Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung
Summary
We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.
Abstract
Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a “pathogen-mimicking” nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.
Introduction
Traditionelle Impfstoffentwicklung hat überwiegend beschäftigt die empirischen Ansatz von Versuch und Irrtum. Jedoch mit der jüngsten Entwicklung einer breiten Palette von Biomaterialien und Entdeckung von molekularen Determinanten Aktivierung des Immunsystems ist es nun möglich, rationell Vakzinformulierungen mit biophysikalische und biochemische Hinweise von Pathogenen 1,2 abgeleitet. Insbesondere wurden verschiedene partikulären Drug-Delivery-Plattformen als Impfstoffträger, da sie mit Untereinheiten-Antigenen und immunstimulierende Mittel gemeinsam geladen werden untersucht, Impfstoffkomponenten Schutz vor Abbau, verbessern und ihre Co-Lieferung an präsentierenden Zellen Antigen (APCs) mit Wohnsitz in der Lymphe Knoten (LNS), damit die Maximierung Immunstimulation und Aktivierung 3-5. In diesem Bericht beschreiben wir die Synthese eines "pathogen-imitiert" Nanopartikel-System, genannt interbilayer netzten multilamellare Vesikel (ICMVs), die zuvor als ein potenter Impfstoff platfor demonstriert wordenm für die Auslösung robust zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) und humorale Immunreaktionen sowohl systemische und Schleimhautgewebe Fächer 6-9. Insbesondere erzielte Impfung mit ICMVs wesentlichen Serum-IgG-Ebenen verstärkt gegen eine Malaria-Antigen, gegenüber der Impfung mit üblichen Hilfsmitteln (zB Alaun und Montanide) 7 und auch ausgelöste starke CTL-Antworten gegen Tumorzellen und virale Herausforderung Modellen in Mäusen 9. Hier mit ICMVs als Modell-Impfstoff Nanopartikelsystem beschreiben wir Methoden zur Charakterisierung von Nano-Impfstoff-Formulierungen, einschließlich Partikelgröße und Zetapotentialmessungen und Verfolgung von Menschenhandel zu Partikel Ablassen LNs (DLNs) nutzen konfokale Bildgebung von Gewebe gefriergeschnitten 7. Zusätzlich stellen wir eine Ganztier-Bildgebung basierte Verfahren zum Analysieren Expansion von CTL-Antworten in Mäusen nach dem adoptiven Transfer von Luciferase-exprimierende Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen 9,10. Schließlich definieren wirRitz Tetramerfärbung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu Längs Quantifizierung der endogenen T-Zell-Antworten in Mäusen, die mit Nanopartikeln 6,9 geimpft.
ICMVs eine lipidbasierte Nanopartikel-Formulierung durch kontrollierte Fusion von Liposomen einfach synthetisiert in multilamellaren Strukturen, die dann chemisch durch Vernetzung Maleimid-funktionalisierten Phospholipid-Kopfgruppen in Lipidschichten mit Dithiol Vernetzer 6 stabilisiert werden. Sobald ICMVs synthetisiert werden, kann ein kleiner Anteil von Nanopartikeln verwendet werden, um Teilchengröße und Zeta-Potential (das heißt, die Oberflächenladung der Teilchen) mit einer dynamischen Lichtstreuung (DLS) System und ein Zeta-Potential-Analysegerät ermitteln. DLS misst Änderungen der Lichtstreuung in Partikelsuspensionen, was die Bestimmung des Diffusionskoeffizienten und die hydrodynamische Größe von Partikeln 11. Konsistente Teilchengröße von Charge zu Charge Synthese kritischDa Teilchengröße gehört zu den wichtigsten Faktoren, die Lymphdrainage Impfstoffpartikel DLNs und anschließende zelluläre Aufnahme durch APCs 12,13. Zusätzlich kann Zetapotential durch Messen der Partikelgeschwindigkeit, wenn ein elektrischer Strom angelegt wird, die Bestimmung der elektrophoretischen Beweglichkeit von Partikeln und Partikeloberflächenladung 11 können erhalten werden. Konsistente Werte Zeta-Potential von Teilchen ist wichtig, da Oberflächenladung der Teilchen bestimmt, kolloidale Stabilität, die direkten Einfluss auf die Dispersion während der Lagerung und nach der Verabreichung in vivo 14,15 hat. Um die Partikellokalisierungs zu DLNs verfolgen, können ICMVs mit gewünschten Fluorophore einschließlich lipophilen Farbstoffen und kovalent-markierten Antigene bezeichnet werden. Nach der Immunisierung können Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten getötet werden, DLNs reseziert gefriergeschnitten und mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung von lymphatischen draining sowohl der Nanopartikel Impfstoffträger und Antigen DLNs. Die Gewebeschnitte können zusätzlich mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern und verwendet, um weitere Informationen zu erhalten, wie die Typen von Zellen mit dem Antigen, und die Bildung von Keimzentren assoziiert gefärbt, wie wir vorher 7 gezeigt werden.
Sobald die Partikelsynthese optimiert und Handels den DLNs bestätigt wird, ist es wichtig, Auslösung in vivo CTL-Expansion zu validieren. Um Hervorrufen von antigenspezifischen CD8 + -T-Zellen als Reaktion auf die Impfung Nanopartikel zu analysieren, haben wir eine Modellantigen, Ovalbumin (OVA) verwendet, die mit OVA 257-264-Peptid (SIINFEKL) immun CD8 + T-Zell-Epitop, das detaillierte immunologischen Analysen ermöglicht von Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten für die anfängliche Entwicklung von Impfstoffen 16,17. Insbesondere, um die Dynamik der Expansion und Migration von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen zu befragen, erzeugten wir haben eindoppelt transgenen Mausmodell durch Kreuzung Glühwürmchen-Luciferase-exprimierenden transgenen Mäusen (Luc) mit OT-I-transgenen Mäusen, die CD8 + T-Zellen mit T-Zell-Rezeptor (TCR) spezifisch für SIINFEKL (in Verbindung mit H-2K b) besitzen. Aus diesen OT-I / Luc Mäusen, Luciferase-exprimierenden kann OT-I CD8 + -T-Zellen isoliert und zur adoptiven Transfer in naiven C57BL / 6-Mäusen hergestellt werden. Sobald ausgesät werden erfolgreiche Immunisierung mit OVA haltigen Nanopartikeln in Expansion der übertragenen T-Zellen, die durch die Überwachung des Biolumineszenz-Signals mit einem ganzen Tier Abbildungssystems 9,10 verfolgt werden können führen. Diese nicht-invasive Ganzkörper-Bildgebung Technik hat mit anderen viralen oder Tumorantigene, die in der Vergangenheit 18-20 angewandt, sodass Prozesse in T-Zell-Expansion in Lymphgewebe und Verbreitung in die peripheren Gewebe in Längs Weise beteiligt.
Komplementär zur Analyse adoptiv transferierte Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen, endogenous T-Zell-Reaktionen nach der Impfung mit dem Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Tetramer-Assay 21, bei dem ein Peptid-MHC-Tetramer-Komplex, bestehend aus vier Fluorophor-markierten MHC-Klasse I-Moleküle mit Peptid beladen Epitope untersucht werden, wird verwendet, TCR und Etiketten CD8 + T-Zellen in einer Antigen-spezifischen Art und Weise zu binden. Der Peptid-MHC-Tetramer-Assay kann entweder im Terminal Nekropsie Studien zur Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen in lymphoiden und peripheren Gewebe zu identifizieren oder in Langzeitstudien mit peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von der seriellen Blutabnahmen durchgeführt werden, erhalten. Nach Färbung Lymphozyten mit Peptid-MHC-Tetramer, Durchflusszytometrie Analyse wird für detailliertere Analysen auf den Phänotyp von CTLs oder Quantifizierung ihrer Häufigkeit bei CD8 + T-Zellen durchgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in diesem Artikel beschriebenen Protokoll beschreibt die Synthese und Charakterisierung eines neuen lipidbasierte Nanopartikel System bezeichnet ICMVs und liefert das Verfahren zur Überprüfung der Wirksamkeit der Nanopartikel-Impfstoffformulierungen zu Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten induzieren. ICMV Synthese in allen wässrigen Zustand, was ein großer Vorteil ist, verglichen mit anderen gemeinhin verwendeten polymeren Nanopartikelsysteme (zB Poly (lactid-co-glycolid) Säurepartikel), die typi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch das National Institute of Health gewähren 1K22AI097291-01 und von der Nationalen Zentrum für die Förderung der Translational Sciences der National Institutes of Health unter Preis Anzahl UL1TR000433. Wir erkennen auch Prof. Darrell Irvine am MIT und Prof. Matthias Stephan am Fred Hutchinson Cancer Center für ihren Beitrag auf der ersten Arbeiten auf den Impfstoff Nanopartikeln und OT-I / Luc transgenen Mäusen.
Materials
| 1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules | |||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
| Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| 20 mL glass vials | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny Vacuum Oven | VWR | 414004-580 | |
| Ovalbumin (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propane (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125W/20kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy | |||
| 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT freezing medium | VWR | 25608-930 | |
| Tissue Cryomolds | VWR | 25608-922 | |
| 3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging | |||
| C57BL/6 mice | Jackson | 000664 | |
| Albino C57BL/6 mice | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 mice | Jackson | 003831 | |
| 70 μm nylon strainer | BD | 352350 | |
| EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell | 19853 | |
| IVIS® whole animal imaging system | Perkin Elmer | ||
| 4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells | |||
| K2EDTA tubes | BD | 365974 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Anti-CD16/32 Fc Block | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetramer | MBL | TS-5001-1C | |
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | FlowJo |
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