Summary
Mikroglia aktivering och microgliosis är viktiga svar på kronisk neurodegeneration. Här presenterar vi metoder för in vivo långsiktig visualisering av näthinnan CX3CR1-GFP + mikrogliaceller genom konfokal oftalmoskopi, och för tröskel och morfometriska analyser för att identifiera och kvantifiera deras aktivering. Vi följer microglial förändringar under tidiga stadier av åldersrelaterade glaukom.
Abstract
Mikroglia, som är CNS-bosatta neuroimmune celler, förändra deras morfologi och storlek som svar på CNS-skada, byta till ett aktiverat tillstånd med tydliga funktioner och genuttrycksprofilerna. Roller microglial aktivering i hälsa, skada och sjukdom fortfarande ofullständigt känd på grund av deras dynamiska och komplexa reglering som svar på förändringar i deras mikromiljö. Därför är det viktigt att icke-invasivt övervaka och analysera förändringar i microglial aktivering över tiden i den intakta organismen. In vivo studier av microglial aktivering har försenats av tekniska begränsningar att spåra microglial beteende utan att ändra CNS miljön. Detta har varit särskilt utmanande under kronisk neurodegeneration, där långsiktiga förändringar måste spåras. Näthinnan, en CNS organ mottagliga för icke-invasiv levande avbildning, erbjuder ett kraftfullt system för att visualisera och karakterisera dynamiken i mikroglia aktivering under kroniska sjukdomar.
in vivo imaging av retinal mikroglia, med hjälp av konfokal ophthalmoscopy (cSLO) och CX3CR1 GFP / + reporter möss, för att visualisera mikroglia med cellulär upplösning. Dessutom beskriver vi metoder för att kvantifiera månatliga förändringar i cellaktivering och täthet i stora cellgrupper (200-300 celler per näthinnan). Vi bekräftar användningen av Somal område som ett användbart mått för levande spårning av microglial aktivering i näthinnan genom att tillämpa automatiserad tröskel baserade morfometrisk analys av in vivo bilder. Vi använder dessa sökarbilden förvärv och analyserar strategier för att övervaka de dynamiska förändringar i microglial aktivering och microgliosis under tidiga stadier av retinal neurodegeneration i en musmodell för kronisk glaukom. Detta tillvägagångssätt bör vara användbara för att undersöka bidragen från mikroglia till neuronala och axonal nedgång i kroniska sjukdomar i centrala nervsystemet som påverkar näthinnan och synnerven.
Introduction
Mikroglia är neuroimmune celler som uteslutande uppehåller sig i det centrala nervsystemet (CNS) sedan början av embryonal utveckling och under hela vuxenlivet. Utrustad med en komplex repertoar av receptorer, är microglial aktivitet och regional heterogenitet regleras av deras dubbelriktad samspel med grann neuroner, Glia, blod-hjärnbarriären och infiltrerande neuroinflammatoriska celler 1,2. Basal microglial funktioner bidrar till fysiologiska underhåll och reparationer, eftersom de prov deras territorium för störningar i homeostasis 3,4. Under CNS-skada eller sjukdom, mikroglia är de första som svarade på neuronala signaler som sedan utlöser övergången till en reaktiv fenotyp, benämnd "aktiverad mikroglia 2,5-7. Mikroglia aktivering involverar en invecklad cykel av gen- och proteinuttryck, vilka är kopplade till cell soma och processstorleksändring och remodeling 6-9. Mikroglia aktivering, liksom omfördelning cell ochklustring, kan åtföljas den lokala totala ökningen av antalet celler (benämnda microgliosis). Detta kan bero på celltillväxt och självförnyelse, med eller utan rekrytering av blodbaserade monocyter 3,4,7,10-14. I ett brett utbud av åldersberoende, kroniska CNS-sjukdomar, ihållande microgliosis och mikroglia aktivering parallell sjukdomsprogression 15-19. Hur mikroglia inverkan neurodegeneration är fortfarande oklart, främst därför att de spelar både neuroprotektiva och skadliga roller som kan ha olika bidrag till sjukdomsdebut och progression. Live imaging studier som syftar till att förstå kronisk CNS-sjukdom har övervakat microglial beteende i den skadade CNS djurmodeller och människor, och visade att microglial förändringar är detekterbara början på stegen 15-17,19,20 tidiga sjukdoms. Därför är det viktigt att utveckla metoder för att upptäcka och övervaka microglial aktivering in vivo.
Icke-invasiv deteInsatser av regionala förändringar i hjärnans mikroglia aktivering etablerades som en viktig in vivo indikator på neurodegenerativ sjukdomsprogression, med hjälp av molecular imaging eller bioluminiscens och positronemissionstomografi eller magnetisk resonanstomografi 18,21,22. Dessa mycket kvantitativa och icke-invasiva molekylär och kärnavbildningsmetoder upptäcka gliosis med regional upplösning. Alternativt har två-fotonen konfokala avbildning i CX3CR1 GFP / + möss tillät observation av hjärnans mikroglia med cellulär upplösning 3,4,9,20,23-28. Detta begränsar emellertid långsiktigt tillvägagångssätt och upprepad observation av kroniska mikrogliaceller förändringar, med tanke på den potentiella risken för att störa deras beteende genom att även minimalt invasiva hjärnavbildningsförfaranden 29. Alternativt erbjuder näthinnan optimala förutsättningar för direkt, in vivo visualisering och upprepad övervakning av mikroglia i deras intakt CNS nisch hela åldrande, efter akut skada, ochpotentiellt under kroniska neurodegenerativa sjukdomar. Således har nya studier visat genomförbarheten av högupplösta avbildning av retinala mikroglia uttrycker GFP genom att anpassa konfokala scanning laser ophthalmoscopy (cSLO) bilden levande CX3CR1 GFP / + möss. Detta har använts för att spåra varje vecka förändringar i GFP + cellantal i individuella möss i upp till 10 veckor efter akut inducerad skada eller okulär hypertension 30-36.
Vi har utökat denna metod för att utföra långsiktiga avbildning under flera månader, och kvantitativt spåra ändringar i mikroglia aktivering baserat på soma storlek använder morfometrisk analys. Somal storlek definierades som en användbar metriska av mikroglia aktivering i levande imaging studier med två-foton konfokalmikroskopi i kortikala skivor för att utföra in vivo avbildning av CX3CR1-GFP + mikroglia 9. Dessa och andra studier visade också sambandet mellan Somal storlek och halter av Iba1 proteinuttryck, which ökar också med aktivering 9,37. Således kan aktiveras mikroglia identifieras i levande möss, och deras antal och distribution övervakas under tiden under CNS hälsa och sjukdom.
Detta protokoll beskriver metoder för cSLO sökarbilden insamling och analys för att övervaka microglial cellantal, distribution och morfologisk aktivering under näthinneganglieceller (RGC) degeneration (Figur 1). Således använder denna studie: 1) en musmodell av ärftlig glaukom (DBA / 2J) som genomgår åldersberoende synnerven och retinal neurodegeneration och visar anmärkningsvärd variation i sjukdomsförloppet mellan 5 och 10 månaders ålder 38,39, 2) månads cSLO in vivo imaging för långsiktig visualisering av GFP + celler i näthinnan och omyeliniserad synnerven av heterozygota CX3CR1 GFP / + DBA / 2J möss åldern 3-5 månader, 3) levande bildanalys genom segmentering och tröskel att isolera cell somata och åtgärd denir område. Dessa strategier används för att bedöma kinetiken av näthinnans microglial aktiveringstillstånd under tidiga stadier av kronisk glaukom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In vivo imaging utförs i patogenfria anläggningar som använder protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Utah.
OBS: Denna avbildning protokollet används för reporter möss i vilka retinala mikroglia och infiltrerande monocyter / makrofager uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av den fraktalkin receptor lokus (CX3CR1).
1. In vivo avbildning av näthinnan GFP + mikroglia av Confocal Scanning Laser ophthalmoscopy (cSLO)
- Slå på värmesystemet vatten styrd, inställd på att stabilisera musen temperatur mellan 35-37 ° C under förfarandet, och anslut två värmedynor.
- Starta konfokala avsökningslaser oftalmoskop (cSLO) systemet (Figur 2A). Öppna cSLO programmet, ange informationen som identifierar den enskilda musen och ställa in en hornhinnans krökning av 2 mm (Patient Data-menyn).
- Förbered för imaGing. Säkert passar en ren 55º brett fält objektiv på sin sockel. Förbered oftalmoskop imaging plattform genom att säkra en värmedyna täckt med rena papper. Använd klipp för att platta dynan och papper och hålla dem från att blockera rörelsen av objektivet.
- Bedöva musen genom intraperitoneal injektion av 1,3% 2,2,2-tribromoethanol och 0,8% tert-amylalkohol (250 mg / kg kroppsvikt; 0,5 ml / 25 g kroppsvikt) med användning av en 30½ G nål monterad på en 1 ml engångs spruta. Återgå musen till sin bur, hålls under en värmedyna.
OBS: Leveransen av bedövningsmedel genom injektion kontra inandning möjliggör enklare placering av musen för avbildning och obehindrad tillgång till ögonen, utan noskoner och slangar. - När djuret slutar röra sig och inte svarar på svansen nypa, framkalla elev utvidgning med Tropikamid och fenylefrin (0,5% vardera), genom att placera djuret liggande och täcker båda ögonen med dropparna för 7 min.
- Efter 5 minuter, ssnöra musen utsträckt på mitten av oftalmoskop plattformen, och passform kontaktlinser över båda ögonen, applicera minimala tryck.
OBS: Kontaktlinser är små och sköra men kan hanteras försiktigt med fingrarna, även tång kan användas i stället 40. Användningen av kontaktlinser är valfritt, men rekommenderas eftersom det minimerar torra ögon och bevarar hornhinnans transparens under avbildning. - Efter 7 minuter, orientera musen med det högra ögat vänd mot objektivlinsen och den bana parallellt med objektivlinsen, hålla djuret ohämmad nära kanten av plattformen (figur 2B). För att samla bilder av jämförbar mättnad och orientering, ständigt hålla avståndet från ögat till objektiv, liksom anpassning av ögat till ljusvägen genom avbildning sessioner. Clip långa morrhår stör observation av ögat.
OBS: För nästa 8-10 minuter, kommer musen inte flytta eller blinkar, och kommer andetag med mild dragment, som spåras av cSLO Eye Tracking ART (automatisk realtid) läge, vilket justerar skanningshuvudets ställning baserat på landmärken fundus med hög kontrast. Tidigare denna tid, börjar möss flämtande och blinkar, vilket gör avbildning opraktiskt. - Om avbildning utförs utan användning av kontaktlinser, applicera PBS sjunker till båda ögonen varje 2-3 min för att förhindra dem från att torka.
- Samla en fundus bild av näthinnans kärl och optisk skiva, med fokus på den inre näthinnan.
- Välj IR-läge (IR) och justera inställningarna till 820 nm excitation, 100% lasereffekt, 40-60% känslighet (figur 2C).
- Att arbeta i höghastighetsläge (12,6 ram / sek), lokalisera ögat med joysticken för att driva oftalmoskop. Vid låg förstoring, inspektera hornhinnan och linsen för skada eller opacitet, och omfattar från studie ögonen med defekter eller skada som kommer att påverka avbildning av näthinnan (Figur 3A).
- Leta reda på optisk skivområdet (ytasynnerven huvudet, ONH) genom att föra målet närmare ögat, sedan centrera bilden på den och lås detta läge genom att skruva på styrspaken. Denna anpassning av ögat till oftalmoskop är nyckeln att få även fokusera och utsläpp över bilden.
- Visualisera inre plan i näthinnan, liksom ONH, med användning av de stora blodkärlen som ligger på vitreal ytan av näthinnan som en referens fokalplan (59 och 60 D), eller djupare (55 D) i ögonen som visar utgrävda optik skivor. Den optimala fokus bör lösa cirkulerande blodkroppar i större blodkärl, med sina lumen och väggar klart åtskilda.
- Optimera bild mättnad genom att justera ratten på pekskärmen på kontrollpanelen, tills en vit gloria av enhetlig belysning spänner i de flesta 55º fundus fältet runt den optiska skivan (med lätt överexponering). Därefter sänker mättnad för att optimera kontrasten tills blodkroppar rör sig längs de stora fartygen kan tydligt lösas. Om fokal mörkområden kvarstår, inte på grund av skada på näthinnan, justera ögat till kameran tills en jämnt ljus bild erhålls. Denna justering är grundläggande för att fånga reproducerbara uppsättningar av bilder på plats och kvalitet.
- Samla en högupplöst IR bild av den centrala näthinnan (1,4-1,7 mm i diameter, beroende på ålder), i genomsnitt 30 bildrutor i realtid (4,7 bilder / sek, normaliserad), för att förbättra signal-brusförhållande (Figur 2D ).
- Omedelbart, förvärva en fluorescensbild av GFP + mikroglia och / eller infiltrerande monocyter lokaliserade till de inre planen hos näthinnan och ONH.
OBS: Optimering av IR fundus bilden av näthinnan bestämmer upplösningen av fluorescens bild av GFP + celler, liksom omfattningen av inre retina spännas. Underlåtenhet att fokusera de inre planen hos näthinnan, vilket kan detekteras genom dålig upplösning av vaskulaturen, kommer att resultera i nedtonade GFP + celler vyer (fig 3B). Underlåtenhet att justera IR saturanson korrekt och enhetligt påverkar fluorescensbild (FA), införa artefaktuella variationer i GFP + cell intensitet och storlek (figur 3C).- Swich att fluorescens bildläget (FA) i pekskärmen panelen, med hjälp av blå, 488 nm laserexcitation (460-490 nm spärrfilter set), och förvärvs inställningar (100% laser makt och 100-125% känslighet), som upprätthålls konstant för alla möss (Figur 2E).
- Samla en enda xy-punkt, tvådimensionella fluorescens bild av näthinnan, och omedelbart fånga en fundus bild Vid ett givet läge (100x scan genomsnittet, 55º skanningsvinkel för båda bilderna, Figur 2F).
- Fånga en multibild genom att välja "komposit" i kontrollpanelen (figur 2G) och flytta oftalmoskop höger och vänster, panorering näthinnan över nasal-temporala axeln (Figur 2H).
OBS: Efter en enda xy-punktbild skanning (100x skan genomsnitt), programvaran automatiskt genomsnitt nya skannar av samma och nya områden (avgränsade med en grön cirkel under optimala scan eller rött när skanningen är omöjligt), och stygn alla xy-positioner i realtid. Den resulterande sammansatta bilden spänner 1,5-1,7 mm på den horisontella axeln x 3-4 mm i den vertikala axeln (55 ° x 120-124º avsökningsvinkel).
- Komplett avbildning av varje mus inom 15 minuter efter att inducera anestesi, före blinkar och rörelse omstarter.
- Ta bort kontaktlinser, hydrat ögonen med PBS och tillbaka djuret till dess värmas bur, kontroll beteende tills full återhämtning av rörlighet.
- För longitudinella studier med intermittenta cSLO-avbildning sessioner i samma individ mus, upprepa avbildning inte mindre än 3 dagars mellanrum för att undvika kumulativ toxicitet av anestesi, liksom hornhinneirritation.
2. Live Bildbehandling och analys
- Sekventiell bildjustering:
- Riktafundus bilderna för en tidsserie med samma öga med hjälp av kärl och optisk skiva som landmärken. Öppna alla bilder i en kommersiell bildspel presentationsprogram, genom att dra varje bild över den föregående tills deras optiska skivor anpassa på XY planet (översta bilden visas halvtransparent medan dras), vrid sedan övre bilden tills dess stora blodkärl lappar med kärl på bilden nedan (med fokus på fartyg längst bort från den optiska skivan). Spela in rotationsvinkeln för varje bild och spara tidsserier för framtida referens, hålla koll på musen och ögon identitet.
- Rikta in motsvarande serie av enstaka xy-point fluorescens bilder genom att applicera det inspelade vinkel för att korrigera xy rotation vid varje tidpunkt, med användning av ett raster grafisk editor programmet. Dessutom, justera upplösningen till 300 dpi (utan omskalning) och bakgrund (i RGB-läge, välj Nivåer och prova lumen av ett blodkärl som svart). Spara dessa bilderTIF-filer, lägga till "i linje" till sitt namn.
- Microglial cell segmente:
- För att identifiera GFP + celler i centrala näthinnan, öppna i FluoRender den "linje" TIF-fil som motsvarar den tidigaste tidpunkt / ålder. Zooma bilden för att passa skärmen, sedan definiera Render vyn (komposit, ortogonala, interpolerad) och dess egenskaper (0,58 gamma, 255 mättnadspunkt, 255 luminans, 195 alfa- och 1,00 skuggning), välja både RG kanaler som synlig (dölj B-kanal genom att dubbelklicka på den i arbetsytan bild, figur 4A).
- Om du vill markera enskilda celler, tröskel den röda kanalen (måste lyftas fram på arbetsytan ramen), genom att öka den låga tröskeln tills majoriteten av cellerna är maskerade (vit) med minimal överlappning och cellprocesser (cyan), samtidigt som den höga tröskeln konstant (255). Den låga tröskelvärdet varierar mellan 100 och 170, beroende på vilken fluorescensintensiteten (figur 4B </ Strong>).
- Spara den här vyn med den röda kanalen syns bara (Capture kommando) som en ny TIF fil, lägga till "cellsegm" till sitt ursprungliga namn (Figur 4C). Med hjälp av en generisk raster grafisk Editor, invertera sin gråskala och justera enligt ovan resolution till 300 dpi, och spara igen som RGB (Figur 4D).
OBS: Ta bort mappar (projekt) automatiskt skapats av FluoRender, och spara den tillämpade tröskeln för framtida referens.
- Microglial soma segmentering och morfometri:
- För att identifiera GFP + cell somata för området kvantifiering, använder bildanalys programvara med automatiserad intensitetsmätningar och tröskel kapacitet, liksom tröskelbaserad objekträkning och mätning. Öppna "cellsegm" TIF-filen och välj Omskalningen metoden (spline) och den röda kanalen (klicka röda fliken i RGB). Förbättra visualisering genom att avmarkera "Visa kanal i färg" (högerklicka på den röda RGB flik), och välja "komplettera färger" (Bild / Justera bild) för att invertera gråskala och se cellerna i grå / svart på vit bakgrund (Figur 4E).
- Kalibrera bilden till 1,4-1,7 mm beroende på ålder, genom att dra en horisontell linje över hela bilden (kalibrering, snabb kalibrering).
- Segment individuell cell somata genom att tillämpa intensitet tröskel (Figur 4B). För detta arbete på den röda RGB-kanal och öppna Threshold Intensitet funktion (Object Count, välja "räkna uppdatering" kommando) i syfte att spåra tvådimensionell parametrar för varje tröskel regionen av intresse (ROI) som representerar individuella somata.
- Definiera intensiteten tröskeln i intensitet histogrammet, genom att välja lägsta 50-60% av de 255 nivåer, och förfina den slutliga tröskelvärdet genom att visuellt bedöma överlappningen mellan tröskelfärgmasken (blå) och cell soma omkrets (grå) i enskilda celler (Figure 4E).
- Uppskatta noggrannheten i cell soma masker för att representera de Somal dimensioner genom att mäta området före och efter segmentering i 10 celler och accepterar det valda tröskelområdet om mätningarna skiljer sig mindre än 10% (använd Binary Toolbar och kommenterad mätningar).
- Identifiera manuellt Somal ROI som innehåller flera celler och separerar dessa element (eliminera eller separata ROI med hjälp av binära Toolbar kontroller eller Object Catalog) medan växla på / av den binära att direkt visualisera celler (Figur 4F).
- Klassificera mikrogliaceller som ROI med Somal områden större och mindre än 50-60 pm 2 att diskriminera cell somata motsvarande aktiverade mikroglia och avaktiveras mikroglia respektive genom att använda Area begränsning.
OBS: Varje cell Somal delmängd identifieras med en annan pseudocolored binär skikt, och kan karakteriseras ytterligare för andra morfologiska parametrar (perimeter, cirkularitet, etc.), samt kvantifieras inom diskreta retinala sektorer (Figur 4G). Spara den analyserade bilden som en ND2 fil. - Kontrollera processen och förgrening komplexiteten i enskilda aktiverade mikrogliaceller, genom att lägga den Somal masken och enda xy -point bild (kontrast ökade 50%, Figur 4H). Räkna manuellt processer som är direkt sträcker sig från cellen soma eller mäta diametern på polygon omfattar bersån (använd Binary Toolbar och kommenterad mätningar).
OBS: Aktiverad celler saknar processer eller bära några (<4) och korta (<2x Somal diameter) sådana, i motsats till icke-aktiverad cellprocesser, som innefattar en förgrenad och omfattande arbor (> 3-10x Somal diameter) som omger deras relativt små soma. - Identifiera manuellt celler med somata mindre än <20 pm 2 och / eller GFP uttryck under detektionsgränsen, vilket därför oupptäckt av iSPÄNNING tröskling. Använd kommandot taxonomi i Anteckningar att räkna manuellt identifierade element.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våra senaste in vivo-studier använt dessa levande bild förvärv och analysmetoder för att visualisera och spåra kinetik och mönster av ONH och retinala microglial förändringar under tidiga stadier av kronisk glaukom och deras förhållande till slutet av neurodegeneration 59. Här visar vi en cSLO bildtagning protokoll för att visualisera mikrogliaceller över ett stort område i den centrala näthinnan i enskilda unga heterozygota CX3CR1-GFP DBA / 2J näthinnor (Figur 5). Baserat på den höga cell upplösning, tillämpar vi sökarbilden tröskel och morfometriska analyser som gör det möjligt för automatisk segmentering av enskilda GFP + celler och somata (Figur 6).
För att övervaka utvecklingen av lokala microgliosis och / eller mikroglia aktivering vid åldrar föregående detekterbar neurodegeneration i denna modell av kronisk glaukom, mätte vi månatliga variationer av total mikroglia celltäthet i de enskilda unga heterozygot Cx3CR1-GFP-DBA / 2J näthinnor (n = 10) mellan 3-5 månaders ålder (Figur 7A). I överensstämmelse med den variabla framskridandet av neurodegenerering i enskilda ögon 41-44, avslöjar vår analys variabla nivåer av retinal mikroglia aktivering och microgliosis över ögonen på varje ålder (Figur 7B), och detekterar dynamiska förändringar i densiteten för totala och aktiverade mikroglia inom enskilda näthinnor (Figur 7C). Märkbart är antalet aktiverade mikroglia frikopplas från samtidiga förändringar i den totala GFP + celltäthet. Dessa in vivo resultat bekräftar tidigare ex vivo analys av microglial förändringar i DBA / 2J möss 45. Således cSLO levande detektering och mätning av retinal microglial aktivering kan tjäna som indikatorer för tidig sjukdomsprogression inom enskilda ögon, och kan potentiellt vara kopplat till inledande händelser av glaukom patogenes.
Figur 1:. Live bild förvärv, bearbetning och analys arbetsflöde cSLO användes för bild hundratals GFP + microglial / perifera monocyt celler lokaliserade till centrala ~ 1,7 mm 2 av musen inre näthinnan. Fluorescence bilder (FA) förvärvades per månad för samma möss, och i linje med hjälp av infraröda (IR) fundus bilder av retinal kärl och vitreal yta som referens. Segmentering av GFP + celler och somata resulterade från att tillämpa två separata steg av intensitetströskel till FA retinal bilder. Morfometrisk analys av binära representerar cell somata tillät mätning av individuella Somal områden. GFP + celler med Somal området ovanför 50 pm 2 klassificerades som aktiveras. Densitet av totalt och aktiverade GFP + celler mättes för enskilda retinal FA bilder, och undersökning av berså förlängning och förgrening komplexitet genomfördes genom direkt observation av FA bilder.
Figur 2: Live bildförvärvs kontroller i cSLO Spectralis (A) Manuell pekskärm panelen på initiering.. (B) cSLO programvara bildbehandling fönster, som visar huvudet av en levande mus. (C) Inställningar som valts ut för värmekamera (lyser blå). (D) Fundus bilden av näthinnan under realtid förvärv (till vänster) och den genomsnittliga (högra panelen). Normalisering kommando som indikeras med svart cirkel. Artärer och vener som strålar ut från synnerven huvudet syns (inom parentes), som är de optiska axonal buntar (pilar) i mellan blodkärlen. (E) Inställningar ut för fluorescens avbildning inom en enda xy punkt. (F) Enpunktskvantifiering fluorescens (FA, 488 nm) avbildning under förvärv (genomsnitt). Than mindre bild (vänster) visar en enskild skanning, desto större bild (höger) visar utvecklingen av intensitet medelvärdes. (G) Inställningar ut för förvärv av en multi (komposit), fluorescens bild. (H) Multi fluorescens avbildning förvärvet visar skanningen pågår, där programmet identifierar sig med en grön cirkel (eller rött när förvärvet är inte möjlig). Skalstrecken representerar ~ 5 mm (B) eller 250 m (DH) Klicka här för att se en större version av denna siffra. .
Figur 3: Nyckeln okulära defekter och bild fel som kan förhindra korrekt cSLO avbildning av mikrogliaceller (A - C) ögonskada eller defekter, samt bildtagning fel.s kan förhindra tillförlitlig avbildning av GFP + celler lokaliserade till de innersta plan näthinnan. (A) Vissa bruttoögonskador är lätt detekteras i fundus bilder, inklusive hornhinnan eller grumling av linsen, eller skada och fördjupning av den optiska skivområdet, vilka alla förhindra tydlig avbildning av GFP + celler. (B) Fokusering antingen ovanför (väggarna i kärlen blir omöjlig att skilja från lumen) eller under den inre ytan av näthinnan (fartygen är knappt synliga) minskar detekterbarheten av GFP fluorescensemission från celler belägna vid nervfibrer och gangliecell skikt. (C) Saturation nivåer felaktigt eller ojämnt inställd kan resultera i ljusa men övermättade bilder (med celler som saknar upplösning) eller bilder med övertäckta områden. Skala stapel representerar 250 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Binary tröskelbaserad kvantifiering av mikroglia kroppar och Somal område (A - D) Steg cellsegmente i FluoRender (A) Navigering fönster med återges av en representant enda punkt fluorescens bild av mikroglia i den centrala näthinnan.. (övre fältet); motsvarande givande egenskaper (lägre panel). (B) Samma bild under en cell segmente rutin, ses som RGB, med motsvarande tröskelinställningar (lägre paneler). Tröskel celler representeras av vita pixlar och över till sina processer i cyan. (C) Bild av cell masker som erhållits efter cellsegmentering. (D) Föregående mask med inverterade gråskalevärden för vidare bildbehandling. (E - H) Steg för Somal tröskel och kvantifiering. (E) Användning av intensitet tröskel att segmentera mikroglia somata baserat på deras tidigare cellsegmentering. RGB intensitet histogrammet (vänster) kan tröskel genom direkt val av det lägre 50-60% intervall av intensiteter (0 till 127 till 153). Denna segmentering skapar ett kvantifierbart mask som isolerar enskilda microglial somata (blå). Bilderna skalas med hjälp av spline-funktionen (oval till höger). (F) Automatiska tröskelbaserade mätningar av enskilda ROI / somata (övre panelen) och ROI silhuetter (Objekt Katalog, bottenpanel) används för att korrigera överlappande ROI med binära Verktyg (höger panel) för manuell separation eller erosion. (G) Klassificering av enskilda Somal områden områdesvis begränsning (överst till vänster). Segmenterad somata klassificeras som ROI mindre och större än 50-60 pm 2, och de binära skikten för varje klass av somata tilldelas olika färgpixlar (grön ennd magenta, respektive). (H) Overlay av den segmenterade somata (grön) på originalbilden (med ökad kontrast) används för direkt observation av process komplexitet i enskilda aktiverade celler (till vänster). Förstorad vy av cell hållare. Skalstrecken representerar 250 m (AH) eller 50 pm (H, infälld). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Högupplöst visualisering av CX3CR1- GFP + mikroglia / monocyter lokaliserade till inner mus näthinnan med levande konfokal scanning laser imaging (A) Single XY punkt cSLO bild som visar GFP + celler inom det centrala. näthinnan i en två månader gammal DBA / 2J mus (vänster). Förstorad vy (höger) visar ONH området (cirkel), blodkärl (linjer) kantas av perivaskulär mikroglia / makrofager, och parenkymal mikroglia kakel centrala näthinnan. (B) Multi bild, samlas omedelbart efter en enda punkt att visualisera mikroglia över ett bredare retinal område (⅓ av näthinnan). (C, D) identiska bilder, som visas med inverterad gråskala för optimal observation av cellmorfologin och komplexitet (minimalt justerat för kontrast och upplösning). Somal storlek och form kan lösas i de flesta celler (vänster). Arbor förlängning och cell förgrening kan lösas i cellerna med stor somata (höger och 3 enskilda celler). (E) IR fundus bild av kärl och optisk skiva som används för xy -planet anpassning av sekventiella bilder. Skalstrecken representerar 250 ^ m (A, B och E) och 25 | j, m (C, längst till höger).es / ftp_upload / 52.731 / 52731fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:. Segmentering av microglial cell och somata (A) GFP + celler utförda av segmentering i 2D med hjälp av FluoRender. (B) motsvarande cell somata, detekteras genom tröskling hjälp av konfokal bildanalysmjukvara. (C) Binary mask cell somata mottagliga för kvantitativ analys. (D) Klassificering av segmenterad cell somata efter område att diskriminera aktiverade mikrogliaceller (> 50-60 pm 2, magenta) och icke-aktiverade celler (<50 pm 2, grön). Dim och små celler (<10-20 pm 2, gul asterisk) identifieras manuellt i den ursprungliga bilden med inverterad gråskala (
Figur 7:. Längd spårning av microglial celltäthet och aktivering i unga DBA / 2J näthinnor (A) Live cSLO fundus och FA bilder av samma öga förvärvade 3-5 månaders ålder. Sekventiell FA bilder användes för att kvantifiera förändringar över tid i totala antalet CX3CR1-GFP + celler lokaliserade i centrala ~ 1,7 mm 2 av näthinnan. Räknar ingår parenkymal och perivaskulär mikroglia, men uteslutna celler klustrade på ONH (positionen anges med vit cirkel). (B) tidsförloppet analys av retinal mikroglia celldensitet och aktivering vid åldrar föregårneurodegeneration i DBA / 2J kronisk glaukom (n = 10 näthinnor per år). Antalet totala GFP + celler och av aktiverade mikrogliaceller (Somal området> 50 pm 2) per mm2 av centrala näthinnan. Varje datapunkt representerar ett enda näthinna, och organ för varje ålder är representerade med en horisontell linje. (C) Månatlig spårning av antalet totala GFP + celler och av aktiverade mikrogliaceller i en enda näthinna. Det finns parallella men kvantitativt olika förändringar i den totala och aktiverad celldensitet, med mer dynamisk variation i täthet av morfologiskt aktiverade celler. Skala stapel representerar 250 pm (A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Realtidsövervakning av microglial cellantal och morfologiska aktivering under en neurodegenerativ sjukdom kräver användning av icke-invasiva avbildningsmetoder som tillåter detaljerad visualisering av cellsärdrag. Efter bildbehandling, måste mikrogliaceller isoleras (segmenterad) för morfometrisk analys genom användning av flera tröskel åtgärder för att bedöma Somal storlek och / eller processkomplexitet som avläsningar för mikroglia aktivering. I detta protokoll, beskriver vi metoder för levande bildtagning med hjälp av cSLO och kvantitativ analys av microglial aktivering baserad på sekventiella cell och soma segmentering. Vi tillämpar dessa strategier för att bedöma kinetiken av retinal mikroglia aktivering och microgliosis över 2 månader i samband med en kronisk neurodegenerativ sjukdom av näthinnan.
Reporter möss och mikroglia / perifera monocyter celltyper
Användningen av möss som uttrycker GFP under kontroll av den fraktalkin receptorn (CX3CR1)locus 46 möjliggör tillförlitlig identifiering av bosatt mikroglia, och robust GFP uttryck tillåter anmärkningsvärd in vivo visualisering 30-32,34,36. Här använder vi en stam av DBA / 2J möss, beräknad genom tillbakakorsning C57BL / 6.129P- CX3CR1 tm1Litt / J-möss 46 i DBA / 2J genetisk bakgrund 59. Perifera monocyter och makrofager, som kan invadera CNS under sjukdom eller skada, också uttrycka GFP tag 15,46,47.
Live imaging studier av mikroglia i neurodegenerativa näthinnan
Vår in vivo spårning av CX3CR1-GFP / + retinala celler genom att använda cSLO bygger på tidigare studier som övervakade förändringar i näthinnan GFP + cellantal efter akut skada i upp till 10 veckor 30-32,34,48. Här, vi visualisera CX3CR1-GFP / + mikroglia / perifera monocyter med cellulär upplösning genom månatliga cSLO avbildning av näthinnan under den tidiga utvecklingen av kronisk glaukom. ENdditionally använder vi sökarbilden automatiserade tröskel baserad analys för att detektera och kvantifiera cellstorleksändring och ombyggnad med tillräckligt spatial och temporal upplösning att övervaka förändringar i aktiverade och total mikroglia räknas inom enskilda ögon och mellan individer.
Tekniska begränsningar av cSLO avbildning av GFP + mikroglia i näthinnan
Vi hittade bildkvalitet för att vara konsekvent och reproducerbar, vilket framgår av en jämförelse av enstaka kontra fler xy punkt bilder som erhållits i en enda session (Figur 5). Men konsekvent och reproducerbar GFP + cell imaging förvärv, i en enda session och över tid, är kritiskt beroende på valet av stabila parametrar för fundus och fluorescens cSLO avbildning. Anpassning av ögat och optisk skiva till cSLO målet bestämmer likformigheten mättnadsnivå och fokus på konfokala plan intresse 49. Felaktiga och / eller icke-likformig specificatipå av mättnadsnivå kan generera artefaktuella variationer i GFP upptäckt, autofluorescens bakgrund och cell och berså upplösning. För att korrekt fokusera på mikroglia lokaliserade till nervfibrer och ganglion cellager, är det viktigt att anpassa och fokusera på de retinala blodkärlen och på axonal buntar på vitreal ytan av IR fundus avbildning. Detta ger ett referensplan för att lokalisera GFP + celler av FA. Det krävs ny inriktning som krävs för att växla från IR till FA kan styras genom förvärv av flera FA bilder med något olika djup (55-60 D) i varje experimentell session. Detta kan också bidra till att kompensera för anatomiska skillnader på grund av ålder, elev dilatation och patologi (optisk skiva utgrävning). Eftersom bildupplösning och cell detalj beror på den optimala specifikationen av mättnadsnivåer under hela fundus, och noggrann inriktning av ögat i förhållande till kameran 49, bildsekvenser förvärvas över tid för samma öga måste visa fundus IR-bilder med consistent och jämförbar fokus, belysning, upplösning och retinal fält span. Manuella räkningar av totalt GFP + cellantalet i bilder som förvärvats i en enda session (1,5-1,7 mm 2 av näthinnan, n = 13 näthinnor, i åldern 3-5 månader) bekräftade konsekvent och reproducerbar kvantifiering av cellularitet (3-4% variation, data visade). Detta är nödvändigt för bilder att vara mottaglig för GFP + celler segmente via tröskel analys baserad på en liknande intensitet intervall, och jämförelse av förändringar över tid.
Tröskel och morfometriska analyser av retinal mikroglia i levande cSLO bilder
Först nyligen har in vivo visualisering av hjärn mikroglia med hög cellulär upplösning av två-foton konfokalmikroskopi aktiverat kvantitativ analys av microglial soma och processparametrar, och diskrimineringen av morfologiskt aktiverade mikroglia 9,50. Såsom visas av dessa författare, är Somal storlek den mest iögonfallande morfologiskaparametern detekterbar över tiden genom levande två-foton-konfokal avbildning av hjärn mikroglia, med användning av iterativ intensitet baserad tröskling för att reducera signal-brusvariationer 9. Vidare Somal storlek ändras korrelerar med uppreglering av Iba1 expression i aktiverade celler 9. Här använder vi cSLO live-bilder och tillämpa jämförbar sekventiell segmentering av mikrogliaceller och somata, följt av morfometrisk analys för att kvantifiera antal av totalt och aktiverade CX3CR1-GFP + celler lokaliserade till näthinnan.
Vi använder specialiserad konfokal renderingsprogram (FluoRender) att segmentera GFP + celler i den centrala näthinnan. Dessa bilder är vidare trösklas med ett kommersiellt tillgängligt konfokal bildanalys paket, för att slutligen låta den automatiska segmentering och tröskelbaserad kvantifiering av Somal område. Vår sökarbilden analyser bekräftade användningen av soma storlek som en morfologisk metriska av microglial aktivering i levande bildanalys 9. Somaltröskelbaserade räkningar tillät karakterisering av mönster och ökningar av retinal microgliosis, som tidigare visats genom ex vivo bildanalys 50. Vi finner att cSLO upptäcker GFP + mikroglia med bästa upplösning och detaljrikedom i musen centrala näthinnan (<2 mm 2), där celler kan avbildas på samma konfokala plan. Mot näthinnan periferin visar fluorescenssignalen variabilitet och snedvridningar som förhindrar identiska bildbehandling och tröskel analys för GFP + celler detekteras i plattare centrala näthinnan. Slutligen visar vår protokoll som cSLO in vivo bildanalys av retinal mikroglia erbjuder en relativt hög genomströmning. Antalet parenkymal microglial som kan vara visuellt isolerade och kvantifieras i den centrala näthinnan varierade mellan ~ 200-300 totala celler, och ~ 10-180 aktiverade celler. Sålunda erbjuder mus retinal mikroglia en optimal befolkningen att studera in vivo deras förvandling och roller dnder patogenesen av neurodegeneration.
Tillämpning på andra CNS kroniska sjukdomar
De in vivo bildanalysmetoder som beskrivs här bör gälla att bedöma akuta eller kroniska microglial förändringar i andra mus retinala sjukdomar och skademodeller. Dessutom kan detta protokoll användas för att utvärdera näthinnans mikroglia / perifera monocyt förändringar till följd av kroniska CNS-sjukdomar, såsom Alzheimers, Parkinsons och multipel skleros, med tanke på att näthinnan och synnerven är riktade för neurodegeneration i dessa sjukdomar 51-56. I linje med detta, är användningen av levande upptäckt av näthinnan och ONH patologi för tidig Alzheimers sjukdom förvaltning under intensiv studie 54,57,58.
Sammanfattningsvis våra fynd tyder på att leva, längd spårning och kvantifiering av förändringar i näthinnans mikroglia siffror och morfologisk aktivering, kan tjäna som tillförlitlig neuroimaging biomarkörer för att upptäcka sjukdomsdebut och tidig utveckling. Dessa in vivo imaging och analysmetodik tillämpas på åldersrelaterad glaukom, och eventuellt andra neurodegenerativa sjukdomar som påverkar näthinnan och synnerven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000671 and 00582 | Mice are bred in house, introducing new breeders every 3 - 4 generations to prevent genetic drift. |
| 30½ G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe | BD, East Rutherford, NJ | 305106 and 309659 | |
| 2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T48402, 152463 and P4417 | Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4 °C for up to 1 week. |
| Heat therapy T/Pump | Gaymar Industries, Orchard Park, NY | TP-650 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 23-400-100 | |
| Tropicamide 1% | Bausch & Lomb, Rochester, NY | NDC 24208-585-64 | |
| PMMA contact lenses, 1.70 base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm thick center | Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK | G003709 | Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes. |
| HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software | Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA | Version 1.7.1.0 | |
| PowerPoint | Microsoft, Redmond, WA | Version 14.4.3 | |
| Adobe Photoshop | Adobe, San Jose, CA | Version CS3 | |
| FluoRender | Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah | Version 2.13 | Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html |
| NIS-Elements C | Nikon, Melville, NY | Version 4.30.01 |
References
- Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A.
- Jonas, R. A., et al. The spider effect: morphological and orienting classification of microglia in response to stimuli in vivo. PloS One. 7 (2), e30763 (2012).
- Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PloS One. 7 (2), 1-9 (2012).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Elmore, M. R., et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
- Solomon, J. N., et al. Origin and distribution of bone marrow-derived cells in the central nervous system in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 53, 744-753 (2006).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat. Neurosc. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Sapp, E., et al. Early and progressive accumulation of reactive microglia in the Huntington disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60 (2), 161-172 (2001).
- Maeda, J., et al. In vivo positron emission tomographic imaging of glial responses to amyloid-beta and tau pathologies in mouse models of Alzheimer's disease and related disorders. J. Neurosc. 31 (12), 4720-4730 (2011).
- Jacobs, A. H., Tavitian, B.
- Ouchi, Y., et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease. Ann. Neurol. 57 (2), 168-175 (2005).
- Fuhrmann, M., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
- Trapani, A., Palazzo, C., de Candia, M., Lasorsa, F. M., Trapani, G. Targeting of the translocator protein 18 kDa (TSPO): a valuable approach for nuclear and optical imaging of activated microglia. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1415-1428 (2013).
- Venneti, S., Lopresti, B. J., Wiley, C. A.
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat. Comm. 3 (1227), 1-15 (2012).
- Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), e17910 (2011).
- Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp. Neurol. 254 (214), 109-120 (2014).
- Nayak, D., Zinselmeyer, B. H., Corps, K. N., McGavern, D. B. In vivo dynamics of innate immune sentinels in the CNS. Intravital. 1 (2), 95-106 (2012).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), 1-16 (2010).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. J. Neurosci. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J. Vis. Exp. 19 (43), (2010).
- Alt, C., Runnels, J. M., L, T. G. S., P, L. C. In vivo tracking of hematopoietic cells in the retina of chimeric mice with a scanning laser ophthalmoscope. Intravital. 1 (2), 132-140 (2012).
- Eter, N., et al. In vivo visualization of dendritic cells, macrophages, and microglial cells responding to laser-induced damage in the fundus of the eye. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (8), 3649-3658 (2008).
- Liu, S., et al. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage. Investigative ophthalmology & visual science. 53, 6254-6262 (2012).
- Maeda, A., et al. Two-photon microscopy reveals early rod photoreceptor cell damage in light-exposed mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (14), E1428-E1437 (2014).
- Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
- Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45 (28), 3512-3519 (2005).
- Alt, C., Runnels, J. M., Mortensen, L. J., Zaher, W., Lin, C. P. In vivo imaging of microglia turnover in the mouse retina after ionizing radiation and dexamethasone treatment. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 55 (8), 5314-5319 (2014).
- Bosco, A., et al. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (4), 1437-1446 (2008).
- Anderson, M. G., et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30 (1), 81-85 (2002).
- Chang, B., et al. Interacting loci cause severe iris atrophy and glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 21 (4), 405-409 (1999).
- Smith, R. S., Korb, D., John, S. W. A goniolens for clinical monitoring of the mouse iridocorneal angle and optic nerve. Mol. Vis. 8, 26-31 (2002).
- Buckingham, B. P., et al. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28 (11), 2735-2744 (2008).
- Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 179 (7), 1523-1537 (2007).
- Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 171 (2), 313-325 (2005).
- Soto, I., et al. Retinal ganglion cells downregulate gene expression and lose their axons within the optic nerve head in a mouse glaucoma model. J. Neurosci. 28 (2), 548-561 (2008).
- Bosco, A., Steele, M. R., Vetter, M. L. Early microglia activation in a mouse model of chronic glaucoma. J. Comp. Neurol. 519 (4), 599-620 (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Broux, B., et al. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J. Autoimmun. 38 (1), 10-19 (2012).
- Paques, M., et al. In vivo observation of the locomotion of microglial cells in the retina. Glia. 58 (14), 1663-1668 (2010).
- Charbel Issa, P., et al. Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 53 (2), 1066-1075 (2012).
- Beynon, S. B., Walker, F. R. Microglial activation in the injured and healthy brain: what are we really talking about? Practical and theoretical issues associated with the measurement of changes in microglial morphology. Neuroscience. 225 (2012), 162-171 (2012).
- Chan, J. W. Recent advances in optic neuritis related to multiple sclerosis. Acta Ophthalmol. 90 (3), 203-209 (2012).
- Frost, S., Martins, R. N., Kanagasingam, Y. Ocular biomarkers for early detection of Alzheimer's disease. J. Alzheimer's Dis. 22 (1), 1-16 (2010).
- Guo, L., Duggan, J., Cordeiro, M. F. Alzheimer's disease and retinal neurodegeneration. Curr. Alzheimer Res. 7 (1), 3-14 (2010).
- Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 83 (9), 917-922 (2012).
- Kersten, H. M., Roxburgh, R. H., Danesh-Meyer, H. V. Ophthalmic manifestations of inherited neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 10 (6), 349-362 (2014).
- Kesler, A., Vakhapova, V., Korczyn, A. D., Naftaliev, E., Neudorfer, M. Retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 113 (7), 523-526 (2011).
- Petzold, A., et al. Optical coherence tomography in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 9 (9), 921-932 (2010).
- Satue, M., et al. Retinal thinning and correlation with functional disability in patients with Parkinson's disease. Br. J. Ophthalmol. 98 (3), 350-355 (2014).
- Bosco, A., Romero, C. O., Breen, K. T., Chagovetz, A. A., Steele, M. R., Ambati, B. K., Vetter, M. L. Neurodegeneration severity can be predicted from early microglia alterations monitored in vivo in a mouse model of chronic glaucoma. Dis Model Mech. , (2015).
