-5 ay) edinilen görüntülerde toplam GFP + hücre sayılarının Manuel sayıları sellülarite (% 3-4 varyasyon tutarlı ve tekrarlanabilir kantifikasyon doğruladı; veri yok gösterilir). Görüntüleri eşik benzer bir yoğunluk aralığına dayalı analizler ve zamanla değişiklikler karşılaştırılması yoluyla GFP + hücre segmentasyonu için mükellef olabilmesi için bu gereklidir.

Eşik ve morfometrik canlı cSLO görüntülerde retina mikrogliya analizleri

Sadece son zamanlarda, iki foton konfokal mikroskobu ile yüksek hücresel çözünürlükte beyin mikroglia in vivo görselleştirme mikrogliyal soma ve proses parametrelerinin kantitatif analiz ve morfolojik aktif mikroglia 9,50 ayrımcılık sağladı. Bu yazarlar tarafından gösterildiği gibi, lizozomal boyutu en göze çarpan morfolojik olduğunuiteratif yoğunluk tabanlı eşikleme kullanarak beyin mikroglia, canlı iki foton konfokal görüntüleme ile zamanla saptanabilir parametre sinyal-gürültü varyasyonları 9 azaltmak için. Ayrıca, lizozomal boyutu değişir aktive hücrelerde 9 Iba1 ifade upregülasyonu ile ilişkilidir. Burada, biz retinaya lokalize CX3CR1-GFP + hücreler cSLO canlı görüntüleri kullanmak ve toplam sayıları ölçmek için morfometrik analizi ile takip mikroglial hücreleri ve somata, karşılaştırılabilir sıralı segmentasyon uygulamak ve aktif.

Biz merkezi retinada bölüm GFP + hücreler için özel konfokal oluşturma yazılımı (FluoRender) kullanın. Bu görüntüler daha nihai olarak otomatik bir segmentasyon ve lizozomal alanının eşik tabanlı miktarını belirlemek için, bir ticari olarak temin edilebilir konfokal görüntü analiz paketi kullanılarak eşiklenir edilir. Bizim canlı görüntü canlı görüntü analizi 9 mikrogliyal aktivasyonunun bir morfolojik ölçüt olarak soma boyutu kullanımını teyit analizleri. SomalDaha önce ex vivo görüntü analizi 50 tarafından gösterildiği gibi eşik-tabanlı sayıları, desen ve retina mikrogliyozu artışların karakterizasyonu izin verdi. Biz cSLO hücreleri aynı konfokal düzlemde görüntülü olabilir fare merkezi retina (<2 mm 2), içinde en iyi çözünürlük ve detay ile GFP + mikroglia tespit bulabilirsiniz. Retina çevreye doğru, floresan sinyal değişkenliğini ve düz merkezi retina tespit GFP + hücreler gibi aynı görüntüleme işleme ve eşik analizi önlemek bozulmaları göstermektedir. Son olarak, iletişim kuralı, retina mikroglia cSLO in vivo görüntü analizi, nispeten yüksek bir verim sağladığını göstermektedir. görsel izole ve merkezi retina içinde sayısal olabilir parankimal mikrogliyal sayısı 200-300 ~ arasındaki toplam hücreleri ve ~ 10-180 aktif hücreleri değişiyordu. Böylece, fare retina mikroglia d in vivo kendi dönüşümü ve rollerini incelemek için optimal nüfus sunuyorNörodejenerasyonun patogenezini uring.

Diğer merkezi sinir sistemi kronik hastalıklara Uygulaması

Burada tarif edilen in vivo görüntü analiz yöntemleri diğer fare retinal hastalıklar ve yaralanma modellerinde, akut ya da kronik mikroglial değişiklikleri değerlendirmek için geçerli olmalıdır. Bundan başka, bu protokol, retina ve optik sinir bu hastalıkların 51-56 nörodejenerasyonun hedef göz önüne alındığında, Alzheimer, Parkinson ve multipl skleroz gibi kronik CNS patolojiler, elde edilen retina mikroglia / periferal monosit değişiklikleri değerlendirmek için hizmet edebilir. Bu doğrultuda, erken Alzheimer hastalığı yönetimi retina ve OSB patoloji canlı tespiti kullanımı yoğun çalışma 54,57,58 altındadır.

Sonuç olarak, bulgularımız, canlı, boyuna izleme ve retina mikroglia numaraları ve morfolojik aktivasyon değişikliklerin ölçümü, güvenilir KD hizmet olabileceğini düşündürmektedirbiyolojik uroimaging hastalığın başlamasını ve erken ilerlemesini tespit etmek. Bunlar in vivo görüntüleme ve analiz metodolojisi retina ve optik sinir darbe diğer nörodejeneratif hastalıklar potansiyel yaşa bağlı glokom için geçerlidir ve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME 000671 and 00582 Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift.
30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe BD, East Rutherford, NJ 305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T48402, 152463 and P4417 Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump Gaymar Industries, Orchard Park, NY TP-650
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 23-400-100
Tropicamide 1% Bausch & Lomb, Rochester, NY NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK G003709 Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA Version 1.7.1.0
PowerPoint Microsoft, Redmond, WA Version 14.4.3
Adobe Photoshop Adobe, San Jose, CA Version CS3
FluoRender Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah Version 2.13 Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C Nikon, Melville, NY Version 4.30.01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
  2. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
  7. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57 (6), 563-581 (1999).
  8. Jonas, R. A., et al. The spider effect: morphological and orienting classification of microglia in response to stimuli in vivo. PloS One. 7 (2), e30763 (2012).
  9. Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PloS One. 7 (2), 1-9 (2012).
  10. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  11. Elmore, M. R., et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).
  12. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  13. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  14. Solomon, J. N., et al. Origin and distribution of bone marrow-derived cells in the central nervous system in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 53, 744-753 (2006).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat. Neurosc. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  16. Sapp, E., et al. Early and progressive accumulation of reactive microglia in the Huntington disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60 (2), 161-172 (2001).
  17. Maeda, J., et al. In vivo positron emission tomographic imaging of glial responses to amyloid-beta and tau pathologies in mouse models of Alzheimer's disease and related disorders. J. Neurosc. 31 (12), 4720-4730 (2011).
  18. Jacobs, A. H., Tavitian, B. Noninvasive molecular imaging of neuroinflammation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1393-1415 (2012).
  19. Ouchi, Y., et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease. Ann. Neurol. 57 (2), 168-175 (2005).
  20. Fuhrmann, M., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
  21. Trapani, A., Palazzo, C., de Candia, M., Lasorsa, F. M., Trapani, G. Targeting of the translocator protein 18 kDa (TSPO): a valuable approach for nuclear and optical imaging of activated microglia. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1415-1428 (2013).
  22. Venneti, S., Lopresti, B. J., Wiley, C. A. Molecular imaging of microglia/macrophages in the brain. Glia. 61 (1), 10-23 (2013).
  23. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat. Comm. 3 (1227), 1-15 (2012).
  24. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), e17910 (2011).
  25. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp. Neurol. 254 (214), 109-120 (2014).
  26. Nayak, D., Zinselmeyer, B. H., Corps, K. N., McGavern, D. B. In vivo dynamics of innate immune sentinels in the CNS. Intravital. 1 (2), 95-106 (2012).
  27. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), 1-16 (2010).
  28. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. J. Neurosci. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  29. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J. Vis. Exp. 19 (43), (2010).
  30. Alt, C., Runnels, J. M., L, T. G. S., P, L. C. In vivo tracking of hematopoietic cells in the retina of chimeric mice with a scanning laser ophthalmoscope. Intravital. 1 (2), 132-140 (2012).
  31. Eter, N., et al. In vivo visualization of dendritic cells, macrophages, and microglial cells responding to laser-induced damage in the fundus of the eye. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (8), 3649-3658 (2008).
  32. Liu, S., et al. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage. Investigative ophthalmology & visual science. 53, 6254-6262 (2012).
  33. Maeda, A., et al. Two-photon microscopy reveals early rod photoreceptor cell damage in light-exposed mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (14), E1428-E1437 (2014).
  34. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  35. Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45 (28), 3512-3519 (2005).
  36. Alt, C., Runnels, J. M., Mortensen, L. J., Zaher, W., Lin, C. P. In vivo imaging of microglia turnover in the mouse retina after ionizing radiation and dexamethasone treatment. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 55 (8), 5314-5319 (2014).
  37. Bosco, A., et al. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (4), 1437-1446 (2008).
  38. Anderson, M. G., et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30 (1), 81-85 (2002).
  39. Chang, B., et al. Interacting loci cause severe iris atrophy and glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 21 (4), 405-409 (1999).
  40. Smith, R. S., Korb, D., John, S. W. A goniolens for clinical monitoring of the mouse iridocorneal angle and optic nerve. Mol. Vis. 8, 26-31 (2002).
  41. Buckingham, B. P., et al. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28 (11), 2735-2744 (2008).
  42. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  43. Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 171 (2), 313-325 (2005).
  44. Soto, I., et al. Retinal ganglion cells downregulate gene expression and lose their axons within the optic nerve head in a mouse glaucoma model. J. Neurosci. 28 (2), 548-561 (2008).
  45. Bosco, A., Steele, M. R., Vetter, M. L. Early microglia activation in a mouse model of chronic glaucoma. J. Comp. Neurol. 519 (4), 599-620 (2011).
  46. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  47. Broux, B., et al. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J. Autoimmun. 38 (1), 10-19 (2012).
  48. Paques, M., et al. In vivo observation of the locomotion of microglial cells in the retina. Glia. 58 (14), 1663-1668 (2010).
  49. Charbel Issa, P., et al. Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 53 (2), 1066-1075 (2012).
  50. Beynon, S. B., Walker, F. R. Microglial activation in the injured and healthy brain: what are we really talking about? Practical and theoretical issues associated with the measurement of changes in microglial morphology. Neuroscience. 225 (2012), 162-171 (2012).
  51. Chan, J. W. Recent advances in optic neuritis related to multiple sclerosis. Acta Ophthalmol. 90 (3), 203-209 (2012).
  52. Frost, S., Martins, R. N., Kanagasingam, Y. Ocular biomarkers for early detection of Alzheimer's disease. J. Alzheimer's Dis. 22 (1), 1-16 (2010).
  53. Guo, L., Duggan, J., Cordeiro, M. F. Alzheimer's disease and retinal neurodegeneration. Curr. Alzheimer Res. 7 (1), 3-14 (2010).
  54. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 83 (9), 917-922 (2012).
  55. Kersten, H. M., Roxburgh, R. H., Danesh-Meyer, H. V. Ophthalmic manifestations of inherited neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 10 (6), 349-362 (2014).
  56. Kesler, A., Vakhapova, V., Korczyn, A. D., Naftaliev, E., Neudorfer, M. Retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 113 (7), 523-526 (2011).
  57. Petzold, A., et al. Optical coherence tomography in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 9 (9), 921-932 (2010).
  58. Satue, M., et al. Retinal thinning and correlation with functional disability in patients with Parkinson's disease. Br. J. Ophthalmol. 98 (3), 350-355 (2014).
  59. Bosco, A., Romero, C. O., Breen, K. T., Chagovetz, A. A., Steele, M. R., Ambati, B. K., Vetter, M. L. Neurodegeneration severity can be predicted from early microglia alterations monitored in vivo in a mouse model of chronic glaucoma. Dis Model Mech. , (2015).

Tags

Tıp Sayı 99 Nörobilim mikrogliya nörodejenerasyon glokom retina optik sinir başı konfokal tarayıcı laser oftalmoskopi canlı görüntü analizi eşikleme ile segmentasyonu hücre morfometri CX3CR1 DBA / 2J
Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu <em>Vivo Dynamics</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. … More

Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (99), e52731, doi:10.3791/52731 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter