Protocol
De Institutional Review Board van de Universiteit van Georgia goedgekeurd het menselijk subject onderzoek van de perifere bloed van gezonde vrijwilligers (UGA # 2012-10769-06) te verzamelen. 5,7,8 Vrijwilligers tekende de vereiste informed consent formulier voor bloedafname. Het onderzoek uitgevoerd in dit artikel is in overeenstemming met de ethische richtlijnen voor medisch onderzoek met mensen van de Verklaring van Helsinki.
1. Isolatie van neutrofielen uit perifeer menselijk bloed (figuur 1)
Opmerking: Er zijn verschillende manieren om neutrofielen uit perifeer bloed te isoleren. Het volgende protocol voorziet één mogelijkheid. Dit protocol levert grote aantallen niet-geactiveerde humane neutrofielen kan vrijgeven NET op externe stimulatie. Gebruik 40 ml bloed van gezonde vrijwilligers verkregen door venapunctie. 7,9
- Aliquot 20 ml bloed in twee 50 ml conische buizen. Voeg 10 ml 6% dextran. Meng voorzichtig.
- Na 20 min overdracht van de leukocyten-rich bovenste fase zonder enige vorm van pellets rode bloedcellen in schone 50 ml conische buizen en vul het met steriele PBS.
- Centrifugeer bij 400 x g 10 min. Resuspendeer pellet in 4 ml steriele PBS.
- Bereid een 5-staps Percoll gradiënt van 85% -80% -75% -70% -65% in twee 15 ml conische buizen en laag 2 ml leukocyt suspensie bovenop elkaar gradiënt.
- Centrifuge 800 g gedurende 30 min met remmen los.
- Verzamel alle cellen (neutrofielen) in lagen op de 75% / 80% en 70% / 75% interface.
- Was de cellen tweemaal in PBS (350 xg, 10 min, RT) en cellen te tellen met een hemocytometer.
2. Meting van de kinetiek van extracellulaire DNA release Met behulp van een Microplate Fluorimeter
Opmerking: deze methode kan de meting van veranderingen in fluorescentie van een membraan ondoorlaatbare DNA-bindende kleurstof die indicatief is voor DNA afgifte aan een 96-well microplaat formaat (Figuur 2).
- Maak een suspensie van neutrofielen in testmedium (HBSS +1% (v / v) autoloog serum + 5 mM glucose) in een concentratie van 2 x 10 6 cellen / ml.
- Voeg 5 micromol / l van het membraan ondoordringbaar DNA-bindende kleurstof. Meng voorzichtig.
- Aliquot menselijke neutrofielen (50 pl / putje) op 96-well zwart, transparant bodem microtiterplaten. Controleer het testmedium bestrijkt de gehele bodem van de put. Zo niet, dan tikt u op de plaat voorzichtig op de zijkant.
- Verwarm de plaat met neutrofielen gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- In de tussentijd worden de oplossingen van stimuli op het dubbele van hun uiteindelijke concentraties te worden gebruikt (in 37 ° C warm assay medium). Als een positieve controle NET gebruiken humane neutrofielen met 100 nM forbol-myristaat-acetaat (PMA) gedurende 4 uur tot maximaal NET versie te activeren. 5,8 PMA stimulatie voor 4 uur garandeert maximale netto vrijval terwijl spontane NET formatie blijft laag 5,8.
- Bereid de microplaat fluorimeter voor het meten (4 uur, 37 ° C, 530 nm voor excitatie en 590 nm voor emissie). </ Li>
- Neutrofielen stimuleren door toevoeging van 50 ul stimulus oplossing van 50 gl neutrofielen suspensies. Gebruik 0,5 ug / ml saponine in een put om maximale DNA afgifte signaal te meten.
- Plaats de plaat in de reader en de veranderingen in fluorescentie gedurende 4 uur bij elke 2 min zonder schudden meten.
- Gegevensanalyse Bereken genormaliseerde toename in fluorescentie in de tijd.
- Aftrekken van de basislijn fluorescentie eindpunt waarden van alle putjes zoals saponine (Figuur 2A, B). Stijging van de saponine fluorescentie moet de hoogste signaal. Het wordt aangeduid als "maximale DNA afgifte" (Figuur 2A).
- Percentages berekenen van DNA afgifte in onbekende monsters door het delen toename in fluorescentie van onbekende monsters door DNA maximale afgifte.
- Gemiddelde resultaten van herhalingen en presenteren als "% van de maximale DNA release" (figuur 2C).
3. kwantificering van NET Formatie van MPO-DNA en DNA-HNE ELISA assays
Opmerking: Deze testen gemodificeerd (MPO-DNA) of gevestigde (HNE-DNA) in ons laboratorium kwantificeren netvorming door het meten van niveaus van MPO-DNA en HNE-DNA complexen 5.
- Coat 96-well high-bindend vermogen ELISA-platen 's nachts met capture antilichamen (50 pl / putje): anti-MPO (1: 2000 verdunning) of anti-HNE (1: 2000).
- Wassen ELISA platen driemaal met PBS (200 ul / putje) en blokkeren met 5% BSA en 0,1% menselijk serum albumine gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (200 ui / putje). Spoel driemaal met PBS.
- Zaad neutrofielen op 96-putjes bij een dichtheid van 100.000 cellen / putje in 100 pl assaymedium en stimuleren netvorming. Incubeer cellen: 4 uur 37 ° C.
- Voer een beperkte DNase spijsvertering door toevoeging van 2 U / ml DNase neutrofielen supernatanten, meng ze goed. Houd ze bij RT.
- Stop de DNase na 15 min door het toevoegen van 11 pi 25 mM EGTA (eindconcentratie 2,5 mm). Goed mengen. Verzamel supernatants in schone microfugebuizen. Spin monsters kwijt celresten bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Transfer hun supernatanten in schone microcentrifuge buizen. Houd ze op ijs pas klaar.
- Gebruik een hoeveelheid van een eerder bereide "NET standaard".
Opmerking: De NET-standaard is een mix van DNase gedigereerd supernatanten van PMA-gestimuleerde neutrofielen verkregen uit ten minste 5 verschillende, onafhankelijke menselijke donors.- Op hetzelfde niveau gedurende lange tijd, verzamelen en aliquot een grote hoeveelheid neutrofielen supernatanten van elke donor. Verzamelen bijvoorbeeld 2 ml DNase-gedigereerde supernatanten van PMA-gestimuleerde neutrofielen zal resulteren in 200 monsters (10 pl elk) genoeg 200 ELISA platen. Kenmerkende gegevens NET norm in figuur 5.
- Stimuleer menselijke neutrofielen met 100 nM PMA gedurende 4 uur en van toepassing DNase verteren hun supernatanten volgens stappen 3,4-3,5.
- Verzamel, zwembad, monster (10 pl) en gratisZE (-20 ° C) neutrofiel supernatanten.
- Om de "NET-standaard" voor te bereiden, dooi een portie / donor verkregen uit ten minste vijf afzonderlijke donors, meng ze en houd ze op ijs.
- Gooi ontdooide monsters en het gebruik van verse die voor het volgende experiment.
- Bereid een 1: 2 seriële verdunning van de NET-standaard in PBS + EGTA.
- Verdun DNase1-verteerd samples (standaard en onbekende supernatanten) 20-voudig in PBS + EGTA en aliquot ze op ELISA-platen bekleed met capture antilichamen.
- Incubeer ELISA platen overnacht bij 4 ° C en wassen driemaal met PBS.
- Solliciteer detectie antilichaam-oplossing (100 ul / putje): mierikswortelperoxidase geconjugeerd anti-DNA antilichaam (1: 500, muis). Incubeer gedurende 1 uur in het donker.
- Na vier wassingen met PBS toe te voegen TMB peroxidasesubstraat: 100 ul / well, 30 min. Blauw kleuring is een indicatie voor peroxidase activiteit (NET aanwezig).
- Stop reactie door het toevoegen van 100 ul / putje 1 M HCl. Deblauw oplossingen zullen geel (figuur 5A) draaien.
- Lees absorptie bij 450 nm onder toepassing van een microplaat fotometer.
- Voor gegevensanalyse Bereken de hoeveelheid MPO-DNA of HNE-DNA complexen in vergelijking met de standaard NET.
- Aftrekken van de achtergrond optische dichtheidswaarde van het testmedium van alle monsters.
- Zet de absorptiewaarden (X-as) van de verdunde standaardmonsters op hun relatieve netto inhoud (Y-as) (figuur 5A).
- Met behulp van de nonsaturated bereik van deze norm curve opzetten van een trendlijn (gebruik best exponentiële fit van de gebruikte software) (Figuur 5A). De vergelijking van deze trendlijn is bepalend voor de omzetting van de OD-waarden bedragen van NET kwantitatief.
- Plaats de gemeten OD-waarden van de onbekenden in de tendens-lijn vergelijking van 3.13.3 dat het bedrag van NET in het onbekende monster als percentage van de netto-standaard (figuur 5A) zal geven.
- Berekenengemiddelden van herhalingen (drie exemplaren) en de definitieve gegevens te presenteren als "hoeveelheid MPO-DNA of HNE-DNA-complexen (% van de norm)" (figuur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De cijfers in dit manuscript beschrijven de wijze van neutrofielen isolatie, voor experimenten en presenteren representatieve resultaten met uitleg van gegevensanalyse. Figuur 1 toont de opeenvolgende stappen van humaan neutrofiel preparaat. Dit protocol vertegenwoordigt slechts één mogelijke manier van neutrofielen isolement. Het levert grote hoeveelheden rustende neutrofielen kunnen vrijgeven netten na stimulatie. Figuur 2 toont hoe de fluorescentie gebaseerde DNA-afgifte assay werkt. Met fluorescentie- microplaat reader kinetiek van DNA introductie in humane neutrofielen gevolgd in 96-well microtiterplaten. Figuur 3 legt elke stap van de gegevensanalyse. Bereken eerst DNA maximale signaal neutrofielen behandeld met saponine (Figuur 3A). Toename in fluorescentie wordt altijd berekend als het verschil tussen de hoogste waarde en de fluorescentie achtergrondfluorescentie niveau (
Figuur 4A toont het schema uitleggen van de principes van de MPO-DNA en DNA-HNE ELISA assays. Figuur 4B toont representatieve immunofluorescentie afbeeldingen nonstimulated, PMA- en PAO1 geactiveerde humane neutrofielen. Extracellulair DNA toont typische NET morfologie en co-lokaliseert met MPO en citrullinated histon H4, een marker van netvorming. 6 Figuur 4C toont MPO-DNA en HNE-DNA afgifte in humane neutrofielen onder dezelfde, bovenstaande voorwaarden (zoals in Figuur 3B, 3C en 4B). IDe "NET" ELISA werkwijzen zijn eerder gekarakteriseerd. 5 kort werden 2 U / ml DNase behandeling (equivalent van 1 ug / ml concentratie van de DNase gebruikt) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur resulteerde in de hoogste MPO-DNA en HNE-DNA signalen . 5 Running monsters (100 ng / laan) op een agarosegel gebleken dat DNA lengtein het onderste kb bereik opbrengsten optimaal ELISA-signaal. 5 DNA overdigestion (DNase dosis hoger dan 20 U / ml) of het weglaten van ofwel het vangen of de detectie antilichaam afgeschaft de ELISA signalen. 5
Bovendien, hier de testen en de "NETWORK standaard" zijn verder gekarakteriseerd (Figuur 5A). NET-standaard bevat gemiddeld 19,5 pg / ml extracellulair DNA (gemeten met een standaard met bekende DNA-concentraties), 399 ng / ml MPO en 103,4 ng / ml HNE (commercieel ELISAkits) (n = 8). Betrokken op het totale molecuulgewicht van MPO (84 kDa) en HNE (29,5 kDa) en het feit dat 1 ug DNA bevat 9,91 x 10 14 nucleotiden, de NET-standaard bevat 109 HNE moleculen en 147 MPO moleculen per 1000 nucleotiden (kb DNA ). Tweevoudige seriële verdunning van de experimenten NET-standaard toonde aan dat de dynamische bereiken van zowel de MPO-DNA en DNA-HNE ELISA assays tussen 19,0-609,0 ng /ml DNA concentraties (Figuur 5B). Verdunningen van minder dan 32-voudige van de NET standaard resulteerde in verzadiging terwijl verdunningen van meer dan 1024-voudig waren niet anders dan de achtergrond (figuur 5B). Behandeling van het NET standaard met proteaseremmers leverde de resultaten die de MPO-DNA en DNA-assays HNE aangeeft dat proteasen niet interfereren met deze assays (figuur 5C) wijzigen. Zo behaalde resultaten in dezelfde NET-standaard monster door de MPO-DNA of HNE-DNA ELISA-testen sterk met elkaar correleren (figuur 5D). Aantonen dat ingevroren PMN supernatanten ook kan worden gebruikt in deze testen zonder verlies van efficiëntie, enkele porties van het NET-standaard werden onbehandeld gelaten of anderen werden blootgesteld aan één of twee vries / dooicycli uitgevoerd bij -20 ° C of -80 ° C (1 uur interval). Geen van de vries / dooi behandelingen invloed op de MPO-DNA of HNE-DNA resultaten (Figuur 5E). Samengevat, deNET-standaard biedt een betrouwbaar referentiepunt in deze-NET kwantificeren assays waardoor de kwantitatieve vergelijking van het nettoresultaat tussen onafhankelijke experimenten.
Figuur 1:. Isolatie van menselijke neutrofielen neutrofiel granulocyten werden geïsoleerd uit perifeer bloed van vrijwilligers volgens de beschreven protocol. Bloed met anticoagulant werd gebruikt om neutrofielen door dextran sedimentatie en centrifugatie geïsoleerd. Bloed zonder antistollingsmiddel werd gebruikt om serum te bereiden. Levensvatbaarheid van de neutrofielen preparaten wordt bepaald door trypan blauw exclusietest. Neutrofielen zuiverheid wordt beoordeeld door cytospin of flowcytometrie (CD16, CD66abcd dubbel-positieve cellen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Principes van het extracellulaire DNA afgifte assay (A) Fluorescentie wordt alleen verkregen neutrofielen waarvan plasma en nucleaire membranen zijn gecompromitteerd en het membraan ondoorlaatbare DNA-bindende kleurstof kan binden aan hun DNA. (B) De test wordt uitgevoerd op zwarte 96-well microplaten met een microplaat fluorimeter. (C) De fluorimeter registreert realtime fluorescentiecurven in elk putje. Een representatieve resultaten in getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Analyse van de DNA-release Data (.
Figuur 4: MPO-DNA en HNE-DNA ELISA assays. Principe en representatieve resultaten (A) Regeling uit te leggening hoe de MPO-DNA en HNE-DNA ELISA assays werk. (B) Representatieve resultaten van immunofluorescentie beelden opgesteld op menselijke neutrofielen blootgesteld aan 100 nM PMA of P. PAO1 aeruginosa stam (10 MOI) gedurende 4 uur. Extracellulaire DNA (DAPI, blauw) co-lokaliseert in netten met MPO (groen) en gecitrullineerde histon H4 (rood). Een representatief resultaat, n = 3 (C) NET afgifte werd gemeten in menselijke neutrofielen blootgesteld aan dezelfde stimuli bovenaf door de MPO-DNA en DNA-HNE ELISA assays. Gemiddelde ± SEM, n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Karakterisering van het "NET-standaard" (A) Seriële verdunningen. (1: 2) van de standaard bereid NETen onderworpen aan DNA MPO-ELISA. Gemeten OD-waarden worden uitgezet tegen% van de netto-standaard content. Rode "X" geeft een gemeten OD-waarde van een onbekend monster. Grijze pijl geeft aan hoe de "NET concentratie" (blauw "X") van het onbekende monster moet worden bepaald met behulp van de centrale bereik van de standaarduitrusting behoren curve. (B) DNA-concentraties in serie verdund NET-standaard monsters werden bepaald en uitgezet tegen de gemeten OD-waarden van de MPO-DNA of HNE-DNA ELISA assays. Grijze gebieden geven de dynamische bereiken van de testen. (C) Protease remmer (proteaseremmer cocktail, 1%) geen invloed op de uitkomst van de MPO-DNA of DNA-HNE assays (NET-norm). Gemiddelde ± SEM, n = 2 (D) Correlatie van MPO-DNA en HNE-DNA resultaten (OD 450 nm) van serieel verdund "NET-standaard" samples in hun dynamische bereiken (zie 5B). (E) het bevriezen en ontdooien cycli (-20 ° C of -80 ° C; one of twee) hebben geen invloed op de resultaten van de MPO-DNA en HNE-DNA-testen (NET-standaard, gemiddelde ± SEM, n = 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NET's vertegenwoordigen een fascinerend nieuw mechanisme waarmee neutrofielen doden pathogenen. 1 Hoewel de literatuur van de netten is voortdurend uit te breiden in de afgelopen tien jaar sinds hun ontdekking, een aantal belangrijke vragen met betrekking tot hun rol in de biologie, mechanisme en regelgeving onduidelijk blijven. Passende methode moet worden ontwikkeld om NET's, dit zeer unieke antimicrobiële mechanisme meten. Dit artikel beschrijft methoden die kunnen worden gebruikt voor NET kwantificeren in een high throughput wijze. De eerste assay volgt kinetiek van fluorescentie van een membraan ondoorlaatbare DNA-bindende kleurstof. Deze test geeft veel informatie op de helling en de snelheid van DNA-afgifte uit neutrofielen. Deze informatie is cruciaal in het onderzoek bestuderen van vroege signalering gebeurtenissen die leiden tot de vorming van NET. Al deze informatie is niet gevonden eindpunt assays meten DNA afgifte aan het einde van de incubatie. Het extracellulaire DNA dye-gebaseerde test is niet specifiek voor NET. Hetalleen meet DNA release. Netten te bevestigen, is het algemeen aanvaard om immunofluorescentie te voeren op-NET vormen neutrofielen en tonen co-lokalisatie van DNA met ofwel korrel markers (MPO, HNE) of histonen. Kwantificering van immunofluorescentie gegevens is echter erg vervelend en subjectief.
Hier, is een modificatie van een eerder ontwikkelde ELISA assay detecteren MPO-DNA complexen gepresenteerd. Een soortgelijke ELISA test meet HNE-DNA complexen die specifieke NET vertegenwoordigen zij wordt ook beschreven. 3,5 Beide testen zijn gekenmerkt gedetailleerd. 5 De MPO-DNA en DNA-HNE ELISA assays kwantitatief en NET-specifieke tegelijkertijd . 5 Deze functies zijn niet vervuld door een andere huidige methode. De testen zijn eenvoudig uit te voeren en zorgen voor reproduceerbare gegevens. 5 is een beperkt DNase spijsvertering stap is opgenomen dat een snelle en gestandaardiseerde afhandeling van NET zorgt direct aan neutrofielen. 5 Deze testen zijn geschikt om te compare meerdere monsters tegelijk. In de nieuwe, controle metingen wordt aangetoond dat de vries / dooi cycli en proteasen hebben geen invloed op de uitkomst van de MPO-DNA en HNE-DNA-testen. Het is echter niet bekend of Proteïnen, die binden aan DNA in NET (zoals histonen en LL-37) 1,11 zou interfereren met deze assays.
Kritische stappen van de gepresenteerde protocollen zijn de volgende. Het is belangrijk om neutrofielen die in een rustende, rusttoestand en hebben veel NET niet spontaan loslaten oogsten. Gebrek aan een hypotone lysis stap om rode bloedcellen in de gepresenteerde neutrofielen isolatieprotocol verwijderen is cruciaal voor niet- geactiveerde neutrofielen te verkrijgen. Activering van neutrofielen remt nadat de cellen waren gezuiverd, is het ook belangrijk om neutrofielen opnieuw in suspensie in een medium dat serum zelf hun donor. Om rustende cellen te verkrijgen is het ook van cruciaal belang om pyrogeenvrij en vervuiling-vrije reagentia te gebruiken tijdens neutrofielen voorbereiding. Spontatane NET vrijkomen van neutrofielen tijdens de extracellulaire DNA-afgifte test kan ook gebeuren. Toevoegen van 1% autoloog serum tot het testmedium is belangrijk te voorkomen. Hogere of lagere doses van het autoloog serum kan worden getest om optimale resultaten te krijgen. Het is cruciaal tijdens de MPO-DNA en DNA-HNE ELISA assays die vrij DNA niet genoeg worden verteerd door DNase omdat het leidt tot volledig verlies van het signaal. Daarom moet de optimale dosis worden vastgesteld voor elke nieuwe lading DNase. De parameters van de DNA-digestie kan enigszins worden gewijzigd voor het verkrijgen van de hoogste ELISA signalen mogelijk. Het is ook belangrijk om de DNase en netten grondig mengen zodat de DNase vrij toegang tot het DNA hebben. Bij het oogsten van de verteerde NET, was het goed uitgebreid om alle NET's te verzamelen.
Het DNA detectielimiet van de MPO-DNA en DNA-assays HNE is ongeveer 10-20 ng / ml DNA (Figuur 5B). Serum en plasma vrij DNA niveaus van several honderd tot duizend ng / ml werden bij ziekten (kanker, systemische lupus erythematosus, myocardiale infectie) die zijn geassocieerd met abnormale netvorming. 12-14 Dit suggereert dat de MPO-DNA en DNA-HNE ELISA assays hebben ook het potentieel kunnen netten voor menselijke klinische monsters te kwantificeren. Deze toekomstige toepassing van de MPO-DNA en HNE-DNA ELISA-testen zal toelaten om kwantitatief te koppelen netten pathogenese van de ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human Neutrophil Elastase Rabbit Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2,000x coated |
| Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) | Millipore | 07-496 | 1:2,000x coated |
| DNase-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µg/ml used for digestion |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2.5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Cell death detection ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Microplate Spectrophotometer | Biotek | ||
| Gen5 All-in-One microplate software | Biotek | analytical tool (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0.2% final concentration/volume |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | Use 10 mM final concentration. |
| 1 M glucose | Sigma | Use 5 mM final concentration. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM final used |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Conical tubes 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Conical tubes 50 ml | Thermoscientific | 339652 | |
| Percoll (pH 8.5-9.5) | Sigma | P 1644 | Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G |
| Dextran | Spectrum | D1004 | |
| RPMI 1640 media | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 well assay plate black plate clear bottom | Costar | 3603 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
- Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34 (2013).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
- Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
- Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
- Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205 (2013).
- Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
- Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
- Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
- Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).
