Protocol
Die Institutional Review Board der University of Georgia genehmigt das menschliche Subjekt Studie peripheren Blut von gesunden Freiwilligen (UGA # 2012-10769-06) zu sammeln. 5,7,8 Freiwilligen unterzeichnet die erforderliche Einverständniserklärung vor der Blutentnahme. Die Forschung in diesem Artikel ausgeführt ist in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien für die medizinische Forschung am Menschen von der Deklaration von Helsinki.
1. Isolierung von Neutrophilen aus peripherem menschlichem Blut (Figur 1)
Hinweis: Es gibt mehrere Möglichkeiten, Neutrophile aus peripherem Blut zu isolieren. Das folgende Protokoll stellt eine Möglichkeit. Dieses Protokoll liefert eine große Anzahl von nicht-aktivierten menschlichen Neutrophilen der Lage NETs auf externe Stimulation freigesetzt wird. Verwenden Sie 40 ml Vollblut von gesunden Freiwilligen durch Venenpunktur. 7,9
- Aliquotieren 20 ml Blut in zwei 50 ml konischen Röhrchen. 10 ml 6% Dextran. Vorsichtig mischen.
- Nach 20 min Transfer der Leukozyten-rich obere Phase ohne pelle roten Blutkörperchen in saubere 50 ml konische Röhrchen nehmen, und füllen Sie es mit sterilem PBS auf.
- Zentrifuge bei 400 xg 10 min. Pellet in 4 ml sterilem PBS.
- Bereiten Sie einen 5-stufigen Percollgradienten von 85% -80% -75% -70% -65% in zwei 15 ml konischen Röhrchen und Schicht 2 ml Leukozyten-Suspension auf der jeweils Gradienten.
- Zentrifuge 800 × g für 30 min mit Bremsen aus.
- Sammle alle Zellen (Neutrophile) in den Schichten an der 75% / 80% und 70% / 75% Schnittstelle.
- Waschen Sie die Zellen zweimal in PBS (350 · g, 10 min, RT) und zählen Zellen eine Zählkammer.
2. Messung der Kinetik der extrazellulären DNA Veröffentlichung Mit Hilfe eines Mikroplatten-Fluorimeter
Hinweis: Diese Methode ermöglicht die Messung von Veränderungen in der Fluoreszenz eines membran impermeable DNA-bindenden Farbstoff anzeigt DNA Freisetzung auf einer 96-Well - Mikrotiterplatten - Format (Abbildung 2).
- Eine Suspension von Neutrophilen in Testmedium (HBSS +1% (v / v) autologem Serum + 5 mM Glucose) bei einer Konzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml.
- Werden 5 & mgr; mol / L der Membran undurchlässig DNA-bindenden Farbstoff. Vorsichtig mischen.
- Aliquotieren humanen Neutrophilen (50 & mgr; l / Vertiefung) auf 96-Well-schwarz, transparenten Boden Mikrotiterplatten. Stellen Sie sicher, dass das Testmedium den gesamten Boden des Bohrlochs erstreckt. Wenn nicht, tippen Sie auf die Platte vorsichtig auf die Seite.
- Warm up die Platte, die Neutrophile für 10 min bei 37 ° C.
- In der Zwischenzeit werden die Lösungen von Reizen auf das Doppelte ihrer endgültigen Konzentrationen eingesetzt werden (in 37 ° C warmen Testmedium). Als ein positives Nettosteuer menschliche Neutrophilen mit 100 nM Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) für 4 Stunden nutzen , um eine maximale NET Freisetzung auslösen. 5,8 PMA - Stimulation für 4 Stunden sorgt für maximale NET Freisetzung während spontane NET Bildung niedrig 5,8 bleibt.
- Bereiten Sie die Mikrotiterplatte Fluorimeter für die Messung (4 Stunden, 37 ° C, 530 nm zur Anregung und 590 nm für Emission). </ Li>
- Neutrophile stimuliert durch Zugabe von 50 & mgr; l Reizlösung auf 50 ul Neutrophilen Suspensionen. Verwenden Sie 0,5 ug / ml Saponin in einem gut maximale DNA-Freigabesignal zu messen.
- Legen Sie die Platte in Leser und messen Veränderungen in der Fluoreszenz für 4 Stunden bei jeder 2 min ohne Schütteln.
- Für die Datenanalyse berechnen normalisierten Erhöhungen der Fluoreszenz über die Zeit.
- Subtract Fluoreszenzbasis von Endpunktwerte für alle Vertiefungen einschließlich Saponin (2A, B). Aufstieg in Saponin Fluoreszenz sollte das höchste Signal sein. Es wird als "maximale DNA - Freigabe" (2A) bezeichnet.
- Berechnen Prozentsatz der DNA-Freisetzung in unbekannten Proben durch einen Anstieg der Fluoreszenz von unbekannten Proben durch maximale DNA-Freisetzung zu teilen.
- Durchschnittliche Ergebnisse der Replikate und präsentieren sie als "% der maximalen DNA - Release" (Abbildung 2C).
3. Die Quantifizierung von NET-Formularation von MPO-DNA und HNE-DNA-ELISA-Assays
Hinweis: Diese Assays modifiziert (MPO-DNA) oder etablierte (HNE-DNA) in unserem Labor NET Bildung Quantifizieren von Niveaus von MPO-DNA und HNE-DNA - Komplexe Messung 5.
- Mantel 96-well hohe Bindungskapazität ELISA-Platten über Nacht mit Fänger-Antikörper (50 & mgr; l / Well): anti-MPO (1: 2000 Verdünnung) oder anti-HNE (1: 2000).
- Wasch ELISA Platten dreimal mit PBS (200 ul / Vertiefung) und blockieren sie mit 5% BSA und 0,1% humanes Serumalbumin für 2 h bei RT (200 ul / Vertiefung). Wasche dreimal mit PBS.
- Seed Neutrophilen auf 96-well Mikrotiterplatten in einer Dichte von 100.000 Zellen / Well in 100 & mgr; l Assay-Medium und NET Bildung stimulieren. Inkubiere Zellen: 4 h 37 ° C.
- Führen Sie eine begrenzte DNase-Verdau durch Zugabe von 2 U / ml DNase Neutrophilen Stände, mischen sie gut. Halten Sie diese bei RT.
- Stoppen Sie die DNase nach 15 Minuten durch Zugabe von 11 & mgr; l 25 mM EGTA (Endkonzentration 2,5 mM). Gut mischen. Sammeln Sie supernatants in saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Spin-Proben bei 300 × g für 5 min bei RT loszuwerden Zelldebris zu werden. Bringen Sie ihre Stände in saubere Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie sie auf Eis, bis sie bereit.
- Verwenden Sie einen aliquoten Teil einer zuvor hergestellten "NET-Standard".
Hinweis: Die NET-Standard ist eine Mischung aus DNase-verdauten Überständen von PMA-stimulierten neutrophilen Granulozyten, die aus mindestens 5 verschiedenen, unabhängigen menschlichen Spendern.- Um den gleichen Standard für eine lange Zeit, zu sammeln und ein großes Volumen an neutrophilen Stände von jedem einzelnen Spender aliquotieren. Sammeln zum Beispiel 2 ml DNase-verdauten Überständen von PMA-stimulierten Neutrophilen werden in 200 Aliquots (10 ul jeweils) genug für 200 ELISA-Platten führen. Die Daten der NET - Standard kennzeichnen , sind in Abbildung 5 gefunden.
- Stimulieren menschliche Neutrophilen mit 100 nM PMA für 4 Stunden und gelten DNase nach Schritten, um ihre Überstände verdauen 3,4-3,5.
- Sammeln, Pool, Aliquot (10 ul) und kostenlosze (-20 ° C) neutrophil Überständen.
- Zur Herstellung der "NET-Standard", Tauwetter ein Aliquot / Spender aus mindestens fünf verschiedenen Spendern erhalten, mischen sie und halten sie auf dem Eis.
- Entsorgen Sie aufgetauten Proben und frische für den nächsten Versuch verwenden.
- Bereiten Sie eine 1: 2 serielle Verdünnung des NET-Standard in PBS + EGTA.
- Verdünnen Sie DNase1-verdauten Proben (Standard und unbekannte Stände) 20-fach in PBS + EGTA und aliquotieren sie auf ELISA-Platten mit Fänger-Antikörper beschichtet.
- Inkubieren ELISA-Platten über Nacht bei 4 ° C und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
- Bewerben Detektions-Antikörper-Lösung (100 & mgr; l / Well): Meerrettich-Peroxidase-konjugierter anti-DNA-Antikörper (1: 500, Maus). Inkubieren für 1 Stunde in Dunkelheit.
- Nach vier Waschungen mit PBS TMB Peroxidasesubstrat hinzufügen: 100 & mgr; l / Vertiefung, 30 min. Blaue Färbung ist ein Indiz für die Peroxidase-Aktivität (NETs vorhanden).
- Stop Reaktion durch Zugabe von 100 ul / Vertiefung 1 M HCl. Dasblau Lösungen gelb (5A) drehen.
- Lesen Sie die Absorption bei 450 nm im Mikrotiterplatten-Photometer.
- Für die Datenanalyse, die Berechnung der Menge an MPO-DNA oder HNE-DNA-Komplexe im Vergleich zu dem NET-Standard.
- Ziehen Sie den Hintergrund Wert der optischen Dichte des Testmediums aus allen Proben.
- Zeichnen Sie die Absorptionswerte (X-Achse) der verdünnten Standardproben gegen ihren Nettogehalt (Y-Achse) (5A).
- Mit dem nicht gesättigten Bereich dieser Standardkurve eine Trendlinie etablieren (beste exponentielle Anpassung der Software verwendet wird ) (5A). Die Gleichung dieser Trendlinie bestimmt die Umwandlung von OD-Werte Mengen von NETs quantitativ.
- Legen Sie die gemessenen OD - Werte der Unbekannten in den Trend-Linie Gleichung von 3.13.3, die die Menge von NETs in der unbekannten Probe als Prozentsatz des Netto-Standard (5A) geben wird.
- BerechnenMittelwerte von Replikaten (dreifacher Ausführung) und die endgültigen Daten als "Menge an MPO-DNA oder HNE-DNA - Komplexe ( in % der Norm)" (5C) präsentieren.
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Representative Results
Die Zahlen in diesem Manuskript die Methode der Neutrophilen - Isolierung, experimentelle Verfahren beschreiben und präsentieren repräsentative Ergebnisse mit Erklärung der Datenanalyse. Abbildung 1 die aufeinanderfolgenden Schritte der humanen neutrophilen Vorbereitung zeigt. Dieses Protokoll stellt nur eine mögliche Art der Neutrophilen-Isolation. Es ergibt große Mengen an Neutrophilen freisetzen kann , NETs bei Stimulierung ruht. 2 zeigt , wie die Fluoreszenz-basierte DNA - Freisetzungs - Assay funktioniert. Ein Fluoreszenz - Mikroplattenlese Kinetik der DNA - Freisetzung Verwendung in humanen Neutrophilen in gefolgt sind 96-Well Mikrotiterplatten. Abbildung 3 erklärt jeden Schritt der Datenanalyse. Zuerst berechnen maximale DNA - Signal in Neutrophilen mit Saponin (3A) behandelt. Zunahme der Fluoreszenz wird als die Differenz zwischen dem höchsten Fluoreszenzwert und dem Hintergrundfluoreszenzniveau immer berechnet (
Figur 4A zeigt das Schema zur Erläuterung der Prinzipien der MPO-DNA und DNA HNE-ELISA - Assays. 4B zeigt repräsentative Immunofluoreszenz Bilder von nicht stimulierten, PMA- und PAO1-aktivierte menschliche Neutrophile. Die extrazelluläre DNA zeigt typische NET Morphologie und Co-lokalisiert mit MPO und citrullinated Histon H4, ein Marker für NET - Bildung. 6 4C zeigt MPO-DNA und HNE-DNA Freisetzung in humanen Neutrophilen unter den gleichen, vorstehenden Bedingungen (wie in Abbildung 3B, 3C und 4B). IThe "NET" ELISA Methoden bisher charakterisiert wurden. 5 kurz, 2 U / ml DNase - Behandlung (Äquivalent von 1 & mgr; g / ml Konzentration der DNase verwendet) für 15 min bei RT ergab den höchsten MPO-DNA und HNE-DNA Signale . 5 Laufproben ergab (100 ng / Spur) auf einem Agarose - Gel , das DNA - Längein den unteren Bereich kb Ausbeuten optimal ELISA - Signal. 5 DNA overdigestion (DNase Dosis von mehr als 20 U / ml) oder entweder die Erfassung oder der Nachweis - Antikörper Weglassen der ELISA - Signale abgeschafft. 5
Darüber hinaus werden hier die Tests und die "NET- Standard" sind weiter charakterisiert (5A). Die NET-Standard enthält durchschnittlich 19,5 ug / ml extrazelluläre DNA (gemessen durch einen Standard mit bekannten DNA-Konzentrationen verwendet wird), 399 ng / ml MPO und 103,4 ng / ml HNE (Handels ELISAkits) (n = 8). Bezogen auf die gesamten Molekulargewichte von MPO (84 kDa) und HNE (29,5 kDa) und der Tatsache , dass 1 & mgr; g DNA 9.91 x 10 14 Nucleotide enthält, enthält der NET-Standard 109 HNE - Moleküle und 147 MPO - Moleküle pro 1.000 Nukleotiden (kb DNA ). Zweifache Reihenverdünnungsexperimente des NET-Standard ergab, daß die dynamischen Bereiche sowohl der MPO-DNA und DNA HNE-ELISA-Assays sind zwischen 19,0 bis 609,0 ng /ml DNA - Konzentrationen (5B). Verdünnungen von weniger als 32-fache des NET - Standard in der Sättigung führte während Verdünnungen von mehr als 1.024-fach vom Hintergrund nicht anders waren (5B). Die Behandlung des NET - Standard mit Proteasehemmern nicht geändert hat seine durch die MPO-DNA und HNE-DNA - Assays erhaltenen Ergebnisse darauf hinweist , dass Proteasen nicht stören diesen Assays (5C). Somit erzielten Ergebnisse in der gleichen NET-Standardprobe durch die MPO-DNA oder DNA-HNE - ELISA - Assays stark miteinander (5D) korrelieren. Um zu zeigen, dass gefrorene PMN Stände können auch in diesen Assays verwendet werden, ohne die Effizienz zu verlieren, einige Proben der NET-Standard wurden unbehandelt gelassen oder andere ausgesetzt waren ein oder zwei Frost / Tau-Zyklen bei -20 ° C oder -80 ° C (1 Std Intervall). Keiner der Frost / Tau - Behandlungen betroffen , die MPO-DNA oder HNE-DNA Ergebnisse (5E). Zusammenfassend ist dieNET-Standard stellt einen zuverlässigen Bezugspunkt in dieser NET-Quantifizierung von Assays, die die quantitativen Vergleich des Nettoergebnisses zwischen unabhängigen Experimenten zu ermöglichen.
Abb . 1: Isolierung von Human - Neutrophilen Neutrophile Granulozyten wurden aus dem peripheren Blut von Freiwilligen isoliert nach dem beschriebenen Protokoll. Es wurde Blut enthält Antikoagulans verwendet Neutrophilen durch Dextransedimentation und Gradientenzentrifugation zu isolieren. Blut ohne Antikoagulans wurde verwendet, Serum herzustellen. Viabilität der Neutrophilen Zubereitungen wird durch Trypanblau-Ausschluss-Assay beurteilt. Neutrophile Reinheit von Cytospin bewertet wird oder Durchflusszytometrie (CD16, CD66abcd doppelt positiven Zellen). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Prinzipien der extrazellulären DNA - Freisetzungstest (A) Fluoreszenz wird nur in Neutrophilen , deren Plasma und Kernmembranen erhalten haben , beeinträchtigt wurde und die Membran-undurchlässige DNA-bindenden Farbstoff können , um ihre DNA binden. (B) Der Test auf schwarze 96-Loch durchgeführt wird , eine Mikrotiterplatte fluorimeter Mikrotiterplatten verwenden. (C) Das Fluorimeter zeichnet Echtzeit - Fluoreszenz - Kurven in jeder Vertiefung. Eine repräsentative Ergebnisse gezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Die Analyse der DNA- Profil- Daten (.
Abbildung 4: MPO-DNA und HNE-DNA - ELISA - Assays. Prinzip und Repräsentative Ergebnisse (A) Schema erklärening, wie die MPO-DNA und HNE-DNA-ELISA-Assays Arbeit. (B) Repräsentative Ergebnisse der Immun Bilder vorbereitet auf die menschliche zu 100 nM PMA ausgesetzt Neutrophilen oder P. aeruginosa PAO1 Stamm (10 MOI) für 4 Stunden. Die extrazelluläre DNA (DAPI, blau) co-lokalisiert in NETs mit MPO (grün) und citrullinated Histon H4 (rot). Ein repräsentatives Ergebnis, n = 3 (C) NET - Freisetzung wurde in menschlichen Neutrophilen ausgesetzt gemessen auf die gleichen Reize wie oben durch die MPO-DNA und HNE-DNA - ELISA - Assays. Mittelwert ± SEM, n = 3. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Charakterisierung der "NET-Standard" (A) Reihenverdünnungen. (1: 2) des NET - Standard hergestelltund bei MPO-DNA-ELISA unterzogen. Gemessen OD-Werte werden gegen% der NET-Standard-Content aufgetragen. Rot "X" zeigt eine gemessene OD-Wert einer unbekannten Probe. Grauer Pfeil zeigt an, wie die "NET Konzentration" (blau "X") der unbekannten Probe bestimmt werden soll, die zentrale Bereich der angepassten Standardkurve. (B) DNA - Konzentrationen in Reihe verdünnt NET-Standardproben wurden bestimmt und aufgetragen gegen den gemessenen OD - Werte der MPO-DNA oder HNE-DNA - ELISA - Assays. Graue Bereiche kennzeichnen die dynamischen Bereiche der Assays. (C) Protease - Inhibitor - Behandlung (Protease - Inhibitor - Cocktail, 1%) hat keinen Einfluss auf das Ergebnis der MPO-DNA oder HNE-DNA - Assays (NET-Standard). Mittelwert ± SEM, n = 2 (D) Korrelation von MPO-DNA und HNE-DNA Ergebnisse (OD 450 nm) von seriell verdünnt "NET-Standard" Proben in ihrer dynamischen Bereiche (siehe 5B). (E) Einfrieren und Auftauzyklen (-20 ° C oder -80 ° C; one oder zwei) haben keinen Einfluss auf die Ergebnisse der MPO-DNA und HNE-DNA - Assays (NET-Standard, Mittelwert ± SEM, n = 2). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
NETs stellen eine faszinierende neuartige Mechanismus , durch den Erreger Neutrophilen töten. 1 Obwohl die Literatur von NETs hat den letzten zehn Jahren den Ausbau über kontinuierlich seit ihrer Entdeckung, einige wichtige Fragen zu ihrer Rolle im Zusammenhang mit der Biologie, Mechanik und Regelung unklar bleiben. Entsprechende Methodik entwickelt werden NETs zu messen, diese einzigartigen antimikrobiellen Mechanismus. Dieser Artikel beschreibt Verfahren, die verwendet werden können NETs in einem Hochdurchsatz Weise zu quantifizieren. Die erste Assay-Kinetik folgt der Fluoreszenz eines membran impermeable DNA-bindenden Farbstoff. Dieser Test liefert große Menge an Informationen über die Steigung und die Geschwindigkeit der DNA-Freisetzung aus neutrophilen Granulozyten. Diese Informationen sind in Untersuchungen entscheidend studieren frühen Signalereignisse zu NET Bildung führt. All diese Informationen werden in Endpunkt-Assays Messung DNA Freigabe am Ende der Inkubation verloren. Die extrazelluläre DNA-Farbstoff-basierten Test ist für NETs nicht spezifisch. Esnur misst DNA-Release. Um zu bestätigen, NETs ist es weithin Immunofluoreszenz auf NET-bildende Neutrophilen auszuführen angenommen und zeigen die Co-Lokalisierung von DNA entweder mit Granulat Marker (MPO, HNE) oder Histone. Die Quantifizierung der Immun Daten ist allerdings sehr mühsam und subjektiv.
Hierbei wird eine Modifikation eines zuvor entwickelten ELISA-Assay-Erfassungs MPO-DNA-Komplexe dargestellt. Ein ähnliches ELISA - Assay Mess HNE-DNA - Komplexe , die spezifische NET Maßnahmen darstellen , wird ebenfalls beschrieben. 3,5 Beide Assays sind in der detaillierten charakterisiert. 5 Die MPO-DNA und DNA HNE-ELISA - Assays sind quantitative und netzspezifische zugleich von einem anderen aktuellen Verfahren. 5 sind diese Funktionen nicht erfüllt. Die Tests sind einfach durchzuführen und reproduzierbare Daten zur Verfügung stellen. 5 eine begrenzte DNase Verdauungsschritt ist im Preis enthalten , die direkt auf Neutrophilen schnelle und standardisierte Handhabung von NETs gewährleistet. 5 Diese Tests eignen sich für den commehrere Proben zur gleichen Zeit pare. In neuen, Kontrollmessungen ist es, dass Frost / Tau-Zyklen und Proteasen wirken sich nicht auf das Ergebnis der MPO-DNA und HNE-DNA-Tests gezeigt. Es ist nicht bekannt, aber, ob bekannte Proteine in NETs an DNA zu binden (einschließlich Histonen und LL-37) 1,11 würden mit diesen Assays interferieren.
Kritischen Schritte der dargestellten Protokolle sind die folgenden. Es ist wichtig, Neutrophile zu ernten, die in einem ruhenden, Ruhezustand sind und nicht loslassen große Menge an NETs spontan. Fehlen einer hypotonischen Lyse der roten Blutzellen in dem dargestellten neutrophil Isolierungsprotokoll zu entfernen, ist entscheidend, nicht aktivierten Neutrophilen zu erhalten. Zur Aktivierung von Neutrophilen hemmen nach hatten die Zellen gereinigt wurde, ist es auch wichtig, Neutrophile in einem Medium zu resuspendieren ihre Donator eigenen Serum enthält. Zur Erzielung ruhenden Zellen ist es auch entscheidend, pyrogen- und kontaminationsfreie Reagenzien während der Neutrophilen Zubereitung zu verwenden. SPONTAzeitige NET Freisetzung von neutrophilen Granulozyten während der extrazellulären DNA-Freisetzungstest könnte auch passieren. Zugabe von 1% autologem Serum zu dem Testmedium ist wichtig, um es zu verhindern. Höhere oder niedrigere Dosen des autologem Serum konnte um optimale Ergebnisse zu erhalten, werden getestet. Es ist wichtig, während der MPO-DNA und DNA HNE-ELISA-Assays, die DNA freigesetzt sollte nicht durch die DNase Über verdaut, weil es zu einem vollständigen Verlust des Signals führen. Daher sollte die optimale Dosis für jede neue DNase Charge bestimmt werden. Die Parameter der DNA Verdau leicht verändert werden könnte, die höchste ELISA-Signale möglich zu erhalten. Es ist auch wichtig, die DNase und NETs gründlich zu mischen, um sicherzustellen, dass die DNase übersichtlichen Zugriff auf die DNA haben. Wenn die verdaute NETs Ernte, waschen Sie die gut ausgiebig alle NETs zu sammeln.
Die DNA - Nachweisgrenze der MPO-DNA und DNA-HNE - Assays ist etwa 10-20 ng / ml DNA (5B). Serum und Plasma-freie DNA-Spiegel von Several hundert bis tausend ng / ml wurden in Krankheiten (Krebs, systemischer Lupus erythematosus, myocardial Infektion) berichtet , die mit abnormal NET Bildung verbunden sind. 12-14 Dies legt nahe , dass die MPO-DNA und DNA HNE-ELISA - Assays haben auch das Potential , in der Lage sein NETs in humanen klinischen Proben zu quantifizieren. Diese künftige Anwendung der MPO-DNA und HNE-DNA-ELISA-Assays ermöglichen wird, Pathogenese der Erkrankung quantitativ NETs zu verknüpfen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human Neutrophil Elastase Rabbit Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2,000x coated |
| Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) | Millipore | 07-496 | 1:2,000x coated |
| DNase-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µg/ml used for digestion |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2.5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Cell death detection ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Microplate Spectrophotometer | Biotek | ||
| Gen5 All-in-One microplate software | Biotek | analytical tool (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0.2% final concentration/volume |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | Use 10 mM final concentration. |
| 1 M glucose | Sigma | Use 5 mM final concentration. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM final used |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Conical tubes 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Conical tubes 50 ml | Thermoscientific | 339652 | |
| Percoll (pH 8.5-9.5) | Sigma | P 1644 | Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G |
| Dextran | Spectrum | D1004 | |
| RPMI 1640 media | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 well assay plate black plate clear bottom | Costar | 3603 |
References
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