Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

عالية الإنتاجية قياس خارج الخلية DNA الإصدار والكمي NET تشكيل في العدلات الإنسان Published: June 18, 2016 doi: 10.3791/52779
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1
1Department of Infectious Diseases, University of Georgia
* These authors contributed equally

Protocol

وافق مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة جورجيا دراسة موضوع الإنسان لجمع الدم المحيطي من المتطوعين الأصحاء (أوغ # 2012-10769-06). وقعت 5،7،8 متطوعي شكل الموافقة المسبقة المطلوبة قبل سحب الدم. البحث المنجز في هذه المقالة هو في الامتثال للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للبحوث الطبية التي تجرى على البشر من إعلان هلسنكي.

1. عزل العدلات من الدم المحيطي الإنسان (الشكل 1)

ملاحظة: هناك عدة طرق لعزل العدلات من الدم المحيطي. وينص البروتوكول التالية احتمال واحد. هذا البروتوكول ينتج أعدادا كبيرة من العدلات غير المفعلة البشرية القادرة على إطلاق المستجدة على التحفيز الخارجي. استخدام 40 مل من الدم الكامل تم الحصول عليها من المتطوعين الأصحاء بواسطة بزل الوريد. 7،9

  1. قسامة 20 مل من الدم الى اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل. إضافة 10 مل 6٪ ديكستران. المزيج بلطف.
  2. بعد 20 دقيقة من نقل الكريات البيض-ريكح المرحلة العليا من دون أخذ أي خلايا الدم الحمراء مكعبات في نظيفة أنابيب مخروطية 50 مل، وملء مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج 10 دقيقة. Resuspend بيليه في 4 مل العقيمة برنامج تلفزيوني.
  4. إعداد 5 خطوات Percoll التدرج من 85٪ -80٪ ​​-75٪ -70٪ -65٪ في غضون 15 مل أنابيب مخروطية وطبقة 2 مل تعليق الكريات البيض على رأس كل منهما التدرج.
  5. الطرد المركزي 800 x ج لمدة 30 دقيقة مع الفرامل خارج.
  6. جمع كل الخلايا (العدلات) في الطبقات في 75٪ / 80٪ و 70٪ واجهة / 75٪.
  7. غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني (350 x ج، 10 دقيقة، RT) وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.

2. قياس حركية خارج الخلية DNA الإصدار باستخدام صفيحة مقياس التألق

ملاحظة: هذه الطريقة يمكن قياس التغيرات في مضان من غشاء كتيمة صبغ يدل على الافراج عن الحمض النووي على شكل صفيحة 96-جيدا ملزم الحمض النووي (الشكل 2).

  1. إعداد تعليق العدلات في المتوسط ​​فحص (HBSS +1٪ (ت / ت) ذاتي المصل + 5 الجلوكوز ملم) بتركيز 2 × 10 6 خلية / مل.
  2. إضافة 5 مكرومول / L للغشاء كتيمة صبغ الحمض النووي ملزم. المزيج بلطف.
  3. العدلات الإنسان قسامة (50 ميكرولتر / جيد) على 96-جيدا الأسود، أسفل شفافة microplates. تأكد من وسيلة فحص يغطي الجزء السفلي بأكمله من البئر. إن لم يكن، اضغط على لوحة بلطف على الجانب.
  4. الاحماء لوحة تحتوي العدلات لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. في هذه الأثناء إعداد الحلول من المحفزات في ضعف تركيزات النهائية لاستخدامها (في 37 ° C فحص الحار المتوسطة). كما تستخدم عنصر تحكم NET إيجابية العدلات الإنسان مع 100 نيوتن متر phorbol-ميريستيت خلات (سلطة النقد الفلسطينية) لمدة 4 ساعة لإطلاق سراح القصوى NET. 5،8 سلطة النقد الفلسطينية التحفيز لمدة 4 ساعة يضمن أقصى الإفراج NET في حين لا تزال عفوية تشكيل NET انخفاض 5،8.
  6. إعداد مقياس التألق صفيحة لقياس (4 ساعات، 37 درجة مئوية، 530 نانومتر لإثارة و 590 نانومتر للانبعاثات). </ لى>
  7. تحفيز العدلات بإضافة 50 ميكرولتر حل حافزا ل50 تعليق العدلة ميكرولتر. استخدام 0.5 ميكروغرام / مل سابونين في بئر واحدة لقياس القصوى إشارة إطلاق الحمض النووي.
  8. وضع لوحة في القارئ وقياس التغيرات في مضان لمدة 4 ساعة في كل دقيقة 2 مع أي اهتزاز.
  9. لتحليل البيانات، وحساب الزيادات طبيعية في مضان مع مرور الوقت.
    1. مضان خط الأساس طرح من القيم نقطة النهاية لجميع الآبار بما في ذلك سابونين (الشكل 2A، B). وينبغي أن يكون الارتفاع في مضان سابونين أعلى إشارة. يشار إليها باسم "الافراج عن الحمض النووي القصوى" (الشكل 2A).
    2. حساب النسب المئوية لإطلاق الحمض النووي في العينات المجهولة بقسمة زيادات في مضان من العينات المجهولة من قبل الافراج عن الحمض النووي القصوى.
    3. النتائج متوسط ​​مكررات وتمثل هذه الاتهامات بأنها "٪ من إطلاق الحمض النووي القصوى" (الشكل 2C).

3. الكميات من نموذج NETأوجه من الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي والحمض النووي HNE-ELISA فحوصات

ملاحظة: هذه المقايسات المعدلة (MPO-DNA) أو المنشأة (HNE-DNA) في المختبر لدينا quantitate تشكيل NET عن طريق قياس مستويات MPO-DNA والمجمعات HNE-DNA 5.

  1. معطف 96-جيدا قدرة لوحات ELISA بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة القبض على (50 ميكرولتر / جيد) ملزمة عالية: مكافحة MPO (1: 2000 تمييع) أو مكافحة HNE (1: 2000).
  2. لوحات غسل ELISA ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (200 ميكرولتر / جيد) ومنعها مع 5٪ BSA و 0.1٪ ألبومين المصل البشري لمدة 2 ساعة على RT (200 ميكرولتر / جيد). يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  3. العدلات البذور على 96-جيدا microplates في مناطق ذات كثافة من 100000 خلية / جيدا في 100 متوسطة ميكرولتر الفحص، وتحفيز تشكيل NET. احتضان الخلايا: 4 ساعات لمدة 37 درجة مئوية.
  4. إجراء عملية الهضم الدناز محدود بإضافة 2 U / الدناز ميليلتر supernatants العدلة، مزجها جيدا. الاحتفاظ بها في RT.
  5. وقف الدناز بعد 15 دقيقة وذلك بإضافة 11 ميكرولتر 25 ملي EGTA (تركيز النهائي 2.5 ملم). اخلط جيدا. جمع سوpernatants في أنابيب microfuge نظيفة. عينات تدور لتخلص من حطام خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نقل supernatants بهم في أنابيب microfuge نظيفة. الاحتفاظ بها على الجليد حتى جاهزة.
  6. استخدام قسامة من معدة مسبقا "المعيار NET".
    ملاحظة: المعايير NET هي مزيج من supernatants هضم الدناز العدلات حفز سلطة النقد الفلسطينية، تم الحصول عليها من لا يقل عن 5 مختلف الجهات المانحة الإنسان ومستقلة.
    1. لاستخدام نفس المعايير لفترة طويلة، وجمع وقسامة كمية كبيرة من supernatants العدلة من كل جهة مانحة فردية. وجمع على سبيل المثال 2 مل من supernatants هضم الدناز العدلات حفز سلطة النقد الفلسطينية، يؤدي في 200 قسامات (10 ميكرولتر لكل منهما) ما يكفي ل 200 لوحات ELISA. تم العثور على البيانات التي تميز مستوى NET في الشكل (5).
    2. تحفيز العدلات الإنسان مع 100 نيوتن متر سلطة النقد الفلسطينية لمدة 4 ساعة وتطبيق الدناز هضم لsupernatants وفقا خطوات 3،4-3،5.
    3. جمع وحمام سباحة، قسامة (10 ميكرولتر) ومجاناsupernatants زي (-20 درجة مئوية) العدلات.
    4. لإعداد "NET-المعيار"، ذوبان قسامة واحد / المانحة تم الحصول عليها من لا يقل عن خمسة المانحين منفصلة، ​​مزجها والاحتفاظ بها على الجليد.
    5. تجاهل عينات إذابة واستخدام الطازجة للتجربة القادمة.
    6. إعداد 1: التخفيف المتسلسل 2 للمستوى NET في برنامج تلفزيوني + EGTA.
  7. تمييع عينات هضمها DNase1 (معيار وsupernatants غير معروف) 20 ضعفا في برنامج تلفزيوني + EGTA وقسامة لهم على لوحات ELISA المغلفة مع الأجسام المضادة القبض عليه.
  8. احتضان لوحات ELISA أكثر من ليلة في 4 درجات مئوية، وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  9. تطبيق حل الكشف عن الأجسام المضادة (100 ميكرولتر / جيد): الحصان الفجل البيروكسيداز مترافق الأجسام المضادة لمكافحة الحمض النووي (1: 500، والماوس). احتضان لمدة 1 ساعة في الظلام.
  10. بعد أربعة يغسل مع برنامج تلفزيوني إضافة تمب البيروكسيديز الركيزة: 100 ميكرولتر / جيد و 30 دقيقة. تلوين الأزرق هو مؤشر للنشاط البيروكسيديز (المستجدة الحالية).
  11. وقف رد الفعل من خلال إضافة 100 ميكرولتر / جيد 1 M حمض الهيدروكلوريك. السوف حلول الزرقاء تتحول الصفراء (الشكل 5A).
  12. قراءة الامتصاصية في 450 نانومتر باستخدام مضواء صفيحة.
  13. لتحليل البيانات، وحساب كمية MPO-DNA أو المجمعات HNE-DNA بالمقارنة مع مستوى NET.
    1. طرح الخلفية قيمة الكثافة الضوئية للوسط الفحص من جميع العينات.
    2. رسم القيم الامتصاصية (المحور السيني) من العينات القياسية مخففة ضد محتواها النسبي NET (Y-محور) (الشكل 5A).
    3. باستخدام مجموعة nonsaturated من هذا المنحنى القياسي إنشاء خط الاتجاه (استخدم تناسب أفضل الهائل من البرامج المستخدمة) (الشكل 5A). معادلة هذا الخط يحدد تحويل القيم OD من الكمية مبالغ المستجدة.
    4. إدراج القيم OD قياس من المجاهيل في المعادلة خط الاتجاه من 3.13.3 من شأنها أن تعطي كمية المستجدة في عينة مجهولة كنسبة مئوية من المعايير NET (الشكل 5A).
    5. حسابمتوسطات مكررات (يثلث) وتقديم البيانات النهائية بأنها "كمية MPO-DNA أو المجمعات HNE الحمض النووي (٪ من المعيار)" (الشكل 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الأرقام في هذه المخطوطة تصف طريقة العزلة العدلة والإجراءات التجريبية، ونتائج ممثل الحالية مع شرح لتحليل البيانات. يبين الشكل 1 في خطوات متتابعة من إعداد العدلات البشري. ويمثل هذا البروتوكول واحد فقط طريقة ممكنة من العزلة العدلة. انه يعطي كميات كبيرة من الراحة العدلات قادرة على إطلاق المستجدة على التحفيز. ويوضح الشكل 2 كيف يعمل الافراج عن الحمض النووي فحص القائم على مضان. باستخدام مضان حركية قارئ صفيحة الإفراج الحمض النووي في تتبع العدلات الإنسان في 96-جيدا microplates الشكل 3 يوضح كل خطوة من خطوات تحليل البيانات. أولا، حساب إشارة الحمض النووي القصوى في العدلات تعامل مع سابونين (الشكل 3A). يتم احتساب الزيادة في مضان دائما بالفرق بين أعلى قيمة مضان ومستوى خلفية مضان ( P. الزنجارية (PAO1) (الشكل 3B). ب. الزنجارية يطلق تشكيل NET في PMNs الإنسان. 5،8،10 ولقد ثبت مع العديد من P. الزنجارية سلالات بما في ذلك PAO1 أن البكتيريا وحدها (دون العدلات) لا ربط تستخدم صبغة للكشف عن الحمض النووي. 8 PAO1 P. تم الحصول الزنجارية من آي تي سي سي، مثقف في لوريا، Bertani بين عشية وضحاها المتوسط، التي تحصد في المرحلة في وقت متأخر من الأسي، وغسلها في المتوسط ​​فحص وتستخدم لتحفيز العدلات في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) 10: 1 (الشكل 3B، C، 4B، C). يتم احتساب متوسط ​​الزيادة في مضان من الآبار تكرار، تطبيع في مضان القصوى (سابونين) ويتم التعبير ب "الإفراج الحمض النووي (٪ كحد أقصى)" (الشكل 3C). ويبين الشكل 3D fluores التمثيليةصور cence العدلات غير المعالجة أو سلطة النقد الفلسطينية حفز.

الشكل 4A يصور مخطط شرح مبادئ الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي وHNE الحمض النووي فحوصات ELISA. ويبين الشكل 4B الصور المناعي تمثيلية من nonstimulated، PMA- والعدلات الإنسان تنشيط PAO1. خارج الخلية DNA يظهر التشكل NET نموذجي وشارك في يموضع مع الخطة الرئيسية للعمليات وcitrullinated H4 هيستون، علامة على تشكيل NET. 6 يبين الشكل 4C MPO-DNA وHNE الحمض النووي الافراج عنه في العدلات الإنسان في ظل نفس، الشروط السابقة (مثل الشكل 3B، 3C و4B). ithe كامل "صافي" طرق ELISA تم التعرف سابقا. 5 لفترة وجيزة، 2 U / مل الدناز العلاج (ما يعادل 1 ميكروغرام / تركيز مل من الدناز المستخدمة) لمدة 15 دقيقة في RT أدى إلى أعلى MPO-DNA وHNE-DNA إشارات وكشفت 5 عينات الجري (100 نانوغرام / حارة) على هلام الاغاروز أن طول الحمض النوويفي انخفاض عائدات مجموعة كيلوبايت الأمثل ELISA إشارة. 5 الحمض النووي overdigestion (الدناز جرعة أعلى من 20 U / مل) أو حذف أي اعتقال أو الأجسام المضادة الكشف إلغاء إشارات ELISA. 5

وبالإضافة إلى ذلك، وهنا المقايسات و"المعيار الصافية لل" وقد وصف (الشكل 5A). يتضمن المعايير NET في المتوسط ​​19.5 ميكروغرام / مل الحمض النووي خارج الخلية (التي تقاس باستخدام معيار مع تركيز الحمض النووي المعروفة)، 399 نانوغرام / مل الخطة الرئيسية للعمليات و103.4 نانوغرام / مل HNE (ELISAkits التجارية) (ن = 8). استنادا إلى إجمالي الأوزان الجزيئية للMPO (84 كيلو دالتون) وHNE (29.5 كيلو دالتون) وحقيقة أن 1 ميكروغرام الحمض النووي يحتوي على 9.91 × 10 14 النيوكليوتيدات، والمعايير NET يحتوي على 109 HNE الجزيئات و 147 الجزيئات MPO في 1000 النيوكليوتيدات (كيلو بايت الحمض النووي ). كشفت شقين التجارب تخفيف التسلسلية للمعيار NET أن النطاقات الحيوية لكل من الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي والحمض النووي HNE-ELISA فحوصات ما بين 19،0 حتي 609،0 نانوغرام /تركيزات مل الحمض النووي (الشكل 5B). أسفرت التخفيفات من أقل من 32 أضعاف من المعيار NET في التشبع في حين كانت التخفيفات أعلى من أمثالها 1024 لا تختلف عن الخلفية (الشكل 5B). لم معاملة مستوى NET مع مثبطات الأنزيم البروتيني لن تتغير نتائجها التي حصلت عليها الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي وHNE الحمض النووي المقايسات مشيرا إلى أن البروتياز لا تتداخل مع هذه المقايسات (الشكل 5C). وبالتالي، الحصول على نتائج في نفس العينة-NET القياسية التي MPO-DNA أو الحمض النووي HNE-ELISA فحوصات مرتبطة بقوة مع بعضها البعض (الشكل 5D). لإظهار أن supernatants PMN المجمدة يمكن أن تستخدم أيضا في هذه المقايسات دون فقدان الكفاءة، وبعض قسامات من تركت-NET قياسي غير المعالجة أو تعرضت للآخرين واحد أو اثنين من تجميد / الذوبان دورات أجريت في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية (1 فاصل ساعة). أي من العلاجات تجميد / الذوبان يتأثر MPO-DNA أو HNE الحمض النووي النتائج (الشكل 5E). وباختصار، فإنيوفر NET-معيار نقطة مرجعية موثوقة في هذه المقايسات قياس NET تمكين مقارنة كمية من النتائج NET بين تجارب مستقلة.

شكل 1
تم عزل عزل المحببة الإنسان العدلات العدلات من الدم المحيطي من المتطوعين وفقا لبروتوكول وصف: الشكل 1. تم استخدام الدم التي تحتوي على مضادات التخثر لعزل العدلات بالترسيب دكستران والطرد المركزي التدرج. تم استخدام الدم من دون تخثر لإعداد مصل. ويتم تقييم جدوى الاستعدادات العدلة من التريبان الأزرق مقايسة الاستبعاد. ويتم تقييم العدلات النقاء التي cytospin أو قياس التدفق الخلوي (CD16، CD66abcd الخلايا إيجابية مزدوجة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: مبادئ خارج الخلية DNA الإصدار الفحص يتم الحصول على (A) الإسفار فقط في العدلات الذين تم اختراق وصبغ الحمض النووي ملزم غشاء كتيمة يمكن ربط الحمض النووي بلازما والأغشية النووية. (ب) يتم تنفيذ فحص على الأسود 96-جيدا microplates باستخدام مقياس التألق صفيحة. (ج) مقياس التألق ويسجل منحنيات مضان في الوقت الحقيقي في كل بئر. واحد نتائج ممثلة في مبين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: تحليل البيانات الإصدار الحمض النووي (. (ب) حركية الإفراج العدلات الحمض النووي الناجم عن سلطة النقد الفلسطينية (100 نيوتن متر) والبكتيريا (الزائفة الزنجارية PAO1، 10 وزارة الداخلية). (C) تطبيع تلخيص البيانات الافراج عن الحمض النووي التي تم الحصول عليها في إحدى التجارب باستخدام quadriplicates. (D) مضان الصور التمثيلية للالعدلات البشرية غير المعالجة، وحفزت سلطة النقد الفلسطينية (Sytox البرتقال، 4 ساعات الحضانة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي والحمض النووي HNE-ELISA فحوصات: المبدأ وممثل النتائج (A) برنامج شرحجي كيف MPO-DNA وعمل فحوصات الحمض النووي HNE ELISA. (ب) ممثل النتائج من الصور المناعي أعد على العدلات الإنسان يتعرض إلى 100 ​​نانومتر سلطة النقد الفلسطينية أو P. الزنجارية سلالة PAO1 (10 وزارة الداخلية) لمدة 4 ساعة. خارج الخلية الحمض النووي (دابي، الأزرق) شارك في يموضع في المستجدة مع الخطة الرئيسية للعمليات (الخضراء) وH4 هيستون citrullinated (الحمراء). واحد نتيجة ممثل، ن = 3. (C) وقد تم قياس الإفراج NET في العدلات الإنسان يتعرض لنفس المحفزات على النحو الوارد أعلاه من الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي وفحوصات الحمض النووي HNE ELISA. يعني ± SEM، ن = 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: توصيف "NET-المعيار" (A) التخفيفات المسلسل. (1: 2) من معيار NET أعدتوتعرض لMPO-DNA ELISA. يتم رسم القيم OD تقاس٪ من محتوى-NET القياسية. الأحمر "X" يشير إلى قيمة OD قياس من عينة مجهولة. السهم الرمادي يشير كيف أن "تركيز NET" (أزرق "X") من عينة غير معروفة سوف يتم تحديده باستخدام مجموعة المركزي للالمنحنى القياسي تركيبها. تم تحديد تركيزات (ب) الحمض النووي في عينات-NET القياسية تخفيفه بشكل متسلسل وتآمر ضد القيم OD قياس من MPO-DNA أو الحمض النووي HNE-فحوصات ELISA. وتشير المناطق الرمادية النطاقات الدينامية للفحوصات. (C) البروتياز العلاج المانع (كوكتيل مثبط البروتياز، 1٪) لا يؤثر على نتائج الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي أو المقايسات HNE الحمض النووي (NET-قياسي). يعني ± SEM، ن = 2. (D) الارتباط من الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي والنتائج HNE الحمض النووي (OD 450 نانومتر) من تخفيفه بشكل متسلسل عينات "-NET القياسية" في نطاقات الحيوية الخاصة بهم (انظر 5B). (E) تجميد والذوبان دورات (-20 ° C أو -80 ° C؛ سشمال شرق أو اثنين) لا تؤثر على نتائج الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي وفحوصات HNE الحمض النووي (المعايير NET، يعني ± SEM، ن = 2). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تمثل المستجدة آلية جديدة رائعة التي العدلات قتل مسببات الأمراض. 1 على الرغم من أن الأدب والمستجدة تم التوسع بشكل مستمر على مدى السنوات العشر الماضية منذ اكتشافهم، عدة أسئلة هامة تتعلق دورها في علم الأحياء، وآلية وتنظيم لا تزال غير واضحة. المنهجية المناسبة لابد من وضعها لقياس المستجدة، فإن هذه الآلية المضادة للميكروبات فريدة جدا. توضح هذه المقالة الطرق التي يمكن استخدامها ل quantitate المستجدة بطريقة إنتاجية عالية. الفحص الأول يتبع حركية مضان صبغة الحمض النووي ملزم غشاء كتيمة. يوفر هذا الاختبار كمية كبيرة من المعلومات على منحدر وسرعة الافراج عن الحمض النووي من العدلات. هذه المعلومات هي الحاسمة في التحقيقات دراسة الإشارات في وقت مبكر الأحداث التي أدت إلى تشكيل NET. يتم فقدان كل هذه المعلومات في المقايسات نقطة النهاية قياس الافراج عن الحمض النووي في نهاية الحضانة. فحص خارج الخلية الصبغية الحمض النووي ليست محددة لالمستجدة. هذايقيس فقط الافراج عن الحمض النووي. لتأكيد المستجدة، تحظى بقبول واسع من أداء المناعي على العدلات تشكيل NET وتظهر شارك في توطين الحمض النووي مع أي علامات الحبيبية (الخطة الرئيسية للعمليات، HNE) أو الهستونات. الكميات من البيانات المناعي هي شاقة للغاية على الرغم من وذاتية.

هنا، يتم تقديم تعديل لفحص ELISA التي سبق وضعها كشف مجمعات الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي. يوصف مماثلة ELISA فحص قياس المجمعات HNE الحمض النووي التي تمثل التدابير NET محددة أيضا. وقد تميزت 3،5 كلا المقايسات في تفصيلا. 5 الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي والحمض النووي HNE-ELISA المقايسات الكمية وNET محددة في نفس الوقت 5 لم تتحقق هذه الميزات بأي طريقة الحالي الآخرين. المقايسات من السهل القيام بها وتوفير بيانات قابلة للتكرار. 5 يتم تضمين خطوة الدناز الهضم المحدودة التي تضمن التعامل الفوري وموحد والمستجدة مباشرة على العدلات. 5 هذه المقايسات هي مناسبة لكومحلج عدة عينات في نفس الوقت. في قياسات جديدة، ومراقبة وتبين أن دورات تجميد / الذوبان والبروتياز لا تؤثر على نتائج الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي وHNE الحمض النووي المقايسات. ومن غير المعروف بعد ما إذا كانت البروتينات المعروفة لربط الحمض النووي في المستجدة (بما في ذلك الهستونات وLL-37) 1،11 من شأنها أن تتداخل مع هذه المقايسات.

خطوات حاسمة من البروتوكولات المعروضة هي التالية. ومن المهم أن حصاد العدلات التي هي في الراحة، دولة هادئة ولا تعفي كمية كبيرة من المستجدة من تلقاء أنفسهم. عدم وجود خطوة تحلل ناقص التوتر لإزالة خلايا الدم الحمراء في عرض بروتوكول العدلات العزلة أمر بالغ الأهمية للحصول على العدلات غير المفعلة. لمنع تفعيل العدلات بعد أن تم تنقية الخلايا، فمن المهم أيضا ل resuspend العدلات في مصل المانحة العاملين لديها. للحصول على خلايا هادئة فمن المهم أيضا أن استخدام الكواشف pyrogen- وخالية من التلوث أثناء إعداد العدلات. Spontaيمكن neous الإفراج NET العدلات خلال خارج الخلية فحص الحمض النووي الإفراج أيضا يحدث. إضافة 1٪ مصل ذاتي إلى وسيلة فحص مهم لمنع ذلك. يمكن اختبار جرعات أعلى أو أقل من المصل ذاتي للحصول على أفضل النتائج. ومن الأهمية بمكان خلال الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي وفحوصات الحمض النووي HNE ELISA التي تم إصدارها الحمض النووي لا ينبغي أن يكون الإفراط في هضمها من قبل الدناز لأنه سيؤدي إلى خسارة كاملة للإشارة. ولذلك، ينبغي تحديد الجرعة المثالية لكل دفعة الدناز جديدة. المعلمات من هضم الحمض النووي يمكن أن تتغير قليلا للحصول على أعلى ELISA يشير ممكن. ومن المهم أن تخلط الدناز والمستجدة بدقة لضمان أن الدناز سيكون لديك الوصول اضح على الحمض النووي أيضا. عندما حصاد المستجدة هضمها، ويغسل جيدا على نطاق واسع لجمع كل المستجدة.

الحد اكتشاف الحمض النووي من الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي وفحوصات HNE الحمض النووي هو حوالي 10-20 نانوغرام الحمض النووي مل / (الشكل 5B). مصل الدم والبلازما الحمض النووي مجانا مستويات سيفروذكرت صحيفة مئات إلى آلاف نانوغرام / مل في الأمراض (السرطان، الذئبة الحمامية الجهازية، التهاب عضلة القلب) التي ارتبطت مع تشكيل NET غير طبيعي. 12-14 وهذا يشير إلى أن الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي والحمض النووي HNE-ELISA المقايسات لديها أيضا القدرة لتكون قادرة ل quantitate المستجدة في العينات السريرية البشرية. فإن هذا التطبيق في المستقبل من الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي والحمض النووي HNE-ELISA المقايسات تمكين لتصل الكمية المستجدة لإمراض المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab  Calbiochem 481001 1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) Millipore 07-496 1:2,000x coated
DNase-1 Roche 10-104-159-001 1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS Sigma-Aldrich E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS Sigma-Aldrich E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD Roche 11544675001 1:500x 
Eon Microplate Spectrophotometer Biotek
Gen5 All-in-One microplate software Biotek analytical tool (ELISA)
Sytox orange Life Technology S11368 0.2% final concentration/volume
1 M Hepes Cellgro 25-060-Cl Use 10 mM final concentration.
1 M glucose Sigma Use 5 mM final concentration.
HBSS Corning 21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3 Thermoscientific
PMA Sigma P 8139 100 nM final used
ELISA Plate Greiner bio-one 655061
Conical tubes 15 ml Thermoscientific 339650
Conical tubes 50 ml Thermoscientific 339652
Percoll (pH 8.5-9.5)  Sigma P 1644 Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran Spectrum D1004
RPMI 1640 media Corning Cellgro 17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom Costar 3603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  2. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
  3. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
  4. Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34 (2013).
  5. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
  6. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
  7. Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
  8. Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
  9. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
  10. Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205 (2013).
  11. Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
  12. Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
  13. Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
  14. Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).

Tags

علم المناعة، العدد 112، والفخاخ خارج الخلية العدلات، NET، المحببة، العدلات، والحمض النووي خارج الخلية، الميلوبيروكسيديز، العدلات الإيلاستاز، الكميات، ELISA، إنتاجية عالية
عالية الإنتاجية قياس خارج الخلية DNA الإصدار والكمي NET تشكيل في العدلات الإنسان<em&gt; في المختبر</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sil, P., Yoo, D. g., Floyd, M.,… More

Sil, P., Yoo, D. g., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro. J. Vis. Exp. (112), e52779, doi:10.3791/52779 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter