JoVE Journal > Immunology and Infection
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Abstract
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Immunology and Infection

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Published: April 29, 2015
doi:
10.3791/52771
,
1Department of Pharmaceutical Sciences,University of Michigan, 2Biointerfaces Institute,University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering,University of Michigan

Summary

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Abstract

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a “pathogen-mimicking” nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

Introduction

Desenvolvimento tradicional vacina tem utilizado, principalmente, a abordagem empírica de tentativa-e-erro. No entanto, com o recente desenvolvimento de uma grande variedade de biomateriais e descoberta de determinantes moleculares de activação imunitária, é agora possível conceber racionalmente formulações de vacinas com pistas biofísicas e bioquímicas derivados de patogénios 1,2. Em particular, várias plataformas de entrega de droga de partículas foram examinados como transportadores de vacinas uma vez que podem ser co-carregadas com antigénios de subunidade e agentes imunoestimulantes, proteger os componentes da vacina contra a degradação, e aumentar a sua co-entrega a células apresentadoras de antigénio (APCs), residente em linfa nodos (LNs), maximizando assim a estimulação e activação imunitária 3-5. Neste relatório, descreve-se a síntese de um sistema de nanopartículas "-imitando agente patogénico", denominados interbilayer reticulado vesículas multilamelares (ICMVs), que tenham sido previamente demonstrado como uma vacina potente Platform para elicitação de robusto de linfócitos T citotóxicos (CTL) e respostas imunitárias humorais em ambos os compartimentos dos tecidos das mucosas e sistémicas 6-9. Em particular, a vacinação com ICMVs alcançado substancialmente melhorada níveis de IgG no soro contra um antigénio da malária, em comparação com a vacinação com adjuvantes convencionais (por exemplo, alúmen e Montanide 7) e também induziu respostas CTL potentes contra células tumorais e modelos de desafio virais em ratinhos 9. Aqui, usando ICMVs como um sistema de nanopartículas vacina modelo, descrevem métodos para caracterização de nano-vacinais formulações, incluindo tamanho de partícula e medições de potencial zeta e monitoramento do tráfico de partículas para linfonodos drenantes (dLNs) utilizando confocal imagem de tecidos criosseccionada 7. Além disso, apresenta-se um método baseado no de imagem inteira em animais de análise de expansão de respostas por CTL em ratinhos após a transferência adoptiva de células específicas para o antigénio T CD8 + que expressam luciferase 9,10. Finalmente, deescriba tetrâmero coloração de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) para quantificação longitudinal de respostas de células T endógenas em ratinhos vacinados com nanopartículas 6,9.

ICMVs são uma formulação de nanopartículas à base de lípidos sintetizados por fusão controlada de lipossomas simples em estruturas multilamelares, que são então estabilizadas quimicamente por grupos de cabeça de fosfolípidos de reticulação funcionalizado com maleimida dentro camadas lipídicas com ditiol reticuladores 6. Uma vez ICMVs são sintetizados, uma pequena fracção de nanopartículas podem ser usadas para determinar o tamanho de partícula e potencial zeta (isto é, carga de superfície das partículas), com um sistema de dispersão de luz dinâmica (DLS), e um analisador de potencial zeta. DLS medidas de mudanças na dispersão de luz em suspensões de partículas, permitindo a determinação do coeficiente de difusão e o tamanho hidrodinâmico de partículas 11. Atingir o tamanho de partícula consistente de lote para lote é crítica sínteseuma vez que o tamanho de partícula é um dos principais factores que influenciam a drenagem linfática das partículas de vacinas para dLNs e subsequente absorção celular por APCs 12,13. Além disso, o potencial zeta pode ser obtido por medição da velocidade das partículas, quando uma corrente eléctrica é aplicada, o que permite a determinação da mobilidade electroforética das partículas e superfície das partículas de carga 11. Assegurar valores de potencial zeta consistentes de partículas é importante uma vez que a carga superficial das partículas determina a estabilidade coloidal, o que tem um impacto directo sobre a dispersão das partículas durante o armazenamento e após a administração in vivo 14,15. A fim de controlar a localização das partículas para dLNs, ICMVs pode ser marcado com fluoróforos desejados, incluindo corantes lipofílicos e antigénios covalentemente marcados. A seguir à imunização, os ratos podem ser sacrificados em vários pontos temporais, dLNs ressecado, criosseccionada, e analisados ​​com microscopia confocal. Esta técnica permite a visualização de drai linfáticoNing de ambos os veículos de vacina para antigénio de nanopartículas e dLNs. As secções de tecido podem ser adicionalmente coradas com anticorpos marcado por fluorescência e utilizada para obter mais informação, tais como tipos de células associadas com o antigénio e a formação de centros germinais como mostrámos anteriormente 7.

Uma vez que a síntese de partículas é optimizada e tráfico para os dLNs é confirmada, é importante para validar elicitação de expansão de CTL in vivo. A fim de analisar a elicitação de células específicas para o antigénio T CD8 + em resposta à vacinação de nanopartículas, nós utilizamos um modelo de antigénio, ovalbumina (OVA), 257-264 péptido com OVA (SIINFEKL) epítopo imunodominante de células T CD8 +, o que permite que as análises imunológicas detalhados de respostas de células T específicas para o antigénio para o desenvolvimento de vacinas inicial 16,17. Em particular, para interrogar a dinâmica de expansão e migração de células específicas para o antigénio T CD8 +, que geraram ummodelo de ratinho transgénico duplo da luciferase do pirilampo por cruzamento de ratinhos transgénicos que expressam (Luc) com OT-I ratinhos transgénicos que possuem células T CD8 + com o receptor de células T (TCR) específico para SIINFEKL (em associação com H-2K b). A partir destes ratinhos OT-I / Luc, que expressam luciferase, as células AT-I T CD8 + pode ser isolado e preparado para transferência adoptiva para naive C57BL / 6. Uma vez semeadas, a imunização bem sucedida com nanopartículas contendo OVA resultará na expansão das células T transferidas, que podem ser controladas através da monitorização do sinal de bioluminescência com um sistema de imagem de animais 9,10 todo. Esta técnica de imagem não invasiva de corpo inteiro foi usado com outros antigénios virais ou tumorais no passado 18-20, processos envolvidos na expansão das células T em tecidos linfóides e difusão para os tecidos periféricos de um modo longitudinal revelando.

Complementar para análise de adoptivamente células específicas de antigénio transferidos T CD8 +, endógenoas respostas das células T após vacinação nos pode ser examinado com o complexo de péptido-histocompatibilidade principal (MHC) de ensaio de tetrâmero 21, em que um complexo péptido-MHC de tetrâmero, que consiste de quatro marcado com fluoróforo do MHC de classe I de moléculas carregadas com epítopos de péptidos, é empregue TCR se ligar e marcar as células T CD8 + de um modo específico do antigénio. O ensaio de tetrâmero de péptido-MHC pode ser realizada tanto em estudos de necropsia terminais para identificar as células T CD8 + específicas para o antigénio em linfóides e tecidos periféricos ou em estudos longitudinais com células mononucleares do sangue periférico (PBMC) obtidas a partir de sangue em série chama. Após a coloração de linfócitos com péptido-MHC de tetrâmero, análise de citometria de fluxo é realizada por análises detalhadas sobre o fenótipo dos CTL ou quantificação da sua frequência entre as células T CD8 +.

Protocol

Todas as experiências descritas neste protocolo foi aprovado pelo Comitê Universidade de uso e cuidados dos Animais (UCUCA) na Universidade de Michigan e realizado de acordo com as políticas e diretrizes estabelecidas. 1. Síntese e Caracterização de ICMVs Co-carregado com proteína Antígeno e Adjuvante Moléculas Mistura 1: 1 de razão molar de 1,2-dioleoyl- sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoyl–sn-glicero-3-phosphoethanolamine- N – [4- (p</e…

Representative Results

Os passos envolvidos na síntese de ICMVs estão ilustrados na Figura 1 6. Resumidamente, uma película de lípido contendo quaisquer fármacos lipofílicos ou corantes fluorescentes é hidratado na presença de drogas hidrofílicas. Os catiões divalentes, tais como Ca 2+, são adicionados à unidade de fusão de lipossomas aniónicos em vesículas multilamelares. Ditiol agente de reticulação, tal como DTT, é adicionado a "staple" lípidos funcionalizado com maleimida…

Discussion

O protocolo fornecido neste artigo descreve a síntese e caracterização de um novo sistema de nanopartículas à base de lípidos, denominado ICMVs, e fornece o processo de validação da eficácia de formulações de vacinas à base de nanopartículas para induzir respostas de CD8 +, células T específicas de antigénio. ICMV síntese é completada em todas as condições aquosa, o que é uma grande vantagem em comparação com outros sistemas habitualmente utilizados nanopartículas poliméricas (por exemplo,</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde conceder 1K22AI097291-01 e pelo Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translational dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número UL1TR000433. Nós também reconhecemos Prof. Darrell Irvine no MIT e Prof. Matthias Stephan no Fred Hutchinson Cancer Center por sua contribuição no trabalho inicial sobre as nanopartículas de vacinas e camundongos transgênicos OT-I / Luc.

Materials

1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) Avanti Polar Lipids, INC. 870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, INC. 850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) Avanti Polar Lipids, INC. 699800
20 mL glass vials Wheaton 0334125D
Symphny Vacuum Oven VWR 414004-580
Ovalbumin (OVA) Worthington 3054
Bis-Tris Propane (BTP) Fisher BP2943
Q125 Sonicator (125W/20kHz) Qsonica Q125-110
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) Laysan Bio MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP  Malvern
ZetaSizer Cuvettes Malvern DTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) Life Technologies D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) Life Technologies A37571
Tissue-Tek OCT freezing medium  VWR 25608-930
Tissue Cryomolds VWR 25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 mice Jackson 000664
Albino C57BL/6 mice Jackson 000058
OT-1 C57BL/6 mice Jackson 003831
70 μm nylon strainer BD 352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell 19853
IVIS® whole animal imaging system Perkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubes BD 365974
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01 
Anti-CD16/32 Fc Block Ebioscience 14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer MBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APC BD 553031
Anti-CD44-FITC BD 553133
Anti-CD62L-PECy7 Ebioscience 25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) SIGMA D8417-10MG
CyAn Flow Cytometer Beckman Coulter
FlowJo Software FlowJo
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Ochyl, L. J., Moon, J. J. Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination. J. Vis. Exp. (98), e52771, doi:10.3791/52771 (2015).
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