التصوير كله والحيوان وتدفق Cytometric تقنيات CD8 + T الردود خلية التحليل من Antigen محددة بعد الجسيمات النانوية التطعيم
Summary
We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.
Abstract
Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a “pathogen-mimicking” nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.
Introduction
تطوير لقاح التقليدية وقد استخدمت أساسا للنهج العملي من التجربة والخطأ. ومع ذلك، مع التطورات الأخيرة في مجموعة واسعة من المواد الحيوية واكتشاف المحددات الجزيئية لتنشيط جهاز المناعة، أصبح من الممكن الآن لتصميم بعقلانية تركيبات اللقاح مع العظة الفيزيائية الحيوية والكيمياء الحيوية المستمدة من مسببات الأمراض 1،2. على وجه الخصوص، وقد تم فحص مختلف منصات توصيل الدواء الجسيمية الناقلين لقاح لأنها يمكن أن يشترك محملة مستضدات الوحيدات وكلاء مناعة وحماية مكونات لقاح من التدهور، وتعزيز تعاونهم التسليم لمستضد الخلايا تقديم (ناقلات الجنود المدرعة) المقيمين في الليمفاوية العقد (LNS)، وبالتالي تحقيق أقصى قدر من التحفيز المناعي وتفعيل 3-5. في هذا التقرير، وصفنا تركيب نظام جسيمات متناهية الصغر "محاكية الممرض"، ووصف-interbilayer crosslinked الحويصلات عديد الصفاحات (ICMVs)، والتي تم في السابق أثبتت بمثابة المنهاج لقاح فعالم للالاستنباط من قوة الخلايا اللمفاوية التائية السامة (CTL) والاستجابات المناعية الخلطية في كل النظامية والمخاطية المقصورات الأنسجة 6-9. على وجه الخصوص، والتطعيم مع ICMVs حققت عززت بشكل كبير من مستويات مفتش مصل ضد مستضد الملاريا، مقارنة مع التطعيم مع المواد المساعدة التقليدية (على سبيل المثال، الشب وMontanide) 7 وأيضا أثارت ردود CTL قوية ضد الخلايا السرطانية ونماذج التحدي الفيروسية في الفئران 9. هنا، وذلك باستخدام ICMVs كنظام جسيمات متناهية الصغر لقاح النموذج، وصفنا طرق لتوصيف من لقاح النانو الصيغ، بما في ذلك حجم الجسيمات والقياسات زيتا المحتملة وتتبع الاتجار الجسيمات إلى LNS استنزاف (dLNs) باستخدام التصوير متحد البؤر الأنسجة cryosectioned 7. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم وسيلة تستند التصوير كله والحيوان تحليل توسيع الردود CTL في الفئران بعد نقل بالتبني مستضد محددة CD8 + T الخلايا، معربا عن luciferase المراسل 9،10. وأخيرا، فإننا ديالكاتب تلطيخ tetramer الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs) لتقدير الطولي للاستجابات الخلايا T المحلية في تحصين الفئران مع النانوية 6،9.
ICMVs هي صياغة جسيمات متناهية الصغر القائم على الدهون توليفها من قبل الانصهار رقابة من الجسيمات الشحمية بسيطة في الهياكل عديد الصفاحات، والتي يتم بعد ذلك ثابتة كيميائيا من قبل جماعات رئيس فوسفورية-functionalized maleimide عبر ربط داخل طبقات الدهون مع ثنائي الثيول crosslinkers 6. مرة واحدة وقد تم تجميع ICMVs، وهو جزء صغير من الجسيمات النانوية يمكن أن تستخدم لتحديد حجم الجسيمات وزيتا المحتملة (أي تهمة سطح جزيئات) مع (DLS) نظام تشتت الضوء الحيوي ومحلل المحتملة زيتا. DLS يقيس التغيرات في تشتت الضوء في تعليق الجسيمات، مما يتيح تحديد معامل الانتشار وحجم الهيدروديناميكية الجسيمات 11. تحقيق ثابت حجم الجسيمات من دفعة لدفعة التوليف أمر بالغ الأهميةمنذ حجم الجسيمات هي واحدة من العوامل الرئيسية التي تؤثر تصريف الليمفاوي من جزيئات اللقاح لdLNs وامتصاص الخلوية لاحق من ناقلات الجنود المدرعة 12،13. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الحصول على إمكانات زيتا من خلال قياس سرعة الجسيمات عند تطبيق تيار كهربائي، والذي يسمح بتحديد التنقل الكهربي من الجسيمات والجسيمات سطح تهمة 11. ضمان القيم المحتملة زيتا ثابت من الجزيئات المهم منذ تهمة سطح جزيئات يحدد الاستقرار الغروية، التي لديها تأثير مباشر على تشتت الجسيمات أثناء التخزين وبعد المجراة الإدارة 14،15. من أجل تتبع توطين الجسيمات لdLNs، ICMVs يمكن المسمى مع fluorophores المطلوب بما في ذلك الأصباغ محبة للدهون ومولدات المضادات الموسومة تساهميا. بعد التطعيم، والفئران يمكن أن يتم التخلص عند نقاط زمنية مختلفة، dLNs مقطوعة، cryosectioned، وتحليلها مع المجهر متحد البؤر. هذا الأسلوب يسمح التصور من دري اللمفاوينينغ كل من ناقلات اللقاح جسيمات متناهية الصغر والمستضد إلى dLNs. بالإضافة إلى ذلك يمكن أن تكون ملطخة أقسام الأنسجة مع fluorescently المسمى الأجسام المضادة واستخدامها للحصول على مزيد من المعلومات، مثل أنواع من الخلايا المرتبطة مستضد وتشكيل مراكز جرثومي كما بينا سابقا 7.
مرة واحدة هو الأمثل لتجميع الجسيمات وأكد الاتجار إلى dLNs، فمن المهم للتحقق من صحة الاستنباط من التوسع في الجسم الحي CTL. من أجل تحليل الاستنباط من CD8 + T الخلايا مستضد معين ردا على التطعيم جسيمات متناهية الصغر، ونحن قد تستخدم مستضد نموذج، ألبومين البيض (OVA)، مع OVA 257-264 الببتيد (SIINFEKL) سائد مناعيا CD8 + T الخلايا حاتمة، والذي يسمح التحاليل المناعية مفصلة من استجابات الخلايا T مستضد معين الاولي 16،17 تطوير لقاح. على وجه الخصوص، لاستجواب ديناميات التوسع والهجرة من CD8 + T الخلايا مستضد معين، ونحن قد ولدتالمزدوج المعدلة وراثيا نموذج الفأر من خلال عبور يراعة luciferase المراسل، معربا عن الفئران المعدلة وراثيا (لوك) مع OT-I الفئران المعدلة وراثيا التي تمتلك خلايا CD8 + T مع T-مستقبلات الخلايا (TCR) محدد لSIINFEKL (بالتعاون مع H-2K ب). من هذه الفئران OT-I / لوك، معربا عن luciferase المراسل، خلايا OT-I CD8 + T يمكن أن تكون معزولة وعلى استعداد لنقل بالتبني في ساذجة C57BL / 6 الفئران. مرة واحدة المصنف، والتحصين الناجح مع النانوية التي تحتوي على OVA يؤدي إلى توسيع الخلايا T نقل، والتي يمكن تتبعها من خلال رصد إشارة تلألؤ بيولوجي مع كامل 9،10 نظام التصوير الحيوانية. وقد استخدمت هذه التقنية التصوير كامل الجسم غير الغازية مع غيرها من المضادات الفيروسية أو ورم في الماضي 18-20، العمليات التي ينطوي عليها توسيع الخلايا التائية في الأنسجة اللمفاوية وتوزيعها على الأنسجة الطرفية بطريقة طولية يكشف.
مكملة لتحليل adoptively CD8 + T الخلايا مستضد معين نقلها، endogenoاستجابات الخلايا لنا T وظيفة يمكن أن يتم فحص التطعيم مع مجمع الببتيد رئيسي التوافق النسيجي (MHC) tetramer فحص 21، الذي مجمع tetramer الببتيد MHC، التي تتألف من أربعة الموسومة fluorophore MHC من الدرجة I جزيئات محملة الحواتم الببتيد، يعمل لربط TCR والتسمية CD8 + T الخلايا بطريقة مستضد معين. وtetramer مقايسة الببتيد MHC لا يمكن أن يؤديها إما في الدراسات التشريح النهائية لتحديد CD8 + T الخلايا مستضد معين في اللمفاوية والأنسجة الطرفية أو في الدراسات الطولية مع الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs) تم الحصول عليها من توجه الدم التسلسلي. بعد تلطيخ الخلايا الليمفاوية مع الببتيد MHC tetramer، تحليل التدفق الخلوي يتم تنفيذ للتحليلات مفصلة عن النمط الظاهري من CTLs أو الكمي من وتيرتها بين خلايا CD8 + T.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف بروتوكول المنصوص عليها في هذه المادة توليف وتوصيف نظام جديد جسيمات متناهية الصغر القائم على دهون، ووصف ICMVs، ويوفر عملية التحقق من صحة فعالية تركيبات لقاح القائم على جسيمات متناهية الصغر للحث على CD8 + T استجابات الخلايا مستضد معين. اكتمال ICMV التوليف في كل حالة الما?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني للصحة منح 1K22AI097291-01 والمركز الوطني للنهوض بالحركة العلوم من المعاهد الوطنية للصحة في إطار جائزة عدد UL1TR000433. علينا أيضا أن نعترف الأستاذ داريل ايرفين في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا والبروفيسور ماتياس ستيفان في مركز فريد هاتشينسون للسرطان لمساهمتهم في الأعمال الأولية على لقاح النانوية وOT-I / لوك الفئران المعدلة وراثيا.
Materials
| 1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules | |||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
| Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| 20 mL glass vials | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny Vacuum Oven | VWR | 414004-580 | |
| Ovalbumin (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propane (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125W/20kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy | |||
| 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT freezing medium | VWR | 25608-930 | |
| Tissue Cryomolds | VWR | 25608-922 | |
| 3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging | |||
| C57BL/6 mice | Jackson | 000664 | |
| Albino C57BL/6 mice | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 mice | Jackson | 003831 | |
| 70 μm nylon strainer | BD | 352350 | |
| EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell | 19853 | |
| IVIS® whole animal imaging system | Perkin Elmer | ||
| 4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells | |||
| K2EDTA tubes | BD | 365974 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Anti-CD16/32 Fc Block | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetramer | MBL | TS-5001-1C | |
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | FlowJo |
References
- Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
- Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
- Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
- Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
- Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
- Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
- Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
- DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
- Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130 (2013).
- Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
- Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
- Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
- Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
- Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
- Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
- Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
- Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
- Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771 (2012).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765 (2013).
- Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F., Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. , 476-502 (2009).
- Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740 (2008).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
- Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
- Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
- Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
- Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
- Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465 (2013).
- Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
- Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
- Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
- Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
- Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
- Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
- Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
- Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
- Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
- Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
- Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105 (2013).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627 (2014).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).
