Protocol
Совет Институциональный Обзор Университета штата Джорджия одобрил исследование предмет человека для сбора периферической крови здоровых добровольцев (УЗА # 2012-10769-06). 5,7,8 Добровольцы подписали требуемую форму информированного согласия перед взятия крови. Исследования, проведенные в этой статье, в соответствии с этическими принципами для медицинских исследований с участием человека, закрепленных в Декларации Хельсинки.
1. Выделение нейтрофилов из периферической крови человека (Рисунок 1)
Примечание: Есть несколько способов, чтобы изолировать нейтрофилов из периферической крови. Следующий протокол обеспечивает одну возможность. Этот протокол дает большое количество неактивированных нейтрофилов человека, способные высвобождать от внешней сетей не стимуляции. Используйте 40 мл цельной крови получали от здоровых добровольцев венопункцией. 7,9
- Алиготе 20 мл крови на две 50 мл конические пробирки. Добавляют 10 мл 6% декстрана. Осторожно перемешать.
- Через 20 мин передачи лейкоцитарной-RICч верхняя фаза без принятия каких-либо осаждали красных кровяных клеток в чистые 50 мл конические пробирки, и заполнить его стерильной PBS.
- Центрифуга при 400 мкг в 10 мин. Ресуспендируют осадок в 4 мл стерильной PBS.
- Приготовьте 5-ступенчатый перколлом градиент 85% -80% -75% -70% -65% в двух 15 мл конические пробирки и слой 2 мл лейкоцитарной суспензии на вершине каждого градиента.
- Центрифуга 800 мкг в течение 30 мин с тормозами прочь.
- Соберите все клетки (нейтрофилы) в слоях на 75% / 80% и 70% интерфейс / 75%.
- Вымойте клетки дважды в PBS (350 XG, 10 мин, RT) и подсчет клеток с использованием гемоцитометра.
2. Измерение кинетики внеклеточной ДНК-релиз Использование микропланшетов Флуориметр
Примечание: Этот метод позволяет измерять изменения в флуоресценции мембран непроницаемый для ДНК-связывающего краситель , указывающего высвобождения ДНК на формате микропланшетов 96-луночного (рисунок 2).
- Приготовьте суспензию нейтрофилов в аналитической среде (HBSS +1% (об / об) аутологичной сыворотки + 5 мМ глюкозы) в концентрации 2 х 10 6 клеток / мл.
- Добавьте 5 мкмоль / л мембраны непроницаемой ДНК-связывающего красителя. Осторожно перемешать.
- Аликвотные нейтрофилы человека (50 мкл / лунку) в 96-луночный черный, прозрачный дно микропланшетов. Убедитесь, что анализ среда охватывает всю нижнюю часть скважины. Если нет, то нажмите на пластину аккуратно на стороне.
- Нагреть планшет, содержащий нейтрофилы в течение 10 мин при 37 ° С.
- В то же время приготовления растворов стимулов при двойном их конечных концентрациях, которые будут использоваться (в 37 ° C теплой среде для анализа). В качестве положительного контроля используют NET нейтрофилов человека с 100 нМ форбол-миристат-ацетата (PMA) в течение 4 часов , чтобы вызвать максимальное высвобождение NET. 5,8 PMA стимуляции в течение 4 ч обеспечивает максимальное высвобождение NET в то время как спонтанное NET образование остается низким 5,8.
- Приготовьте микропланшет флуориметра для измерения (4 ч, 37 ° C, 530 нм для возбуждения и 590 нм для эмиссии). </ Li>
- Стимулируют нейтрофилы путем добавления 50 мкл раствора стимул к 50 мкл суспензии нейтрофилов. С помощью 0,5 мкг / мл сапонина в одной скважине для измерения максимального сигнала высвобождения ДНК.
- Поместите пластину в считывающее устройство и измерения изменений флуоресценции в течение 4 ч при каждые 2 мин с не встряхивая.
- Для анализа данных, вычисляют нормализованные увеличение флуоресценции с течением времени.
- Вычитание базовой линии флуоресценции от значений конечных точек для всех скважин , включая сапонины (рис 2А, В). Рост сапонина флуоресценции должен быть самым высоким сигналом. Это называется "максимального высвобождения ДНК" (фиг.2А).
- Рассчитать процент высвобождения ДНК в неизвестных образцах путем деления увеличения флуоресценции неизвестных образцов максимального высвобождения ДНК.
- Средние результаты повторах и представить их в виде "% максимального высвобождения ДНК" (рис 2С).
3. Количественное NET формывания МРО-ДНК и ДНК-HNE ИФА
Примечание: Эти анализы модифицированного (МРО-ДНК) или установлена (гидроксиноненал-ДНК) в нашей лаборатории количественной оценки NET образования путем измерения уровней МРО-ДНК и комплексов ДНК гидроксиноненал-5.
- Шерсть 96-луночного высокой вяжущей способностью ELISA пластины в течение ночи с антителами захвата (50 мкл / лунку): анти-MPO (1: 2000 разведение) или анти-гидроксиноненал (1: 2000).
- Мытье ELISA планшеты три раза PBS (200 мкл / лунку) и блокировать их с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% человеческого сывороточного альбумина в течение 2 ч при комнатной температуре (200 мкл / лунку). Промыть три раза PBS.
- Семенной нейтрофилы на 96-луночные микропланшеты при плотности 100000 клеток / лунку в 100 мкл среды для анализа, а также стимулировать формирование чистого. Инкубируйте клетки: 4 часа 37 ° C.
- Выполните ограниченное ДНКазную пищеварение путем добавления 2 ед / мл ДНКазы к нейтрофильных супернатантов, хорошо перемешать. Храните их при комнатной температуре.
- Остановить ДНКазы через 15 мин путем добавления 11 мкл 25 мМ EGTA (конечная концентрация 2,5 мМ). Хорошо перемешать. Собирают суpernatants в чистых микроцентрифужных труб. Образцы Спин, чтобы избавиться от остатков клеток при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Передача их супернатантов в чистые микроцентрифужных труб. Держите их на льду до готовности.
- Используйте аликвоту предварительно подготовленную "NET стандарта".
Примечание: NET-стандарт представляет собой смесь ДНКазы-переваренной супернатантах PMA-стимулированных нейтрофилов, полученных по меньшей мере, 5 различных, независимых людей-доноров.- Для того, чтобы использовать один и тот же стандарт, в течение длительного времени, собирать и аликвоту большой объем нейтрофильных супернатантах от каждого отдельного донора. Сбор, например, 2 мл ДНКазы переваривается супернатантах РМА-стимулированных нейтрофилах приведет к 200 аликвот (10 мкл каждый) достаточно на 200 ELISA пластин. Данные , характеризующие NET стандарт найдены на рисунке 5.
- Стимулируют нейтрофилов человека с 100 нМ РМА в течение 4 ч и применять ДНКазы переваривать их супернатантах в соответствии шагов 3,4-3,5.
- Сбор, бассейн, аликвоту (10 мкл) и свободногоге (-20 ° C) нейтрофильные супернатанты.
- Для приготовления «NET-стандарт", оттепель одну аликвоту / донора, полученного по меньшей мере, пять отдельных доноров, смешать их и держать их на льду.
- Откажитесь размороженные образцы и использовать свежие из них для следующего эксперимента.
- Подготовьте 1: 2 серийное разведение NET-стандарта в PBS + EGTA.
- Развести DNase1-усваиваются образцы (стандартные и неизвестные супернатантов) 20 раз в PBS + EGTA и аликвоту их на ELISA планшеты, покрытые антителами захвата.
- Выдержите ELISA пластины в течение ночи при 4 ° С и промойте их три раза PBS.
- Нанести раствор антитела обнаружения (100 мкл / лунку): пероксидазу хрена, конъюгированный анти-ДНК-антитела (1: 500, мышь). Выдержите в течение 1 ч в темноте.
- После четырех промывок PBS добавляют субстрата пероксидазы TMB: 100 мкл / лунку, 30 мин. Синий окраска является показателем активности пероксидазы (NETS настоящее время).
- Остановить реакцию добавлением 100 мкл / лунку 1 М HCl.голубые решения будут желтеть (рис 5А).
- Измерить оптическую плотность при 450 нм с использованием микропланшет-фотометр.
- Для анализа данных расчета количества МРО-ДНК или комплексов гидроксиноненал-ДНК по сравнению с чистым стандартом.
- Вычитание значения оптической плотности фона в среде для анализа из всех образцов.
- Участок значения оптической плотности (Х-ось) разбавленных стандартных образцов с их относительной NET контента (Y-ось) (рис 5А).
- Используя ненасыщенного диапазон стандартной кривой установить линию тренда (использовать лучше всего подходят экспоненциальную от используемого программного обеспечения) (Рисунок 5А). Уравнение этой линии тренда определяет преобразование значений ОП для количественного количества сетками.
- Вставьте измеренные значения ОП неизвестных в уравнении тренда линии от 3.13.3 , которая даст количество НЭО в неизвестном образце в процентах от NET-стандарта (рис 5А).
- подсчитыватьсредние повторах (трехкратном повторе) и представить окончательные данные как "количества МРО-ДНК или гидроксиноненал-ДНК комплексов (% от стандарта)" (Рисунок 5С).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цифры , приведенные в этой рукописи описывают метод выделения нейтрофилов, экспериментальных процедур и нынешних представительных результатов с объяснением анализа данных. На рисунке 1 показаны последовательные стадии подготовки человеческого нейтрофилов. Этот протокол представляет собой лишь один из возможных способов выделения нейтрофилов. Это дает большое количество нейтрофилов покоя , способные к высвобождению при стимуляции сетей не . На рисунке 2 показано , как работает тест высвобождения ДНК на основе флуоресценции. С помощью флуоресцентного кинетики микропланшет - ридера высвобождения ДНК в нейтрофилы человека следуют в 96-луночных микропланшетов. Рисунок 3 объясняет каждый шаг анализа данных. Во- первых, рассчитать максимальный сигнал ДНК в нейтрофилах , обработанных сапонина (фиг.3А). Увеличение флуоресценции всегда вычисляется как разность между наибольшим значением флуоресценции и уровнем фоновой флуоресценции (
На фиг.4А представлена схема , объясняющий принципы МРО-ДНК и ЭНЧ-ДНК ИФА. 4В показаны репрезентативные иммунофлуоресцентных изображения нестимулированных, PMA- и PAO1 активированные нейтрофилах человека. Внеклеточной ДНК показывает типичную NET морфологию и совместно локализуется с MPO и цитруллинированных гистона Н4, маркер NET формирования. 6 Рисунок 4C показывает MPO-ДНК и гидроксиноненал-ДНК - релиз в нейтрофилах человека при тех же, прежних условиях (например , рис 3B, 3C и 4В). Ithe "NET" Методы ELISA были ранее охарактеризованы. 5 В кратком изложении, 2 Ед / мл ДНКазы лечение (эквивалент 1 мкг / мл концентрация ДНКазы , используемой) в течение 15 мин при комнатной температуре привело к самым высоким МРО-ДНК и гидроксиноненал-ДНК - сигналов . 5 образцов беговые (100 нг / полоса) на агарозном геле показал , что длина ДНКв выходах диапазона низких т.п.н. оптимальный ИФА сигнал. 5 ДНК overdigestion (ДНКазы доза выше , чем 20 ед / мл) или опуская либо захват или антитело обнаружения отменило сигналы ELISA. 5
Кроме того, здесь анализы и "Сетью стандарт" дополнительно отличаются (рис 5А). NET-стандарт содержит в среднем 19,5 мкг / мл внеклеточной ДНК (измеряется с использованием стандартной с известной концентрацией ДНК), 399 нг / мл MPO и 103,4 нг / мл гидроксиноненала (коммерческие ELISAkits) (п = 8). На основе общих молекулярных масс МРО (84 кДа) и гидроксиноненала (29,5 кДа) и тот факт , что 1 мкг ДНК содержит 9,91 × 10 14 нуклеотидов, NET-стандарт содержит 109 гидроксиноненал молекул и 147 молекул MPO на 1000 нуклеотидов (т.п.н. ДНК ). Двукратные серийные разведения опыты NET стандарта показали, что динамические диапазоны анализов как MPO-ДНК и ДНК-гидроксиноненал ELISA находятся между 19,0 - 609,0 нг /Концентрации мл ДНК (рис. 5б) Разведения ниже , чем 32-кратном NET стандарта привело к насыщению , тогда как разбавление выше чем 1,024-кратном не отличались от фона (рис 5B). Лечение NET стандарта с ингибиторами протеазы не изменило его результаты , полученные с помощью анализов МРО-ДНК и ДНК-гидроксиноненал , указывающими , что протеазы не мешают этих анализов (рис 5в). Таким образом, результаты , полученные в той же сети стандарта образца МРО-ДНК или ДНК-гидроксиноненал ИФА сильно коррелируют друг с другом (рис 5D). Для того, чтобы показать, что замороженные ПМН супернатанты также могут быть использованы в этих анализах, не теряя эффективности, некоторые аликвоты Конечным стандарта оставляли необработанными или другие подвергались воздействию одного или двух замораживания / оттаивания циклов, выполняемых при -20 ° С или -80 ° С (1 час интервал). Ни одна из процедур замораживания / оттаивания не повлияли на МРО-ДНК или ДНК-гидроксиноненал результаты (рис 5E). Таким образом,NET-стандарт обеспечивает надежную опорную точку в этих NET-количественной оценки анализов, позволяющих количественное сравнение чистых результатов между независимыми экспериментами.
Рисунок 1:. Выделение человеческих нейтрофилах нейтрофильных гранулоцитов были выделены из периферической крови добровольцев в соответствии с описанным протоколом. Кровь, содержащая антикоагулянт был использован для выделения нейтрофилов осаждения декстраном и центрифугирования в градиенте. Кровь без антикоагулянта использовали для получения сыворотки. Жизнеспособность препаратов нейтрофилов оценивали с помощью анализа трипанового синего. Чистота Нейтрофильная оценивается цитоспина или проточной цитометрии (CD16, CD66abcd дважды положительных клеток). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Принципы внеклеточной ДНК Release Assay (А) Флуоресценция получается только в нейтрофилах которых плазма и ядерные мембраны были скомпрометированы и мембрану непроницаемой для ДНК-связывающий краситель может связываться с их ДНК. (В) Анализ проводят на черном 96-луночный микропланшет с использованием микропланшет - флуориметра. (С) Флуориметр записывает кривые флуоресценции в реальном времени в каждую лунку. Один представитель приводит показал. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Анализ данных ДНК - релиз (.
Рисунок 4: MPO-ДНК и ДНК-гидроксиноненал ИФА:. Принцип и Представитель Результаты (A) Схема объясненияING как MPO-ДНК и ДНК-гидроксиноненал ELISA анализы работы. (Б) Представитель результаты иммунофлюоресценции изображений , приготовленных на нейтрофилах человека , подвергнутых воздействию 100 нМ РМА или P. PAO1 палочки штамма (10 MOI) в течение 4 часов. Внеклеточной ДНК (DAPI, синий) совместно локализуется в сетках с MPO (зеленый) и цитруллинированных гистона Н4 (красный). Один из представителей результат, п = 3. (C) измеряли NET релиз в нейтрофилах человека , подвергшихся воздействию тех же стимулов , как описано выше в МРО-ДНК и анализы ДНК гидроксиноненал-ELISA. Среднее ± SEM, п = 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Определение характеристик «NET-стандарт" (A) серийными разведениями. (1: 2) стандарта NET были подготовленыи подвергали МРО-ДНК ELISA. Измеренные значения OD нанесены на график% от NET стандартного контента. Красный "X" указывает на то измеренное значение ОП неизвестного образца. Серая стрелка указывает на то, как "чистой концентрации" (синий "Х") неизвестного образца должно быть определено с помощью центрального диапазона, установленного стандартной кривой. Концентрации (В) ДНК в серийно разведенными NET стандартных образцов были определены и нанесены против измеренных значений ОП МРО-ДНК или ЭНЧ-ДНК ИФА. Серые области указывают на динамические диапазоны анализов. (C) Протеаза лечение ингибитором (ингибитор протеазы коктейль, 1%) не влияет на исход МРО-ДНК или анализов гидроксиноненал-ДНК (NET-стандарт). Среднее ± SEM, п = 2. (D) Соотношение МРО-ДНК и результаты гидроксиноненал-ДНК (OD 450 нм) серийно разведенными «NET-стандарт" образцы в своих динамических диапазонах (см 5В). (Е) циклов замораживания и оттаивания ( от -20 ° C или -80 ° C; Oпе или два) не влияют на результаты МРО-ДНК и анализы гидроксиноненал-ДНК (NET-стандарт, среднее значение ± SEM, п = 2). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
НРТ представляют захватывающий новый механизм , с помощью которого нейтрофилы убивают болезнетворные микроорганизмы. 1 Хотя литература НЭО непрерывно расширяется в течение последних десяти лет с момента их открытия, несколько важных вопросов , связанных с их ролью в биологии, механизма и регулирования остаются неясными. Соответствующая методика должна быть разработана для измерения Сетки, этот уникальный антимикробной механизм. В этой статье описаны методы, которые могут быть использованы для количественной оценки сети в высокой пропускной способности способом. Первый анализ следует кинетике флуоресценции ДНК-связывающего красителя с мембраной непроницаемой. Этот анализ дает большое количество информации на склоне и скорости высвобождения ДНК из нейтрофилов. Эта информация имеет решающее значение в исследованиях, изучающих раннее сигнальных событий, приведших к образованию NET. Вся эта информация теряется в оконечных анализах измерения высвобождения ДНК в конце инкубации. Внеклеточной ДНК на основе красителя для анализа не является специфическим для сетками. Этотолько измеряет высвобождение ДНК. Для подтверждения Сетки, широко принято для выполнения иммунофлюоресценции на NET формирования нейтрофилы и показать совместной локализации ДНК либо с гранулами маркерами (MPO, гидроксиноненал) или гистонов. Количественное данных иммунофлюоресценции является хотя и очень утомительно и субъективный характер.
Здесь, модификацией ранее разработанной ELISA анализе обнаружение комплексов МРО-ДНК представлена. Аналогичный анализ ELISA для измерения гидроксиноненал-ДНК комплексов , которые представляют собой конкретные меры NET также описано. 3,5 Оба анализа были охарактеризованы в детализированным. 5 МРО-ДНК и ДНК-гидроксиноненал ELISA анализы одновременно количественный и NET конкретных . 5 Эти функции не выполняются любым другим текущим методом. Анализы легко выполнить и обеспечить воспроизводимые данные. 5 Ограниченный шаг ДНКазы пищеварение включается , что обеспечивает быструю и стандартизированную обработку НЭО непосредственно на нейтрофилы. 5 Эти анализы подходят для комстричь несколько образцов одновременно. В новых контрольных измерений показано, что циклы замораживания / оттаивания и протеаз не влияют на исход MPO-ДНК и ДНК-гидроксиноненал анализов. Неизвестно, однако, является ли белки , известные связываются с ДНК в сетках (включая гистоны и LL-37) 1,11 затрудняла бы этих анализов.
Критические этапы представленных протоколов являются следующие. Важно собрать нейтрофилы, которые находятся в покое, состояние покоя и не выделяют большое количество НЭО спонтанно. Отсутствие гипотонического лизиса шага, чтобы удалить эритроциты в представленном протоколе изоляции нейтрофильный имеет решающее значение для получения неактивированных нейтрофилы. Для ингибирования активации нейтрофилов после того, как клетки были очищены, также важно для ресуспендирования нейтрофилы в среде, содержащей сыворотку, собственный их донора. Для получения покоящихся клеток также важно использовать pyrogen- и без загрязнения реагентов в процессе подготовки нейтрофилов. Спонтаменное NET высвобождение нейтрофилов при анализе внеклеточной ДНК высвобождения также может произойти. Добавление 1% аутологичной сыворотки в среде для анализа важно, чтобы предотвратить его. Более высокие или более низкие дозы аутологичной сыворотки могут быть протестированы, чтобы получить оптимальные результаты. Это имеет решающее значение во время МРО-ДНК и анализы гидроксиноненал-ДНК ELISA, выпустившей ДНК не должна быть чрезмерно переваривается ДНКазы, так как это приведет к полной потере сигнала. Таким образом, оптимальная доза должна быть определена для каждой новой партии ДНКазы. Параметры переваривания ДНК может быть немного изменен, чтобы получить самый высокий ELISA сигналы возможно. Кроме того, важно, чтобы смешать ДНКазы и сетки тщательно, чтобы гарантировать, что ДНКазы будет иметь четкий доступ к ДНК. При заготовке переваренных Сетки, мыть хорошо экстенсивно, чтобы собрать все сетками.
Предел обнаружения ДНК МРО-ДНК и анализы гидроксиноненал-ДНК составляет около 10-20 нг / мл ДНК (Фиг.5В). Уровни сыворотки и плазма без ДНК разъединятьаль сто до тысяч нг / мл были зарегистрированы при заболеваниях (рак, системная красная волчанка, инфаркт инфекции) , которые были связаны с ненормальным образованием NET. 12-14 Это говорит о том, что МРО-ДНК и ДНК-гидроксиноненал ELISA анализы также имеют потенциал чтобы иметь возможность количественно оценить сети в клинических образцах человека. Это будущее применение МРО-ДНК и ДНК-гидроксиноненал ELISA анализов позволит количественно связать сеток патогенеза заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human Neutrophil Elastase Rabbit Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2,000x coated |
| Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) | Millipore | 07-496 | 1:2,000x coated |
| DNase-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µg/ml used for digestion |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2.5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Cell death detection ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Microplate Spectrophotometer | Biotek | ||
| Gen5 All-in-One microplate software | Biotek | analytical tool (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0.2% final concentration/volume |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | Use 10 mM final concentration. |
| 1 M glucose | Sigma | Use 5 mM final concentration. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM final used |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Conical tubes 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Conical tubes 50 ml | Thermoscientific | 339652 | |
| Percoll (pH 8.5-9.5) | Sigma | P 1644 | Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G |
| Dextran | Spectrum | D1004 | |
| RPMI 1640 media | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 well assay plate black plate clear bottom | Costar | 3603 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
- Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34 (2013).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
- Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
- Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
- Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205 (2013).
- Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
- Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
- Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
- Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).
