Protocol
ジョージア大学の治験審査委員会は、健康なボランティア（UGAの＃2012-10769-06）から末梢血を収集するために、ヒト対象の研究を承認した。5,7,8ボランティアは、採血前に必要なインフォームドコンセントフォームに署名しました。この記事で行った研究は、ヘルシンキ宣言のヒトを対象とする医学研究のための倫理ガイドラインに準拠しています。
末梢ヒト血液からの好中球の1の単離（図1）
注：末梢血から好中球を分離する方法はいくつかあります。以下のプロトコルは、一つの可能性を提供します。このプロトコルは、外部刺激によりネットを放出することができる非活性化ヒト好中球を大量に得られます。 40ミリリットル静脈穿刺することにより、健康なボランティアから得た全血を使用してください。7,9
- 2 50mlコニカルチューブに小分けし20ミリリットルの血液。 10ミリリットル6％デキストランを追加します。穏やかに混合します。
- 20分には、白血球RICを転送した後、きれいな50mlコニカルチューブに任意のペレット化赤血球を取り、滅菌PBSでそれを埋めることなく、時間上相。
- 400×gで10分で遠心分離します。 4ミリリットル滅菌PBSで再懸濁ペレット。
- コニカルチューブと各勾配の上の層2ミリリットルの白血球サスペンション2 15mlに85％-80％-75％-70％-65％の5段階パーコール勾配を準備します。
- ブレーキをオフにした状態で30分間遠心分離800×gで。
- 80分の75％〜70％/ 75％の界面で層内のすべてのセル（好中球）を収集します。
- （350×gで、10分、RT）PBSで2回細胞を洗浄し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。
マイクロプレート蛍光光度計を用いて細胞外DNA放出動態の2.測定
注：この方法は、96ウェルマイクロプレート形式でのDNAの放出（ 図2）を示し、膜不透過性DNA結合色素の蛍光の変化を測定することができます。
- アッセイ培地中で好中球の懸濁液を調製（HBSS +2×10 6細胞/ mlの濃度で1％（v / v）の自己血清+ 5mMグルコース）。
- 膜不透過性DNA結合色素の5マイクロモル/ Lを追加します。穏やかに混合します。
- 小分けしたヒト好中球（50μL/ウェル）を96ウェル黒色、透明底の上にマイクロプレート。アッセイ培地は、ウェルの底部全体を覆っていることを確認してください。ない場合は、サイドを軽くプレートをタップします。
- 37℃で10分間、好中球を含むプレートをウォームアップ。
- その間に（37°C暖かいアッセイ培地中で）使用するそれらの最終濃度の二重で刺激の溶液を調製します。ポジティブNETコントロールは最大NETの放出を誘発するために4時間100nMのホルボールミリステートアセテート（PMA）でヒト好中球を使用するように自発的なNET形成が低い5,8をまま。4時間5,8 PMA刺激は、最大NETのリリースを保証します。
- 測定用のマイクロプレート蛍光光度計（4時間、37℃、励起および発光のための590 nmの530 nm）を準備します。</李>
- 50μlの好中球懸濁液に50μlの刺激溶液を添加することによって、好中球を刺激します。最大のDNA解除信号を測定するための1つのウェル中の0.5μg/ mlのサポニンを使用してください。
- リーダーにプレートを置きなしに振盪しながら、2分毎に4時間蛍光の変化を測定します。
- データ解析のために、経時的な蛍光の正規化された増加を計算します。
- サポニンを含むすべてのウェルのエンドポイント値から減算基準蛍光（ 図2A、B）。サポニン蛍光の上昇が最も高い信号でなければなりません。これは、「最大のDNAの放出」（ 図2A）と呼ばれます。
- 最大のDNAの放出により、未知の試料の蛍光の増加を分割することによって、未知の試料中のDNAの放出の割合を計算します。
- 反復試験の平均結果とは、「最大のDNA放出の％」（ 図2C）としてそれらを提示します。
NETフォームの3定量MPO-DNAとHNE-DNA ELISAアッセイによってエーション
注：私たちの研究室でこれらの修飾されたアッセイ（MPO-DNA）または（HNE-DNA）を設立は、MPO-DNAとHNE-DNA複合体のレベルを測定することにより、NET形成を定量5。
- コート96ウェル高結合一晩捕捉抗体（50μL/ウェル）容量ELISAプレートを抗MPO（1：2,000希釈）または抗HNE（1：2,000）。
- PBSで洗浄ELISAは、プレートを三回（200μL/ウェル）、室温で2時間、5％BSAおよび0.1％ヒト血清アルブミンでそれらをブロックし（200μL/ウェル）。 PBSで3回洗浄します。
- 種子上で96ウェルマイクロ100μl/ウェルのアッセイ培地中100,000細胞の密度で、好中球、およびNET形成を刺激します。細胞をインキュベート：37°Cで4時間。
- 好中球の上清に2 U / mlのDNアーゼを添加することにより、限られたDNase消化を行い、それらをよく混ぜます。室温で保管してください。
- 11μlの25 mMのEGTA（最終濃度2.5 mMの）を添加することによって15分後にDNアーゼを停止します。よく混ぜます。 suコマンドを収集きれいな微量遠心管でpernatants。スピン試料は、室温で5分間、300×gで細胞破片を取り除くために。きれいなマイクロチューブの中にそれらの上清を移します。準備が整うまで氷上で保管してください。
- 先に調製した「NET標準」のアリコートを使用してください。
注：NET-標準は、少なくとも5つの異なる、独立したヒトのドナーから採取PMA刺激好中球のDNアーゼ消化上清のミックスです。- 長い間、同じ規格を使用するには、各個々のドナーからの好中球の上清を大量に収集し、分取。例えばPMA刺激好中球のDNアーゼ消化上清の2ミリリットルを収集する200 ELISAプレートのための十分な200アリコート（10μlの各）になります。 NET規格を特徴付けるデータは、 図5に見られます。
- 4時間100nMのPMAでヒト好中球を刺激し、ステップ3.4から3.5記載のそれらの上清にDNアーゼダイジェストを適用します。
- 収集し、プール、アリコート（10μL）および無料ZE（-20°C）、好中球の上清。
- 少なくとも5つの別々のドナーから得られた1つのアリコート/ドナー解凍、「標準NET」を作製するには、それらを混合し、氷上で保管してください。
- 解凍したサンプルを破棄し、次の実験のために新鮮なものを使用します。
- PBS + EGTAでNET-標準の2連続希釈：1を準備します。
- DNase1消化サンプル（標準および未知の上清）をPBS + EGTAで20倍に希釈し、捕捉抗体でコーティングしたELISAプレート上に分注し。
- 4°Cで一晩ELISAプレートをインキュベートし、PBSでそれらを3回洗浄します。
- 検出抗体溶液を適用し（100μl/ウェル）：ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗DNA抗体（1：500、マウス）。暗所で1時間インキュベートします。
- 100μl/ウェル、30分：PBSで4回洗浄した後、TMBペルオキシダーゼ基質を追加します。ブルー着色はペルオキシダーゼ活性（現在のNET）の指標です。
- 100μl/ウェルの1MのHClを加えて反応を停止します。ザ青のソリューションは、黄色（ 図5A）を回します。
- マイクロプレート光度計を用いて450nmでの吸光度を読みます。
- データ分析のために、NETの標準と比較して、MPO-DNAまたはHNE-DNA複合体の量を計算します。
- すべてのサンプルからのアッセイ培地のバックグラウンド光学密度値を差し引きます。
- それらの相対的なネットコンテンツ（Y軸）（ 図5A）に対して希釈標準試料の吸光度値（X軸）のプロット。
- この標準曲線の非飽和範囲を使用すると（ 図5A）（使用したソフトウェアから最良指数フィットを使用）トレンドラインを確立します。このトレンドラインの式はのNETの定量的な量にOD値の変換を決定します。
- NET-標準（ 図5A）の割合として未知試料中のNETの量を与えます3.13.3からのトレンドライン式に未知数の測定OD値を挿入します。
- 計算複製（三重）の平均値と（ 図5C）「MPO-DNAまたはHNE-DNA複合体（標準の％）の量」として、最終的なデータを提示します。
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Representative Results
この原稿の図では、好中球の分離、実験手順、およびデータ分析の説明に存在する代表的な結果の方法を説明する。 図1は、ヒト好中球の準備の逐次工程を示しています。このプロトコルは、好中球の分離の唯一の1つの可能な方法を表しています。これは、刺激の際にネットを放出することができる好中球を休んを大量に生み出す。蛍光ベースのDNA放出アッセイがどのように機能するかを図2に示す図 。ヒト好中球におけるDNAリリースの蛍光マイクロプレートリーダー動態は、96ウェルマイクロプレートに続いている使用。 図3は、データ分析の各ステップを説明します。まず、サポニン（ 図3A）で処理された好中球の最大のDNA信号を計算します。蛍光の増加は、常に最高の蛍光値とバックグラウンド蛍光レベル（の間の差として計算されます
図4Aは、 図4Bは 、非刺激PMA-とPAO1活性化ヒト好中球の代表的な免疫蛍光画像を示す。MPO-DNAとHNE-DNA ELISAアッセイの原理を説明するスキームを示します。外DNAは、典型的なNET形態を示し、MPOとシトルリン化ヒストンH4、NET形成のマーカーとの共局在化する。6 図4Cは、MPO-DNAおよび図3B、3Cと同じような、上記の条件（下のヒト好中球におけるHNE-DNAの放出を示しますおよび4B）。 IThe「NET」ELISA法は、以前に特徴付けられている。5簡単に説明すると、室温で15分間、2 U / mlのDNアーゼ処理（使用DNアーゼを1μg/ mlの濃度に相当）は、最高MPO-DNAとHNE-DNA信号が得られましたアガロースゲル上で5ランニングサンプル（100 ngの/レーン）は、そのDNAの長さを明らかにしました下kbの範囲で歩留まり最適なELISAシグナル。5 DNAの過剰消化（DNアーゼがより高い20 U / mlの用量）または省略するキャプチャまたは検出抗体のいずれかは、ELISAシグナルを廃止した。5
なお、ここでのアッセイおよび「NET-標準」はさらに、（ 図5A）を特徴としています。 NET規格は平均19.5 / mlの細胞外（既知のDNA濃度を有する標準を用いて測定した）DNA、399 ngの/ mlのMPOおよび103.4 ng / mlでのHNE（市販ELISAkits）に含まれていた（n = 8）。 MPO（84キロダルトン）およびHNE（29.5キロダルトン）の合計分子量および1μgのDNAが9.91×10 14個のヌクレオチドを含むという事実に基づき、NET-標準は109 HNE分子1000ヌクレオチド当たり147 MPO分子（kbのDNAが含まれています）。 NET-標準の2倍連続希釈実験は、MPO-DNAとHNE-DNA ELISAの両方のアッセイのダイナミックレンジの間であることを明らかにした19.0から609.0 ngの/mlのDNA濃度（ 図5B）。より高い1024倍の希釈液は、背景（ 図5B）と異ならなかったのに対し、NET標準の32倍よりも低いの希釈液は飽和状態になりました。プロテアーゼ阻害剤とのNET標準の治療は、プロテアーゼがこれらのアッセイ（ 図5C）に干渉しないことを示すMPO-DNAとHNE-DNAアッセイによって得られ、その結果を変更しませんでした。したがって、結果は互いに強く（ 図5D）と相関アッセイMPO-DNAまたはHNE-DNA ELISAによって同じNET-標準試料で得られました。凍結PMN上清は効率を失うことなく、これらのアッセイにおいても使用できることを示すために、NET-標準のいくつかのアリコートは未処理のままにしたか、他のものは-20℃で実行される1つまたは2回の凍結/解凍サイクルにさらされるか、-80℃〜ました（1時間間隔）。凍結/解凍処理のいずれも、MPO-DNAまたはHNE-DNAの結果（ 図5E）を影響を受けません。要約すると、NET-標準の独立した実験の間NET結果の定量的な比較を可能にするこれらのNET-定量アッセイにおける信頼性の基準点を提供します。
図1： ヒト好中球好中球顆粒球の単離が記載されたプロトコールに従ってボランティアの末梢血から単離しました。抗凝固剤を含む血液をデキストラン沈降及び勾配遠心分離により好中球を単離するために用いました。抗凝固剤なしの血液、血清を調製しました。好中球調製物の生存率は、トリパンブルー排除アッセイによって評価されます。好中球の純度はサイトスピンによって評価またはフローサイトメトリーされている（CD16は、二重陽性細胞をCD66abcd）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 細胞外DNA放出アッセイの原理は、（A）蛍光のみが、そのプラズマと核膜侵害されていると、膜不透過性DNA結合色素は、そのDNAに結合することができ、好中球で得られます。 （B）このアッセイは、マイクロプレート蛍光光度計を使用して、マイクロプレート黒色96ウェル上で実行されます。 （C）蛍光光度計は、各ウェル中のリアルタイム蛍光曲線を記録します。示さにおける一つの代表的な結果。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：DNAリリースデータの解析（。
図4：MPO-DNA とHNE-DNA ELISAアッセイ：原理と代表的な結果 （A）スキームを説明しますどのようにMPO-DNAとHNE-DNA ELISAアッセイ作業をる。 （B）、100nMのPMAまたはPにさらされ、ヒト好中球上に作製した免疫蛍光画像の代表的な結果緑膿菌 PAO1株4時間（10 MOI）。外DNA（DAPI、青）MPO（緑）、シトルリン化ヒストンH4（赤）とのNETで共局在します。一つの代表的な結果はn = 3（C）は、NET放出はMPO-DNA及びHNE-DNA ELISAアッセイによって上記と同じ刺激に曝さヒト好中球で測定しました。平均±SEM、N = 3 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：「NET- 標準」の特性 （A）連続希釈液（1：2）NET規格の物を調製しましたそして、MPO-DNA ELISAに供しました。測定されたOD値は、NET-標準含量の％に対してプロットされています。赤い「X」は、未知試料の測定されたOD値を示しています。灰色の矢印は、未知のサンプルの「NET濃度」（青い "X"）が当てはめられた標準曲線の中央範囲を使用して決定する方法を示します。段階希釈したNET-標準試料における（B）DNA濃度を測定し、MPO-DNAまたはHNE-DNA ELISAアッセイの測定されたOD値に対してプロットしました。灰色の領域は、アッセイのダイナミックレンジを示しています。 （C）プロテアーゼ阻害剤治療（プロテアーゼ阻害剤カクテル、1％）MPO-DNAまたはHNE-DNAアッセイ（NET-標準）の結果には影響しません。平均±SEM、nはそのダイナミックレンジで連続的に希釈した「NET-標準」のサンプルのMPO-DNAとHNE-DNAの結果（OD 450 nm）での= 2（D）の相関（図5（b）を参照してください）。 （E）凍結融解サイクル（-20°Cまたは-80°Cを、O）NEまたは2は、n = 2）。、、MPO-DNAとHNE-DNAアッセイ（NET-標準の結果に影響を与える値±SEMを意味するものではありません。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ネットは好中球が病原体を殺すことにより、魅力的な新たなメカニズムを表しています。1のNETの文献は継続的に発見以来、過去10年間にわたって拡大してきたが、生物学、機構及び調節におけるその役割に関連するいくつかの重要な問題は不明のまま。適切な方法論はネット、この非常にユニークな抗菌メカニズムを測定するために開発されなければなりません。この記事では、高スループットの方法でネットを定量するために使用できる方法について説明します。第一のアッセイは、膜不透過性DNA結合色素の蛍光の動態に従います。このアッセイは、好中球からのDNAの放出の傾斜と速度に大量の情報を提供します。この情報は、NET形成につながる早期のシグナル伝達事象を研究調査において非常に重要です。全てのこの情報は、インキュベーションの最後にDNAの放出を測定するエンドポイントアッセイで失われます。外DNA染料ベースのアッセイは、ネットに対して特異的ではありません。それDNAのみのリリースを測定します。ネットを確認するために、広くNET-形成好中球の免疫蛍光を実行し、顆粒マーカー（MPO、HNE）またはヒストンのいずれかを用いたDNAの共局在を示すことが認められています。免疫蛍光データの定量化は、しかし、非常に退屈で主観的です。
ここでは、MPO-DNA複合体を検出する以前に開発されたELISAアッセイの修正が提示されます。特定NET措置を表すHNE-DNA複合体を測定する同様のELISAアッセイも記載されている。3,5両アッセイは、詳細に特徴付けられている。5 MPO-DNAとHNE-DNA ELISAアッセイを同時に定量的およびNET固有のものです5これらの機能は、他の現在の方法によって実現されていません。アッセイは、実行し、再現性のあるデータを提供するのは簡単です。直接好中球上のNETの迅速かつ標準化された処理を確実に制限されたDNase消化ステップが含まれている5。5これらのアッセイは、comのに適しています同時にいくつかのサンプルを削減します。新しい、対照測定では、その回の凍結/融解サイクルを示しており、プロテアーゼはMPO-DNAとHNE-DNAアッセイの結果には影響しません。これは、既知のタンパク質は、これらのアッセイを妨害する1,11（ヒストンおよびLL-37を含む）のNETでDNAに結合するかどうか、しかし、不明です。
提示されたプロトコルの重要なステップは以下の通りです。休止、休止状態にあり、自発的にのNETを大量に放出しない好中球を収穫することが重要です。提示された好中球の分離プロトコルで赤血球を除去するための低張溶解工程の欠如は、非活性化された好中球を得ることが重要です。細胞を精製した後の好中球活性化を阻害するために、彼らの提供者自身の血清を含む培地中で好中球を再懸濁することも重要です。静止細胞を得るためには、好中球の調製の間に発熱物質と汚染のない試薬を使用することも重要です。 Sponta外DNA放出アッセイ中の好中球のジニアスNETリリースには、発生する可能性があります。アッセイ培地に1％の自己血清を追加することを防止することが重要です。自己血清のより高いまたはより低い用量は、最適な結果を得るために試験することができます。それは、信号が完全に失われますので、DNAはDNアーゼによってオーバー消化すべきではない解放MPO-DNAとHNE-DNA ELISAアッセイの間に非常に重要です。従って、最適な投与量は、すべての新しいDNアーゼバッチのために決定されるべきです。 DNA消化のパラメータはわずかに最高ELISA可能な信号を得るために変更することができます。 DNアーゼは、DNAへの明確なアクセス権を持っているであろうことを保証するために徹底的にDNアーゼとネットを混合することも重要です。消化されたネットを収穫すると、すべてのネットを収集するために広範囲によく洗います。
MPO-DNAとHNE-DNAアッセイのDNAの検出限界は約10から20 ngの/ mlのDNA（ 図5B）です。重度の血清および血漿中遊離DNAレベルアル10万にng / mlで、異常NET形成に関連している疾患（癌、全身性エリテマトーデス、心筋感染）で報告された。12-14これはMPO-DNAとHNE-DNA ELISAアッセイはまた、可能性を秘めていることを示唆していますヒト臨床サンプル中のネットを定量することができるようにします。 MPO-DNAとHNE-DNA ELISAアッセイのこの将来のアプリケーションは、定量的に、疾患の病因にネットをリンクできるようになります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human Neutrophil Elastase Rabbit Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2,000x coated |
| Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) | Millipore | 07-496 | 1:2,000x coated |
| DNase-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µg/ml used for digestion |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2.5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Cell death detection ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Microplate Spectrophotometer | Biotek | ||
| Gen5 All-in-One microplate software | Biotek | analytical tool (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0.2% final concentration/volume |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | Use 10 mM final concentration. |
| 1 M glucose | Sigma | Use 5 mM final concentration. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM final used |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Conical tubes 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Conical tubes 50 ml | Thermoscientific | 339652 | |
| Percoll (pH 8.5-9.5) | Sigma | P 1644 | Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G |
| Dextran | Spectrum | D1004 | |
| RPMI 1640 media | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 well assay plate black plate clear bottom | Costar | 3603 |
References
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