Konsentriske Gel System for å studere den Biofysikalsk rolle Matrix mikromiljøet på 3D-Cell Migration
Summary
De mekaniske egenskapene og mikrostrukturen av den ekstracellulære matriks sterkt påvirke 3D migrering av celler. En in vitro fremgangsmåte for å studere den tid og rom cellemigrering oppførsel i biophysically variable omgivelser, både befolkning og individuelle cellenivå, er beskrevet.
Abstract
Evnen av celler til å migrere er avgjørende i en rekke cellefunksjoner gjennom hele livet fra embryoutvikling og sårheling til tumormetastase og kreft. Til tross for intense forskningsinnsats, de grunnleggende biokjemiske og biofysiske prinsipper for cellemigrering er fortsatt ikke fullstendig forstått, spesielt i fysiologisk relevante tre-dimensjonale (3D) microenvironments. Her beskriver vi en in vitro analyse utformet for å tillate kvantitativ undersøkelse av 3D-cellemigrering atferd. Metoden utnytter cellens mechanosensing evne og tilbøyelighet til å migrere inn tidligere ledig ekstracellulære matrise (ECM). Vi bruker invasjonen av meget invasiv brystkreft celler, MDA-MB-231, i kollagen geler som et modellsystem. Spredningen av cellepopulasjon og migrasjons dynamikken i enkeltceller i løpet av uker med kultur kan overvåkes ved hjelp av levende celle bildebehandling og analysert for å trekke spatiotemporally-løst data. DessMetoden er lett å tilpasse for ulike ekstracellulære matriser, og dermed tilby en enkel, men effektiv måte å undersøke hvilken rolle biofysiske faktorer i mikromiljøet på celle migrasjon.
Introduction
Migrering av celler spiller en sentral rolle i forskjellige fysiologiske responser som embryonisk utvikling, hemostase og immunrespons, samt i patologiske prosesser slik som vaskulære sykdommer, inflammasjon, cancer og en. Dissekere de biokjemiske og biofysiske faktorer underliggende cellemigrasjon er derfor grunnleggende viktig ikke bare for å forstå de grunnleggende prinsippene for cellulære funksjoner, men også for å fremme ulike biomedisinske applikasjoner, for eksempel i tissue engineering, anti-metastaser og anti-inflammatorisk narkotika utvikling. Siden in vivo observasjon er teknisk utfordrende, har mye av arbeidet vært fokusert på in vitro gjentagelse av celle migrasjon.
In vitro-metoder for å studere cellemigrasjon har i stor grad blitt utviklet for analyser på todimensjonale (2D) overflater, særlig scratch eller sårheling analysen to. Slike analyser har enkel eksperimentelt oppsett, lett live-celle bildebehandling, og gir nyttig innsikt i ulike biokjemiske mekanismene bak cellemigrasjon. Men disse analysene ikke står for ekstracellulære matrise (ECM) arkitektur og ombygging, som er kritiske aspekter i forståelse in vivo migrasjon. Nylig er det blitt stadig mer verdsatt at en 3D-modell kultur, gjerne i kollagenbaserte matriser 3, tilveiebringer en plattform som bedre ligner in vivo situasjonen. Faktisk, celler vise migrational dynamikk som er forskjellig fra de på 2D overflater, spesielt på grunn av ulike dimensionality av miljøet fire. Videre har de biofysiske og mekaniske egenskaper av matrisen følsomt påvirke cellemigrering 5, blant annet i forbindelse med tumorcelle-invasjon 6.
Her presenterer vi en metode for å studere 3D celle migrasjon atferd i ECM med biofysiske egenskaper som kan være lett variert med forberedelser forhold. Celleneseedet i en "indre gel", og får lov til å slippe inn og invadere utgangspunktet acellulær "ytre gel". Metoden baserer seg på cellens evne til å gjenkjenne tilstedeværelsen av, og tilbøyelighet til å migrere inn, cellefrie områder i den ytre gel, som er nært knyttet til celle mechanosensing 7. I denne studien, ansetter vi kollagen-nettverk som de ECM'er invadert av svært invasiv brystkreft celler, MD-MBA-231. De mekaniske egenskapene og mikrostrukturen til både de indre og ytre geler kan være innstilt 8 og 9, karakterisert å oppnå fysiologisk relevante betingelser. Rekonstruksjon og analyse av celle spor tillate detaljert kvantitativ undersøkelse av tid og rom migrasjon atferd på både befolkningsnivå og enkelt celle nivå. Viktigere, oppsettet av den konsentriske gel system ligner in vivo vev topologi møtt av migrerende celler, spesielt invaderende kreftceller, og tilbyr dermed viktig innsikt itil de fysiske mekanismer for cellemigrasjon og metastase.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker W. Sun og K. Jansen for de kritiske diskusjonene, og erkjenner støtte av Nano Biomechanics Lab ved National University of Singapore. NAK erkjenner støtte av et Marie Curie IIF Fellowship.
Materials
| Cell culture incubator | Fisher Scientific Pte Ltd | Model: 371, S/No 318854-6055 | |
| Confocal microscope | Nikon A1R | Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluorescent CellTracker dye CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| Glass-bottom dish | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well |
| Hemocytometer | iN CYTO | DHC-N01 (Neubauer Improved) | |
| Microprocessor pH meter | Hanna Instruments | pH 211 | |
| Nutragen Collagen | Advanced BioMatrix | #5010-D | Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2) |
| Objective lens | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45. | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| pH meter | Sartorius | S/No 29153352 | Basic pH Meter PB-11 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 |
References
- Horwitz, R., Webb, D. Cell migration. Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration. Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).
- Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. New dimensions in cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).
- Grinnell, F., Petroll, W. M. Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration. Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).
- Achilli, M., Mantovani, D. Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation. Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).
- Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks. Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).
- Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments. Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).
- Wolf, K., et al. Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force. J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. Collective cell migration: a mechanistic perspective. Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Mouw, J. K., et al. Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression. Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres. Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).
- Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration. Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).
- Wolf, K., et al. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).
