Summary
Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose sind zentrale Antworten auf chronische Neurodegeneration. Hier stellen wir Verfahren zur in-vivo-Langzeit-Visualisierung der Netzhaut CX3CR1-GFP + Mikroglia-Zellen durch konfokale Ophthalmoskopie und zum Schwellenwert und morphometrische Analysen zur Identifizierung und Quantifizierung von deren Aktivierung. Wir überwachen Mikroglia Veränderungen während der frühen Stadien der altersbedingten Glaukom.
Abstract
Mikroglia, die CNS-Resident neuroimmune Zellen sind, verwandeln ihre Morphologie und Größe in Reaktion auf ZNS-Schäden, die Umstellung auf einen aktivierten Zustand mit unterschiedlichen Funktionen und Genexpressionsprofilen. Die Rolle der Mikroglia-Aktivierung in den Bereichen Gesundheit, Verletzungen und Krankheiten bleiben unvollständig aufgrund ihrer dynamischen und komplexen Regulation in Reaktion auf Veränderungen in ihrer Mikroumgebung zu verstehen. Daher ist es entscheidend, nicht invasiv überwachen und Änderungen Mikroglia-Aktivierung über die Zeit im intakten Organismus zu untersuchen. In-vivo-Studien der Mikroglia-Aktivierung durch technische Einschränkungen, um Tracking-Mikroverhalten, ohne die Umwelt CNS verzögert. Dies hat eine besondere Herausforderung gewesen, während der chronischen Neurodegeneration, in denen langfristige Veränderungen müssen verfolgt werden. Die Netzhaut, ein CNS Orgel zu nicht-invasiven Live-Bildgebung zugänglich und bietet ein leistungsfähiges System zur Visualisierung und Charakterisierung der Dynamik der Mikroglia-Aktivierung bei chronischen Erkrankungen.
in vivo-Abbildung von Netzhaut Mikroglia, mittels konfokaler Ophthalmoskopie (cSLO) und CX3CR1 GFP / + Reporter Mäusen zu Mikroglia mit zellulärer Auflösung sichtbar zu machen. Außerdem beschreiben wir Methoden, um monatlich Änderungen der Zellaktivierung und Dichte in großen Zell-Untergruppen (200-300 Zellen pro Retina) zu quantifizieren. Wir bestätigen den Einsatz von Somal Bereich als nützliches Maß für Live-Tracking von Mikroglia-Aktivierung in der Netzhaut durch die Anwendung automatisierter Schwelle basierte morphometrische Analyse von in vivo Bilder. Wir nutzen diese Live-Bildaufnahme und analysiert Strategien, um die dynamischen Veränderungen in Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose während frühen Stadien der Netzhautdegeneration in einem Mausmodell für chronische Glaukom zu überwachen. Dieser Ansatz sollte sinnvoll, die Beiträge der Mikroglia zu neuronalen und axonalen Rückgang der chronischen ZNS-Störungen, die die Netzhaut und Sehnerv beeinträchtigen untersuchen.
Introduction
Mikroglia Neuroimmun-Zellen, die ausschließlich in dem Zentralnervensystem (ZNS) gespeichert sein, da die frühe embryonale Entwicklung und im Erwachsenenalter. Ausgestattet mit einem komplexen Repertoire von Rezeptoren sind Mikroglia-Aktivität und regionale Heterogenität ihrer bidirektionalen Wechselspiel mit dem benachbarten Neuronen, Glia, Bluthirnschranke und Infiltrieren neuroinflammatory Zellen 1,2 geregelt. Basal Mikroglia-Funktionen tragen zur physiologischen Wartung und Reparatur, da sie probieren ihr Gebiet für Störungen in Homöostase 3,4. Während CNS Verletzungen oder Erkrankungen, sind Mikroglia die Ersthelfer zu neuronalen Signale, die dann ausgelöst werden den Übergang zu einer reaktiven Phänotyp, als "aktivierte Mikroglia 2,5-7. Mikroglia-Aktivierung beinhaltet einen komplizierten Zyklus von Gen- und Proteinexpression, die Zelle soma und Prozessgrößenänderung und Umbau 6-9 gekoppelt sind. Mikroglia-Aktivierung sowie Zellverteilung undClustering kann die lokale Erhöhung der gesamten Anzahl der Zellen (bezeichnet als Mikrogliose) begleitet werden. Dies kann von Zellproliferation und Selbsterneuerung, mit oder ohne Einstellung von Blut abgeleiteten Monozyten 3,4,7,10-14 führen. In einer breiten Palette von altersabhängig, chronische Erkrankungen des ZNS, anhalt Mikrogliose und Mikroglia-Aktivierung parallel zur Krankheitsprogression 15-19. Wie Mikroglia Auswirkungen Neurodegeneration, bleibt unklar, vor allem weil sie sowohl neuroprotektive und schädlichen Rollen, die vielfältigen Beiträge zur Krankheitsbeginn und Verlauf haben können, zu spielen. Live-Imaging-Studien zu verstehen, chronische ZNS-Erkrankung ausgerichtet haben Mikroglia-Verhalten in der geschädigten ZNS von Tiermodellen und Menschen überwacht und nachgewiesen, dass Mikroglia Veränderungen nachweisbar sind zu Beginn in einem frühen Krankheitsstadien 15-17,19,20. Daher ist es entscheidend, Ansätze zu erkennen und zu überwachen Mikroglia-Aktivierung in vivo zu entwickeln.
Nicht-invasive detection regionaler Veränderungen in der Hirn Mikroglia-Aktivierung wurde als ein wichtiger Indikator für die in vivo neurodegenerative Krankheitsprogression festgelegt, mit der molekularen Bildgebung oder Biolumineszenz und Positronenemissionstomographie oder Magnetresonanztomographie 18,21,22. Diese hoch quantitative und nicht-invasive molekulare und nukleare bildgebende Verfahren zu erkennen Gliose mit regionalen Auflösung. Alternativ hat Zwei-Photonen-konfokale Bildgebung in CX3CR1 GFP / + Mäusen, die Beobachtung der Gehirn Mikroglia mit zellulärer Auflösung 3,4,9,20,23-28 erlaubt. , Begrenzt jedoch dieser Ansatz langfristige und wiederholte Beobachtung von chronischen Mikro Änderungen angesichts der potenziellen Gefahr von ihr Verhalten sogar minimal-invasiven bildgebenden Verfahren 29 zu stören. Alternativ kann die Netzhaut bietet optimale Voraussetzungen für direkte, in vivo Visualisierung und wiederholte Überwachung von Mikroglia in ihrer intakten ZNS Nische ganz Alterung, nach einer akuten Verletzung, undmöglicherweise bei chronischen neurodegenerativen Erkrankungen. So haben neuere Studien die Machbarkeit der hochauflösenden Abbildung von Netzhaut Mikroglia, die GFP durch Anpassung der konfokalen Scanning Laser Ophthalmoskopie (cSLO) an image Live CX3CR1 GFP / + Mäusen nachgewiesen. Dies wurde verwendet, um Veränderungen in wöchentlichen GFP + Zellzahlen in einzelnen Mäusen für bis zu 10 Wochen Spurfolge akut induzierten Verletzung oder Augenhypertension 30-36.
Wir haben diesen Ansatz erweitert, um langfristige Bildgebung über mehrere Monate durchzuführen, und quantitativ Veränderungen in Mikroglia-Aktivierung auf Basis von soma Größe unter Verwendung morphometrische Analyse verfolgen. Somal Größe wurde als nützliche Metrik der Mikroglia-Aktivierung in Live-Imaging-Studien unter Verwendung von Zwei-Photonen-konfokale Mikroskopie in Rindenscheiben in vivo Bildgebung von CX3CR1-GFP + Mikroglia 9 durchführen definiert. Diese und andere Studien zeigten auch die Korrelation zwischen Somal Größe und die Höhe der Iba1 Proteinexpression, which auch steigt mit Aktivierungs 9,37. Somit können aktivierte Mikroglia im lebenden Mäusen identifiziert werden, und deren Anzahl und Verteilung über die Zeit überwacht während CNS Gesundheit und Krankheit.
Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur cSLO Livebildaufnahme und Analyse auf Mikroglia-Zellzahlen, die Verteilung und morphologischen Aktivierung während der retinalen Ganglienzellen (RGC) Degeneration (Figur 1) zu überwachen. Somit verwendet diese Studie: 1) ein Mausmodell der geerbten Glaukom (DBA / 2J), die altersabhängige Sehnerv und Netzhautdegeneration und erfährt zeigt bemerkenswerte Variabilität in den Krankheitsverlauf zwischen 5 und 10 Monaten 38,39, 2) monatlich cSLO in vivo-Bildgebung für die Langzeit Visualisierung von GFP + -Zellen in der Netzhaut und des Sehnervs unmyelinated heterozygoter CX3CR1 GFP / + DBA / 2J-Mäusen im Alter von 3-5 Monaten, 3) Live-Bildanalyse durch Segmentierung und Schwellwertbildung, um die Zell somata und messen zu isolieren dieIR-Bereich. Diese Strategien angewendet werden, um die Kinetik der retinalen Mikrogliaaktivierung Zustände während der frühen Stadien der chronischen Glaukoms beurteilen.
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Protocol
In vivo wird in pathogenfreien Einrichtungen unter Verwendung von Protokollen von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Utah bestätigt Bildgebung durchgeführt.
ANMERKUNG: Diese Bildgebungsprotokoll für Reportermäusen, bei denen retinale Mikroglia und infiltrierenden Monozyten / Makrophagen exprimieren grün fluoreszierenden Protein (GFP) unter der Kontrolle des Fractalkin Rezeptor Locus (CX3CR1) verwendet.
1. In Vivo Imaging von Retinal GFP + Mikroglia durch konfokale Scanning Laser Ophthalmoskopie (cSLO)
- Schalten Sie den Wassergesteuerten Heizsystem, eingestellt, während Verfahren stabilisieren Maus Temperatur zwischen 35-37 ° C, und verbinden zwei Heizkissen.
- Starten des konfokalen Laser-Scanning-Ophthalmoskop (cSLO) System (2A). Öffnen Sie die cSLO Programm, geben Sie die Informationen, die die einzelnen Maus identifizieren und legen Sie einen Hornhautkrümmung von 2 mm (Patientendaten-Menü).
- Bereiten Sie sich auf imaging. Sicher passen einen sauberen 55º Weitfeld-Objektivlinse auf dem Sockel. Bereiten Sie den Augenspiegel Imaging-Plattform durch die Sicherung ein Heizkissen mit sauberem Papier bedeckt. Verwenden Sie Clips, um das Kissen und Papier glätten und sie davon abzuhalten, Blockieren der Bewegung der Objektivlinse.
- Betäuben die Maus durch intraperitoneale Injektion von 1,3% 2,2,2-Tribromethanol und 0,8% tert.-Amylalkohol (250 mg / kg Körpergewicht; 0,5 ml / 25 g Körpergewicht) mit Hilfe eines 30½ G-Nadel in eine 1-ml-Einweg ausgestattet Spritze. Rückgabe Maus in seinen Käfig, hielt über einem Heizkissen.
HINWEIS: Die Lieferung der Betäubung durch Injektion gegen Einatmen erleichtert das Positionieren der Maus für die Bildgebung und ungehinderten Zugang zu den Augen, frei von Nasenkegel und Schläuche. - Sobald das Tier nicht mehr bewegt und ist nicht mehr auf Schwanz kneifen, induziert Pupillenerweiterung mit Tropicamide und Phenylephrin (jeweils 0,5%), indem Sie den Tieranfällig und für beide Augen mit den Tropfen für 7 min.
- Nach 5 min pschnüren Sie die Maus anfällig auf die Mitte des Augenspiegels Plattform und fit Kontaktlinsen über den Augen, die Anwendung minimalem Druck.
HINWEIS: Kontaktlinsen sind klein und zerbrechlich, aber kann man vorsichtig mit den Fingern gehandhabt werden, obwohl Pinzette kann stattdessen 40 verwendet werden. Die Verwendung von Kontaktlinsen ist optional, aber empfohlen, da es minimiert Augentrockenheit und bewahrt Hornhauttransparenz während der Bildgebung. - Nach 7 min, richten die Maus mit dem rechten Auge gegenüber der Objektivlinse und der Bahn parallel zu der Objektivlinse, wobei das Tier in der Nähe der Kante der Plattform (2B) ungehemmt. Um Bilder vergleichbarer Sättigung und Orientierung zu sammeln, konstant zu halten den Abstand vom Auge zum Objektivlinse sowie die Ausrichtung des Auges zu dem Lichtweg gesamten Imaging-Sitzungen. Clip lange Schnurrhaare stören Beobachtung des Auges.
HINWEIS: Für die nächsten 8-10 min, wird die Maus nicht bewegen oder blinken, und wird Luft unter leichtem Zuggen, die von der cSLO Eye Tracking ART (automatische Echtzeit) Modus, der den Scan-Kopf-Platzierung gemäß Fundus Sehenswürdigkeiten mit hohem Kontrast passt verfolgt werden. Vergangenheit dieser Zeit Mäusen beginnen keuchend und blinkt, so dass Abbildungs unpraktisch. - Wenn Bildgebung wird ohne Verwendung von Kontaktlinsen durchgeführt wird, gelten PBS Tropfen in beide Augen alle 2-3 min, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern.
- Sammeln Sie ein Fundusbild des retinalen Gefäßsystems und Papille, das sich auf die inneren Netzhaut.
- Wählen Sie den Infrarot-Modus (IR) und passen Sie die Einstellungen bis 820 nm Anregung, 100% Laserleistung, 40-60% Sensitivität (2C).
- Arbeiten im Hochgeschwindigkeitsmodus (12,6 Bilder / s), suchen Sie das Auge mit dem Joystick, um den Augenspiegel fahren. Bei geringer Vergrößerung, überprüfen Sie die Hornhaut und Linse für Verletzungen oder Deckkraft, und verstehen sich inklusive der Studie Augen mit Defekten oder Verletzungen, die beeinflussen, die Abbildung der Netzhaut (3A).
- Suchen Sie den Papillenfläche (die Oberflächeder Sehnervenkopf, ONH), indem das Ziel näher zum Auge, dann die Bildmitte auf sie und sperren Sie diese Position durch Schrauben Sie den Joystick. Diese Ausrichtung des Auges auf dem Augen ist der Schlüssel zu erhalten, selbst konzentrieren und Emission über das Bild.
- Visualisieren Sie die inneren Ebenen der Netzhaut sowie der ONH, unter Verwendung der großen Blutgefäße auf der Glaskörper Oberfläche der Netzhaut als Referenzbrennebene (59 und 60 D) oder tiefer (55 D) liegt in den Augen, die ausgegraben Optik Discs. Die optimale Schwerpunkt sollte lösen zirkulierenden Blutzellen in großen Blutgefäßen, mit ihrem Lumen und Wände deutlich verschieden.
- Optimieren Sie die Bildsättigung durch Anpassung der Regler an der Touchscreen-Bedienfeld, bis ein weißes Halo der gleichmäßigen Ausleuchtung reicht in den meisten der 55º Fundus Feld um die Papille (mit leichten Überbelichtung). Next, senken Sie die Sättigung, um den Kontrast zu optimieren, bis Blutzellen, die sich entlang der großen Gefäße eindeutig geklärt werden. Wenn SchwerdunkelBereiche bestehen bleiben, nicht wegen Netzhautschäden, richten Sie den Blick auf die Kamera, bis ein gleichmäßig helles Bild erhalten wird. Diese Anpassung ist von grundlegender Bedeutung, um reproduzierbare Sätze von Bildern in Lage und Qualität zu erfassen.
- Sammeln eines hochauflösenden Infrarotbild der zentralen Netzhaut (1,4-1,7 mm im Durchmesser, in Abhängigkeit von Alter), im Durchschnitt von 30 Bildern in Echtzeit (4,7 B / s; normalisiert), um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern (2D ).
- Sofort erwerben ein Fluoreszenzbild von GFP + Mikroglia und / oder der Infiltrations Monozyten an der inneren Ebene der Netzhaut und dem Sehnervenkopf lokalisiert.
HINWEIS: Die Optimierung des IR Fundusbild der Netzhaut bestimmt die Auflösung der Fluoreszenzbild von GFP + Zellen sowie das Ausmaß der inneren Netzhaut überspannt. Die Nichtbeachtung der inneren Ebenen der Netzhaut, die durch schlechte Auflösung des Gefäßsystems detektiert werden kann konzentrieren, werden in gedimmten GFP + Zellen Blick (3B) zur Folge haben. Nicht IR satu einstellenration ordnungsgemäß und einheitlich wirkt sich auf die Fluoreszenzbild (FA), die Einführung artifactual Variationen in GFP + Zellen Intensität und Größe (3C).- Swich auf Bildgebungsmodus (FA) in der Touchscreen-Panel Fluoreszenz, mit blau, 488 nm Laseranregung (460 bis 490 nm-Sperrfilter-Set) und Übernahme-Einstellungen (100% Laserleistung und 100-125% Sensitivität), die gehalten werden, konstant für alle Mäuse (2E).
- Sammeln Sie ein einzelnes xy-Punkt zweidimensionalen Fluoreszenzbild der Netzhaut und ein Fundusbild sofort erfassen zu identischen Position (100x Scandurchschnitt; 55º Scanwinkel für beide Bilder, 2F).
- Nehmen Sie ein Multibild durch Auswahl von "Verbundwerkstoff" in der Systemsteuerung (2G) und Bewegen der Augenspiegel rechts und links, Schwenken der Netzhaut über den Nasen-Zeitachse (Abbildung 2 H).
HINWEIS: Nach dem Scannen eines einzelnen Bildes xy-Punkt (100x skann Durchschnitt), die Software automatisch Durchschnittswerte neue Scans der gleichen und neue Bereiche (mit einem grünen Kreis umschrieben während optimale Scan oder rot, wenn der Scan nicht durchführbar ist) und Stiche alle xy-Positionen in Echtzeit. Das resultierende zusammengesetzte Bild umfasst 1,5-1,7 mm auf der horizontalen Achse x 3-4 mm in der vertikalen Achse (55º x 120-124º Scanwinkel).
- Vollständige Abbildung von jeder Maus innerhalb von 15 Minuten nach Narkoseeinleitung, vor Blinken und Bewegung neu gestartet.
- Kontaktlinsen entfernen, Hydrat Augen mit PBS und zurück das Tier in das erwärmte Käfig, Kontrolle Verhalten bis zur vollständigen Wiederherstellung der Beweglichkeit.
- Für Langzeitstudien mit intermittierender cSLO-Imaging-Sitzungen in der gleichen einzelnen Maus, wiederholen Imaging nicht weniger als 3 Tage auseinander, um die kumulative Toxizität der Anästhesie sowie Hornhautreizungen zu vermeiden.
2. Live-Bildverarbeitung und -analyse
- Sequential Bildausrichtung:
- Ausrichtendie Fundusbilder für eine Zeitreihe von dem gleichen Auge mit dem Gefäßsystem und Sehnervenkopf als Wahrzeichen. Öffnen Sie alle Bilder in einem kommerziellen Diashow integriert Programm, indem jedes Bild über die vorhergehende, bis ihre Papillen ausrichten auf der xy-Ebene (die obere Bild erscheint semi-transparent, während sie gezogen), und drehen Sie das obere Bild, bis sein Hauptblutgefäße überschneiden sich mit dem Gefäßsystem an das Bild unten (Fokus auf Schiffen am weitesten von der Papille). Nehmen Sie den Drehwinkel für jedes Bild, und speichern Sie diese Zeitreihe für die Zukunft, die Verfolgung der Maus und Augen Identität.
- Ausrichten der entsprechenden Reihe von einzelnen xy-Punkt-Fluoreszenzbilder durch Anwenden der aufgezeichneten Winkel zur XY Drehung zu jedem Zeitpunkt zu korrigieren, unter Verwendung eines Rastergrafikeditorprogramm. Darüber hinaus passen Auflösung auf 300 dpi (ohne Skalierung) und Hintergrund (im RGB-Modus, wählen Sie Levels und probieren Sie die Lumen eines Blutgefäßes als schwarz). Speichern Sie diese Bilderals TIF-Dateien, Hinzufügen "ausgerichtet", ihren Namen.
- Mikrogliazellen Segmentierung:
- Um GFP + Zellen zu identifizieren in der zentralen Netzhaut, in FluoRender öffnen Sie die "ausgerichtet" TIF-Datei, die der frühesten Zeitpunkt / age. Vergrößern Sie das Bild auf den Bildschirm passen, dann definieren Sie die Render-Ansicht (Composite, orthogonale, interpoliert) und seine Eigenschaften (0,58 Gamma, Sättigung 255, 255 Leuchtdichte, 195 Alpha und 1.00 Shading), die Auswahl sowohl die RG-Kanäle sichtbar (ausblenden B-Kanal durch einen Doppelklick auf das im Arbeitsbereich-Rahmen; 4A).
- Um einzelne Zellen, Schwellen den roten Kanal wählen (müssen auf dem Arbeitsbereich Rahmen markiert), durch die Erhöhung der niedrigen Schwelle, bis die Mehrzahl der Zellen maskiert (weiß) mit Mindestüberlappung und Zellprozesse (cyan), während die hohe Schwelle konstant (255). Der niedrige Schwellwert variiert zwischen 100 und 170, abhängig von der Fluoreszenzintensität (4B </ Strong>).
- Speichern Sie diese Ansicht mit den roten Kanal sichtbar (Capture-Befehl) als neue TIF-Datei, Hinzufügen "cellsegm" in seinen ursprünglichen Namen (4C). Mit einem generischen Rastergrafik-Editor-Software, invertieren ihre Graustufen und passen Auflösung auf 300 dpi, wie oben, und wieder speichern als RGB (4D).
Hinweis: Der Ordner (Projekte) automatisch von FluoRender erstellt Löschen, und speichern Sie die Anwendung Schwelle für die Zukunft.
- Mikroglia soma Segmentierung und Morphometrie:
- Um GFP + Zellen somata für Bereich Quantifizierung zu identifizieren, verwenden Sie Bildanalyse-Software mit automatischer Intensitätsmessungen und Schwellen Fähigkeiten sowie Schwellenbasierten Objektzählung und Messung. Öffnen Sie die "cellsegm" TIF-Datei, und wählen Sie die Skalierung Verfahren (Spline) und den roten Kanal (klicken Sie auf Registerkarte rot in RGB). Verbessern Sie die Visualisierung durch Abwahl "view-Kanal in der Farbe" (Rechtsklick auf das rote RGB tab), und wählen Sie "ergänzen Farben" (Bild / Anpassen Image), um die Graustufen umzukehren und sich die Zellen in grau / schwarz auf weißem Hintergrund (4E).
- Kalibrieren Sie das Bild, um 1,4 bis 1,7 mm, je nach Alter, durch Ziehen einer horizontalen Linie über das gesamte Bild (Kalibrierung, Schnellkalibrierung).
- Segment Einzelzelle somata indem Intensitätsschwellenwertbildung (4B). Dazu Arbeit auf dem roten RGB-Kanal und öffnen Sie die Schwellenintensität Funktion (Object Count; Auswählen "count Update" -Befehl), um zweidimensionale Parameter für jeden Schwellenwert Region of Interest (ROI) zu verfolgen, die einzelne somata.
- Definieren die Intensitätsschwelle in dem Intensitätshistogramm durch Auswahl der niedrigsten 50-60% der 255 Ebenen und die Endversion Schwellenwert durch visuelle Beurteilung der Überlappung zwischen dem Schwellenwert Farbmaske (blau) und Zellsoma Perimeter (grau) in Einzelzellen (FBBILDUNG 4E).
- Schätzen Sie die Genauigkeit der Zelle soma Masken, um die Somal Dimensionen durch Messen der Fläche vor und nach der Segmentierung in 10 Zellen stellen und die ausgewählte Schwellenbereich an, wenn die Messwerte für weniger als 10% (mit dem Binary Toolbar und kommentierte Messungen).
- Manuell identifizieren Somal ROIs, die mehrere Zellen schließen und trennen diese Elemente (Beseitigung oder separaten ROIs mit den Binary Toolbar Kontrollen oder Objektkatalog), während das Umschalten Ein / Aus den binären, um die Zellen (4F) direkt visualisieren.
- Klassifizieren Mikroglia als ROIs mit somal Bereiche größer und kleiner als 50-60 & mgr; m 2 zu Zelle unterscheiden somata entsprechend aktivierte Mikroglia und deaktiviert Mikroglia jeweils mithilfe Raumeinschränkung.
HINWEIS: Jede Zelle Somal Teilmenge mit einem anderen pseudocolored binären Schicht identifiziert, und kann weiter für andere morphologische Parameter charakterisiert werden (PERIMEter, Kreisförmigkeit, etc.), als auch in diskreten retinalen Sektoren (Figur 4G) quantifiziert. Speichern Sie das Bild analysiert als ND2 Datei. - Stellen Sie sicher, den Prozess und die Komplexität Verzweigung in Einzel aktivierten Mikrogliazellen, durch Überlagerung der Somal Maske und die einzelnen xy -Punkt Bild (Kontrast erhöht 50%; 4H). Manuelles zählen die direkt aus der Zelle soma Verlängerung Prozesse oder messen Sie den Durchmesser des Polygons umfasst die Laube (verwenden Sie die Binary Toolbar und kommentierte Messungen).
HINWEIS: Aktivierte Zellen fehlt Prozesse oder tragen wenigen (<4) und kurz (<2x somal Durchmesser) diejenigen, im Gegensatz zu nicht-aktivierten Zellprozesse, die eine verzweigte und umfangreiche Dorn umfassen (> 3-10x somal Durchmesser) rund um ihre relativ kleine soma. - Manuell identifizieren Zellen mit somata kleiner als <20 & mgr; m 2 und / oder der GFP-Expression unter der Nachweisgrenze, die daher durch in unerkannt sindIntensitätsschwellen. Verwenden Sie den Befehl Taxonomy in Annotations manuell identifizierten Elemente zu zählen.
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Representative Results
Unsere bisherigen in vivo Studien verwendet diese spannungs Bildaufnahme- und Analyseverfahren, zu visualisieren und zu verfolgen, die Kinetik und Muster der ONH und retinale Mikroänderungen während der frühen Stadien der chronischen Glaukoms und ihre Beziehung zu spät Neurodegeneration 59. Hier veranschaulichen wir cSLO Bildaufnahme-Protokoll zu Mikrogliazellen in einem großen Bereich der zentralen Netzhaut in einzelnen jungen heterozygot CX3CR1-GFP DBA / 2J Retinae (Abbildung 5) zu visualisieren. Aufgrund der hohen Zellauflösung, wenden wir Livebild Schwellen und morphometrische Analysen, dass die automatische Segmentierung einzelner GFP + Zellen und Zellkörper (Abbildung 6) zu ermöglichen.
Um die Entwicklung der lokalen Mikrogliose und / oder Mikroglia-Aktivierung im Alter voran nachweisbaren Neurodegeneration in diesem Modell der chronischen Glaukom überwachen, messen wir monatlichen Schwankungen der Gesamt Mikroglia Zelldichte in einzelnen jungen heterozygot Cx3CR1-GFP DBA / 2J Netzhaut (n = 10), die zwischen 3-5 Monaten (7A). In Übereinstimmung mit dem variablen Progression von Neurodegeneration in einzelnen Augen 41-44, offenbart die Analyse unterschiedlicher Stärke retinaler Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose über Augen an jedem Alter (7B) und detektiert dynamischen Veränderungen in der Dichte des gesamten und aktivierte Mikroglia im einzelnen Retinae (7C). Spürbar werden Zahlen von aktivierter Mikroglia von gleichzeitigen Veränderungen in insgesamt GFP + Zelldichte abgekoppelt. Diese in vivo-Ergebnisse bestätigen frühere ex vivo Analyse der Veränderungen der Mikroglia DBA / 2J Mäusen 45. So cSLO Live-Nachweis und die Messung der Netzhaut Mikroglia-Aktivierung als Indikatoren der frühen Krankheitsprogression innerhalb der einzelnen Augen zu dienen, und kann potenziell auf auslösende Ereignisse von Glaukom Pathogenese verknüpft werden.
Abb. 1: Live-Bildaufnahme, Verarbeitung und Analyse-Workflow cSLO wurde auf Bild Hunderte von GFP + Mikroglia / peripheren Monozyten-Zellen an die zentrale ~ 1,7 mm 2 der Maus inneren Netzhaut lokalisiert verwendet. Fluoreszenzbilder (FA) wurden aus den gleichen Mäusen gewonnen monatlich, und mit Infrarot (IR) Fundusbilder der retinalen Gefäßsystem und Glaskörperoberfläche als Referenz ausgerichtet ist. Segmentierung der GFP + Zellen und Somata resultiert aus der Anwendung von zwei separaten Schritten Intensitätsschwellen zu FA Netzhautbilder. Morphometrische Analyse der binären Darstellung Zell somata erlaubt Messung einzelner Somal Bereichen. GFP + Zellen mit Somal Bereich über 50 & mgr; m 2 eingestuft wurden als aktiviert. Dichte des gesamten und aktiviert GFP + -Zellen wurden für die einzelnen Netzhautbilder FA gemessen wird, und die Prüfung der Dorn Verlängerung und Verzweigung Komplexität wurde durch direkte Beobachtung der FA-Bildern durchgeführt.
Abbildung 2: Live-Bildaufnahme Bedienelemente in cSLO Spectralis (A) Handbuch Touch-Screen-Display auf die Einleitung.. (B) cSLO Software Imaging-Fenster, zeigt den Kopf eines lebenden Maus. (C) Einstellungen für Infrarot-Bild ausgewählt (blau beleuchtet). (D) Fundus Bild der Netzhaut während der Echtzeiterfassung (linkes Bild) und durchschnittliche (rechtes Bild). Normalisierung Befehl angegeben mit schwarzen Kreis. Arterien und Venen strahlenförmig von der Papille sichtbar sind (in Klammern), ebenso wie die Optik axonalen Bündel (Pfeile) in zwischen den Blutgefäßen. (E) Einstellungen für Fluoreszenz-Imaging in einem einzelnen xy Punkt ausgewählt. (F) Einzel Fluoreszenz (FA, 488 nm) Bildgebung während der Erfassung (Mittelwertbildung). Ter kleineres Bild (links) zeigt einen einzelnen Scan, die größeres Bild (rechts) zeigt den Fortschritt der Intensität Mittelung. (G) Einstellungen für die Übernahme eines Mehr (Composite), Fluoreszenzbild ausgewählt. (H) Multifluoreszenzbildgebung Akquisition, die den Scanvorgang, der die Software identifiziert sich mit einem grünen Kreis (oder rot, wenn Nahme ist nicht möglich). Skala Balken stellen ~ 5 mm (B) oder 250 & mgr; m (DH) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. .
Abbildung 3: Key okulare Defekte und Abbildungsfehler, die richtige cSLO Bildgebung von Mikroglia-Zellen verhindern kann (A - C) Ocular Schäden oder Mängel, sowie Bilderfassungsfehler.s zuverlässige Bildgebung von GFP + Zellen in die innersten Ebenen der Netzhaut lokalisiert zu verhindern. (A) Einige Brutto Augen-Defekte sind in Fundusaufnahmen, einschließlich Hornhaut oder Linsentrübung oder Verletzungen und Vertiefung des Papillenfläche leicht nachweisbar, die alle verhindern klare Abbildung von GFP + -Zellen. (B) Fokussierung entweder oberhalb (die Wände der Gefäße ununterscheidbar vom Lumen) oder unterhalb der inneren Oberfläche der Retina (die Behälter sind kaum sichtbar) reduziert die Nachweisbarkeit von GFP Fluoreszenzemission von Zellen an der Nervenfaser und Ganglionzellen befindet Schichten. (C) Die Sättigungswerte falsch oder ungleichmäßig eingestellt in hellen, aber übersättigten Bildern führen (mit Zellen ohne Auflösung) oder Bilder mit verdeckten Bereiche. Maßstabsleiste stellt 250 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Binäre Schwellenbasierte Quantifizierung von Mikroglia-Zellzahlen und Somal Bereich (A - D) Schritte der Zellsegmentierung in FluoRender (A) Navigationsfenster mit gerenderten Ansicht einer repräsentativen Einzelpunkt-Fluoreszenzbild der Mikroglia in der zentralen Netzhaut.. (oben); entsprechende Wiedergabeeigenschaften (unteres Bild). (B) Das gleiche Bild in einer Zelle Segmentierungsroutine, wie RGB angesehen, mit entsprechenden Schwellenwerteinstellungen (untere Felder). Schwellen Zellen werden durch weiße Pixel dargestellt und ihre Prozesse in cyan lagert. (C) Foto von Zell Masken nach Zellsegmentierung erhalten. (D) Zurück-Maske mit invertierten Graustufenwerte für die weitere Bildbearbeitung. (E - H) Schritte von Somal Schwellen und Quantifizierung. (E) Verwendung von Intensitätsschwelle zu segmentieren Mikroglia somata aufgrund ihrer bisherigen Zellsegmentierung. Die RGB-Intensitätshistogramm (links) ermöglicht Schwellen durch direkte Auswahl des unteren 50-60% Intensitätsbereich (0 bis 127 bis 153). Diese Segmentierung erzeugt eine quantifizierbare Maske, die einzelnen Mikro Somata (blau) isoliert. Die Bilder werden mit Hilfe der Spline-Funktion (oval rechts) neu skaliert. (F) Automatische Schwellwert-basierte Messungen einzelner ROI / Somata (oben) und verwendet werden, um überlappende ROIs mit Binary-Optionen (rechts) für die manuelle Trennung oder Erosion zu korrigieren ROI Silhouetten (Objektkatalog, Bodenplatte). (G) Klassifikation der einzelnen Bereiche von Somal Gebiet Restriction (oben links). Segmented somata als ROIs kleiner und größer als 50-60 & mgr; m 2 klassifiziert und die binären Schichten für jede Klasse von Somata werden unterschiedliche Farbpixel zugeordnet (grün einnd magenta, beziehungsweise). (H) Overlay des segmentierten Somata (grün) auf dem Originalbild (mit erhöhtem Kontrast) für die direkte Beobachtung von Prozesskomplexität in einzelnen aktivierten Zellen (links) verwendet. Vergrößerte Ansicht der Zelle Lauben. Skala Balken repräsentieren 250 & mgr; m (AH) oder 50 & mgr; m (H, Einschub). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Hochauflösende Darstellung von CX3CR1- GFP + Mikroglia / Monozyten lokalisiert an der Innen Maus Netzhaut durch Live-konfokale Scanning-Laser-Bildgebung (A) Einzel xy-Punktbild cSLO zeigt GFP + Zellen im zentralen. Netzhaut in einem 2 Monate alten DBA / 2J Maus (links). Vergrößerte Ansicht (rechts), die den ONH Bereich (Kreis), Blutgefäße (Linien) gezeichnet mit perivaskulären Mikroglia / Makrophagen und Mikroglia parenchymal Fliesen der zentralen Netzhaut. (B) Multibild, unmittelbar nach dem einzigen Punkt gesammelt, um Mikroglia über einen größeren Bereich der Netzhaut (⅓ der Netzhaut) zu visualisieren. (C, D) identische Bilder, mit invertierten Graustufen für eine optimale Beobachtung der Zellmorphologie und die Komplexität gezeigt (minimal für Kontrast und Auflösung eingestellt). Somal Größe und Form kann in den meisten Zellen (links) gelöst werden. Arbor Erweiterung und Zellverzweigung kann in den Zellen mit großen Somata (rechts, und 3 Einzelzellen) gelöst werden. (E) Infrarot-Fundusbild des Gefäßsystems und Papille für xy -Ebene Ausrichtung der aufeinander folgenden Bildern verwendet. Skalenbalken stellen 250 um (A, B und E), und 25 & mgr; m (C, ganz rechts).es / ftp_upload / 52.731 / 52731fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 6: Segmentierung von Mikrogliazellen und Somata (A) GFP + Zellen, die durch die Segmentierung in 2D gerendert mit FluoRender. (B) entsprechende Zelle somata, durch Schwellen mit konfokalen Bildanalyse-Software erkannt. (C) Binärmaske von Zell somata zugänglich quantitative Analyse. (D) Klassifikation der segmentierten Zelle somata durch Bereich aktiviert Mikroglia-Zellen (> 50-60 & mgr; m 2, magenta), und nicht-aktivierten Zellen (<50 & mgr; m 2, grün) zu unterscheiden. Dim und kleine Zellen (<10-20 um 2, gelbes Sternchen) werden manuell in das Originalbild mit invertierten Graustufen (identifiziert
Fig. 7: Längs Nachführung Mikrozelldichte und Aktivierung bei jungen DBA / 2J Retinae (A) Live cSLO Fundus und FA Bilder des gleichen Auges, 3-5 Monate alt erworben. Sequentielle FA Bilder wurden verwendet, um Veränderungen über die Zeit in Gesamtzahlen von CX3CR1-GFP + -Zellen in der zentralen ~ 1,7 mm 2 der Retina lokalisierte quantifizieren. Counts enthalten parenchymal und perivaskuläre Mikroglia, aber ausgeschlossen Zellen an der ONH gruppierten (Position mit weißen Kreis markiert). (B) Zeitverlauf Analyse der Netzhaut Mikroglia Zelldichte und Aktivierung im Alter voranNeurodegeneration bei DBA / 2J chronische Glaukom (n = 10 pro Netzhaut Alter). Zahlen der gesamten GFP + Zellen und der aktivierten Mikrogliazellen (Somal Bereich> 50 & mgr; m 2) pro mm 2 der zentralen Netzhaut. Jeder Datenpunkt repräsentiert ein einzelnes Netzhaut, und bedeutet für jedes Alter sind mit einer horizontalen Linie dargestellt. (C) Monats Tracking von Zahlen der gesamten GFP + Zellen und von aktivierten Mikroglia-Zellen in einem einzigen Netzhaut. Es parallele aber quantitativ unterschiedliche Änderungen insgesamt und aktivierten Zelldichte, mit dynamischer Veränderung der Dichte von morphologisch aktivierten Zellen. Maßstabsleiste stellt 250 um (A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Echtzeitüberwachung von Mikroglia-Zellzahl und Morphologie Aktivierung während einer neurodegenerativen Erkrankung ist die Verwendung von nicht-invasive Bildgebungsverfahren, das die detaillierte Darstellung von Zellfunktionen ermöglichen. Nach der Bilderzeugung muss Mikroglia-Zellen isoliert werden (segmentiert) für morphometrische Analyse durch Verwendung von mehreren Schwellen Schritte Somal Größe und / oder Prozesskomplexität als Positionsanzeigen für Mikroglia-Aktivierung zu bewerten. In diesem Protokoll beschreiben wir Verfahren zur Livebildaufnahme mit cSLO und quantitative Analyse der Mikroglia-Aktivierung, basierend auf sequentiellen Zelle und Soma Segmentierung. Wir wenden diese Strategien, um die Kinetik der retinalen Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose mehr als 2 Monate im Rahmen einer chronischen neurodegenerativen Erkrankung der Netzhaut zu bewerten.
Reporter Mäusen und Mikroglia / Monozyten peripheren Zelltypen
Die Verwendung von Mäusen, die GFP unter der Kontrolle des Fractalkin Rezeptor exprimieren (CX3CR1)locus 46 ermöglicht eine zuverlässige Identifikation von ansässigen Mikroglia und robust GFP-Expression ermöglicht bemerkenswerte in vivo Visualisierung 30-32,34,36. Hier verwenden wir ein Unterstamm der DBA / 2J Mäusen, durch Rückkreuzung C57BL / 6.129P- CX3CR1 tm1Litt / J-Mäuse 46 in den DBA / 2J genetischen Hintergrund 59 abgeleitet. Peripheren Monozyten und Makrophagen, die das ZNS bei Krankheit oder Verletzung eindringen kann, auch zum Ausdruck bringen, die das GFP-Tag 15,46,47.
Live-Imaging-Studien der Mikroglia bei der neurodegenerativen Netzhaut
Unsere in vivo Nachführung CX3CR1-GFP / + Retinazellen mit cSLO baut auf früheren Studien, die Änderungen in der Netzhaut GFP + Zellzahl nach einer akuten Verletzung für bis zu 10 Wochen 30-32,34,48 überwacht. Hier, wir visualisieren CX3CR1-GFP / + Mikroglia / periphere Monozyten mit zellulärer Auflösung, durch monatliche cSLO Bildgebung der Netzhaut während der frühen Progression der chronischen Glaukom. EINußerdem verwenden wir Live-Bildes automatisierte Schwellenwert-basierte Analyse zur Detektion und Quantifizierung Zellgrößenänderung und Umbau mit genügend räumliche und zeitliche Auflösung auf Änderungen aktiviert und insgesamt Mikroglia zählt innerhalb der einzelnen Augen und über Personen zu überwachen.
Technischen Grenzen cSLO Bildgebung von GFP + Mikroglia in der Retina
Wir fanden Abbildungsqualität konsistent und reproduzierbar sein, wie ein Vergleich der einzelnen gegen multi- xy Punktbilder in einer einzigen Sitzung erhalten (Abbildung 5) dargestellt. Allerdings konsistente und reproduzierbare GFP + Cell Imaging Erwerb, in einer einzigen Sitzung und im Laufe der Zeit, ist kritisch bei der Auswahl der Parameter für die stabile Fundus und Fluoreszenz-Bildgebung cSLO abhängen. Ausrichtung des Auges und der optischen Platte zum cSLO Ziel bestimmt die Gleichförmigkeit der Sättigungswerte und der Fokus auf der konfokalen Ebene von Interesse 49. Ungenau und / oder ungleichmäßige Beschreibung des Proauf der Sättigungswerte können artifactual Schwankungen der GFP Erkennung, Autofluoreszenz Hintergrund und Zell und Laube Auflösung zu erzeugen. Vollständig auf Mikroglia der Nervenfaser und Ganglienzellschichten lokalisiert zu konzentrieren, ist es kritisch, auszurichten und sich auf die retinale Blutgefäße und axonalen Bündel an der Glaskörperoberfläche durch IR Fundusabbildung. Dies stellt eine Referenzebene, um die GFP + Zellen von FA zu lokalisieren. Die erforderliche Neuausrichtung zum Schalten von IR bis FA erforderlich kann durch die Übernahme von mehreren FA Bilder mit leicht unterschiedlichen Tiefen (55-60 D) in jeder experimentellen Sitzung leiten. Dies kann auch helfen, zum Ausgleich von anatomischen Unterschiede aufgrund von Alter, Pupillenerweiterung und Pathologie (Papille Ausgrabungen). Da die Bildauflösung und die Zell Detail hängt die optimale Spezifikation Sättigungsniveaus während des Fundus und sorgfältige Ausrichtung des Auges relativ zu der Kamera 49, über die Zeit erfassten Bildsequenzen für das gleiche Auge muss Fundus IR-Bilder mit c zeigenonsequente und vergleichbare Fokus, Beleuchtung, Auflösung und Netzhautfeld Spanne. Manuelle Zählungen der gesamten GFP + Zellzahlen in Bildern in einer einzigen Sitzung (1,5 bis 1,7 mm 2 der Netzhaut, n = 13 Netzhaut, im Alter von 3-5 Monaten) erworben bestätigt konsistente und reproduzierbare Quantifizierung der Zellgehalt (3-4% Abweichung; Daten nicht gezeigt). Dies ist notwendig für Bilder zugänglich für GFP + -Zellen Segmentierungsschwelle durch Analyse auf der Grundlage einer ähnlichen Intensitätsbereich, und der Vergleich der Veränderungen über die Zeit sein.
Threshold und morphometrische Analysen der retinalen Mikrogliazellen in Live cSLO Bilder
Erst vor kurzem wurde in vivo-Visualisierung von Gehirn Mikroglia mit hoher Zellauflösung durch Zweiphotonen Konfokalmikroskopie die quantitative Analyse von Mikro Soma und Verfahrensparameter und die Diskriminierung der morphologisch aktivierte Mikroglia 9,50 aktiviert. Da von diesen Autoren gezeigt, ist Somal Größe das auffälligste morphologischenParameter im Laufe der Zeit nachweisbar Live Zweiphotonen konfokale Bildgebung von Hirn Mikroglia mit iterative intensitätsbasierten Schwellensignal-Rauschvariationen 9 bis reduzieren. Außerdem korrelieren Somal Größenänderungen mit Hochregulation von Iba1 Expression in aktivierten Zellen 9. Hier verwenden wir cSLO Live-Bilder und gelten vergleichbare sequentielle Segmentierung von Mikrogliazellen und Somata, gefolgt von morphometrische Analyse zur Zahl der insgesamt zu quantifizieren und aktiviert CX3CR1-GFP + Zellen der Netzhaut lokalisiert.
Wir verwenden spezielle konfokale Rendering-Software (FluoRender) zu Segment GFP + Zellen in der Netzhautmitte. Diese Bilder werden weitere Schwellenwert mit einem handelsüblichen konfokale Bildanalysepaket, um letztlich die automatische Segmentierung und schwellwertbasierte Quantifizierung somal Bereich. Unser Live-Bild-Analysen bestätigten die Verwendung von Soma Größe wie eine morphologische Metrik der Mikroglia-Aktivierung in Live-Bildanalyse 9. Somalschwellwertbasierte Zählungen erlaubt die Charakterisierung von Mustern und erhöht in retinalen Mikrogliose, wie zuvor von Ex-vivo-Bildanalyse 50 gezeigt. Wir finden, dass cSLO erkennt GFP + Mikroglia mit bester Auflösung und Detailgenauigkeit in der Maus zentralen Netzhaut (<2 mm 2), in dem Zellen können gleichzeitig konfokalen Ebene abgebildet werden. Auf dem Weg zur Netzhaut Peripherie, das Fluoreszenzsignal zeigt Variabilität und Verzerrungen, die gleiche Bildverarbeitung und Analyse Schwelle zu verhindern, wie zum GFP + Zellen in der Netzhautmitte flacher erkannt. Schließlich zeigt unser Protokoll daß cSLO in vivo Bildanalyse von retinalen Mikroglia bietet einen relativ hohen Durchsatz. Die Anzahl der parenchymalen Mikroglia, die optisch getrennt und innerhalb der zentralen Netzhaut quantifiziert werden konnte variiert zwischen ~ 200-300 Gesamtzellen und ~ 10-180 aktivierten Zellen. Somit bietet die Maus retinalen Mikroglia eine optimale Bevölkerung in vivo ihre Umwandlung und Rollen zu studieren dährend die Pathogenese der Neurodegeneration.
Anwendung auf andere CNS chronischen Krankheiten
Die hier beschriebenen in vivo Bildanalyseverfahren sollte für akute oder chronische Mikroglia Änderungen in anderen Maus Netzhauterkrankungen und Verletzungen Modelle zu bewerten. Ferner kann dieses Protokoll dienen, retinale Mikroglia / periphere Monozyten Änderungen chronischen ZNS-Erkrankungen, wie Alzheimer, Parkinson und Multipler Sklerose resultierende, da die Netzhaut und im Sehnerven für Neurodegeneration bei diesen Erkrankungen 51-56 gezielt auswerten. Im Einklang mit dieser, ist der Einsatz von Live-Erkennung von Netzhaut und Sehnervenkopf Pathologie für Disease Management frühen Alzheimer unter intensiver Studie 54,57,58.
Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse, dass Live-Längsverfolgung und Quantifizierung von Veränderungen in der Netzhaut Mikroglia Zahlen und morphologischen Aktivierung kann so zuverlässig ne dienenuroimaging Biomarker Krankheitsbeginn und frühen Progression zu erkennen. Diese in-vivo-Bildgebung und Analyse Methode anwenden, altersbedingte Glaukom, und möglicherweise auch für andere neurodegenerative Erkrankungen, die die Netzhaut und im Sehnerven auswirken.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000671 and 00582 | Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift. |
| 30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe | BD, East Rutherford, NJ | 305106 and 309659 | |
| 2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T48402, 152463 and P4417 | Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week. |
| Heat therapy T/Pump | Gaymar Industries, Orchard Park, NY | TP-650 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 23-400-100 | |
| Tropicamide 1% | Bausch & Lomb, Rochester, NY | NDC 24208-585-64 | |
| PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center | Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK | G003709 | Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes. |
| HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software | Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA | Version 1.7.1.0 | |
| PowerPoint | Microsoft, Redmond, WA | Version 14.4.3 | |
| Adobe Photoshop | Adobe, San Jose, CA | Version CS3 | |
| FluoRender | Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah | Version 2.13 | Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html |
| NIS-Elements C | Nikon, Melville, NY | Version 4.30.01 |
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