Protocol
佐治亚大学的机构审查委员会批准的人类主体研究，以收集来自健康志愿者（UGA＃2012-10769-06）外周血。5,7,8志愿者签署抽血前所需的知情同意书。在这篇文章中进行的研究符合涉及赫尔辛基宣言人体医学研究的伦理准则。
1.人外周血中性粒细胞的分离（图1）
注意：有几种方法分离自外周血的中性粒细胞。以下方案提供了一种可能性。该协议产生大量能够对外界刺激释放教师的非激活的人中性粒细胞。使用40毫升由静脉穿刺健康志愿者获得的全血。7,9
- 分装20毫升血液进入两个50毫升锥形管。加入10 mL 6％右旋糖酐。轻轻混匀。
- 经过20分钟转移白细胞RICħ上层相而不采取任何沉淀的红细胞成清洁50ml锥形管中，并用无菌PBS填满它。
- 离心机在400 xg离心10分钟。在4毫升重悬沉淀无菌PBS。
- 制备85％的5个步骤的Percoll梯度-80％-75％-70％-65％在两个15毫升锥形管和层2毫升白细胞悬浮液在每个梯度的顶端。
- 离心机800 XG与刹车关闭30分钟。
- 收集在75％/ 80％的所有细胞（中性粒细胞）在所述层和70％/ 75％的界面。
- 在PBS中洗涤细胞两次（350 XG，10分钟，RT）和使用血球计数细胞。
2.使用微孔板荧光计外DNA释放的动力学测量
注意：此方法能够在不可透过膜的DNA结合在96孔微孔板格式指示的DNA释放的染料（ 图2）的荧光变化的测量。
- 制备悬浮液在测定培养基嗜中性粒细胞（HBSS +1％（V / V）的自体血清+ 5mM葡萄糖）以2×10 6个细胞/ ml的浓度。
- 添加5微摩尔/升的膜不可渗透的DNA结合染料。轻轻混匀。
- 等分试样的人类嗜中性粒细胞（50μl/孔）到96孔黑色，透明底微板。确保测定培养基覆盖井的整个底部。如果没有，轻轻敲击侧面的板。
- 预热10分钟的含板中性白细胞在37℃。
- 在此期间，在它们的最终浓度的两倍制备刺激方案中使用（在37℃的温水测定培养基）。作为阳性NET控制使用人嗜中性粒用100nM佛波醇肉豆蔻乙酸酯（PMA）4小时触发最大净释放。-5,8- PMA刺激4小时，确保最大净释放而自发NET形成仍然很低5,8。
- 制备微孔板荧光计进行测定（4小时，37℃，激发530nm处和用于发射590纳米）。</ LI>
- 通过加入50μl的刺激溶液至50μl嗜中性粒细胞悬浮液刺激嗜中性粒细胞。使用0.5微克/毫升皂素于一体的测量最大DNA释放信号。
- 将板阅读器，并测量每2分钟没有晃动的荧光变化4小时。
- 进行数据分析，计算随时间的荧光归增加。
- 从端点值减去基线荧光所有井包括皂苷（ 图2A，B）。上升皂素荧光应该是最高的信号。它被称为“最大的DNA释放”（ 图2A）。
- 由最大DNA释放除以未知样品的荧光增大计算未知样品中的DNA释放百分比。
- 重复的平均结果之和作为“最大的DNA释放％”（ 图2C）。
3. NET表单的定量通过通货膨胀MPO-DNA和HNE-DNA化验ELISA
注意：在我们的实验室这些测定改性（MPO-DNA）或建立（HNE-DNA）通过测量MPO-DNA和HNE-DNA复合物的水平的定量NET形成5。
- 涂层的96孔高结合过夜捕捉抗体（50μl/孔）的能力的ELISA平板：抗MPO（1：2,000稀释度）或抗HNE（1：2,000）。
- 洗涤ELISA板三次，用PBS（200μl/孔）并在室温用5％BSA和0.1％人血清白蛋白阻断它们为2小时（200μl/孔）。用PBS洗涤三次。
- 在96孔微孔板以100,000个细胞/孔在100μl测定培养基的密度种子嗜中性粒细胞，并刺激网的形成。孵育细胞：4小时37℃。
- 加入2 U / ml的DNA酶中性粒细胞上清液进行有限的DNA酶消化，以及混合。让他们在室温。
- 通过加入11微升25mM的EGTA（最终浓度2.5毫摩尔）停止15分钟后的DNA酶。拌匀。苏收集pernatants干净的离心管。自旋样品在300 xg离心除掉细胞碎片在RT 5分钟。转让其上清液到干净的离心管。让他们在冰，直到准备。
- 使用预先制备的“NET标准”的等分试样。
注意：NET-标准是由至少5个不同的，独立人供体获得的PMA刺激嗜中性粒细胞的DNA酶消化的上清液的混合。- 要使用相同的标准很长一段时间，收集并从每个捐赠者分装大量中性粒细胞上清。收集例如2毫升PMA刺激嗜中性粒细胞的DNA酶消化的上清液将导致200等份（各10微升）足以为200 ELISA板。数据表征NET标准在图5中。
- 刺激人中性粒细胞用100nM PMA 4小时，并应用DNA酶消化，以根据步骤3.4-3.5其上清液。
- 收集，游泳池，分装（10微升）和自由泽（-20°C），中性粒细胞上清液。
- 为了准备“网标”，从解冻至少五个独立的供体获得一个等份/供体，将它们混合，并保持他们在冰上。
- 丢弃解冻的样品，并使用新鲜的下一个实验。
- 准备1：PBS + EGTA网标准的2系列稀释。
- 稀释DNase1消化的样品（标准和未知上清液）20倍的PBS + EGTA和分装它们涂有捕获抗体ELISA板。
- 孵育过夜ELISA板在4℃下，并用PBS洗三次。
- 应用检测抗体溶液（100μl/孔）：辣根过氧化物酶缀合的抗DNA抗体（1：500，鼠标）。孵育在黑暗1小时。
- 洗涤四次后，用PBS加TMB过氧化物酶底物：100微升/孔，30分钟。蓝颜色是过氧化物酶活性（母语存在）的指示。
- 通过加入100μl/孔的1M HCl终止反应。该蓝色的解决方案会变成黄色（ 图5A）。
- 在使用微板光度计450nm处读取吸光度。
- 进行数据分析，计算相对于NET标准的MPO-DNA或HNE-DNA复合物的量。
- 减去从所有样品的测定培养基的背景光密度值。
- 绘制针对其相对净含量（Y轴）（ 图5A）将稀释的标准样品的吸光度值（X轴）。
- 使用该标准曲线的非饱和范围建立趋势线（采用最佳指数拟合从所使用的软件）（ 图5A）。这条趋势线的方程式决定OD值转化为定量母语的金额。
- 插入未知数的测量OD值到从3.13.3趋势线方程，这将使未知样品为NET-标准（ 图5A）的百分比在教师的量。
- 计算重复的（一式三份）平均值，并提交最终的数据（ 图5C）“MPO-DNA或HNE-DNA复合物（标准的百分比）的量。”
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Representative Results
在这个手稿附图描述嗜中性粒细胞分离，实验程序和数据分析的解释本代表性结果的方法。 图1示出人中性粒细胞的制备的顺序步骤。该协议仅表示嗜中性粒细胞分离的可能的方式。它会产生大量的休息能够刺激后释放的外籍英语教师的中性粒细胞。 图2显示了基于荧光的DNA释放试验是如何工作的。使用DNA释放的荧光酶标仪动力学在人嗜中性粒细胞中，随后在96孔微孔板。 图3说明了数据分析的每一个步骤。首先，计算在与皂甙（ 图3A）处理的中性粒细胞的最大的DNA信号。在荧光增加总是计算为最高荧光值和背景荧光水平（之间的差
图4A描述的方案说明的MPO-DNA和HNE-DNA ELISA测定。 图4B示出的非刺激，PMA-和PAO1活化人中性粒细胞代表免疫荧光图像的原理。胞外DNA显示了典型的网的形态和与MPO和瓜氨酸化组蛋白H4，NET形成的标记共定位。6 图4C示出在人嗜中性粒细胞的MPO-DNA和HNE-DNA释放一样的，以前的条件下（类似图3B，3C和4B）。 i将“NET”ELISA法先前已表征。5简要地说，2 U / ml的DNA酶处理在室温15分钟（1微克用DNA酶/ ml的浓度的当量）产生了最高的MPO-DNA和HNE-DNA信号。在琼脂糖凝胶上运行5样本（100纳克/车道）透露，DNA长度在较低kb的范围的产量最佳的ELISA信号5的DNA过量（DNA酶剂量高于20U / ml）或省略任捕获或检测抗体取消了的ELISA信号。5
此外，这里的测定法和“网络标准”的特征还在于（ 图5A）。该NET-标准平均含有19.5微克/毫升的细胞外的DNA（通过使用已知的DNA浓度标准测定），399纳克/毫升MPO和103.4毫微克/毫升HNE（商用ELISAkits）（N = 8）。基于MPO（84 kDa的）和HNE（29.5 kDa的）的总分子量和一个1微克DNA含有9.91×10 14个核苷酸的事实时，NET-标准包含109 HNE分子和每1000个核苷酸147的MPO分子（kb的DNA ）。该NET-标准的两倍连续稀释的实验表明，无论是MPO-DNA和HNE-DNA ELISA测定的动态范围之间19.0 - 609.0纳克/毫升浓度DNA（ 图5B）。比净标准的32倍下稀释导致饱和而高于1,024倍稀释液并没有从背景（ 图5B）不同。与蛋白酶抑制剂的NET标准的治疗没有改变由指示蛋白酶不与这些测定（ 图5C）干扰的MPO-DNA和HNE-DNA检测获得其结果。因此，由MPO-DNA或HNE-DNA的ELISA相同的NET-标准样品中得到的结果彼此（ 图5D）测定强烈相关。表明冷冻PMN上清液也可在这些测定中使用，而不会失去效率，NET-标准不进行处理或其他暴露于在-20℃或执行的一个或两个冷冻/解冻循环-80℃的一些等份（1小时间隔）。的冷冻/解冻处理无影响的MPO-DNA或HNE-DNA的结果（ 图5E）。综上所述，NET-标准提供这些NET-定量测定能够独立实验的最终结果的定量比较可靠的参考点。
图1： 人嗜中性粒细胞中性粒细胞的分离从人外周血根据所描述的协议中分离。含有血液抗凝剂被用来隔离葡聚糖沉淀和梯度离心中性粒细胞。无抗凝血液用于制备血清。中性粒细胞制剂的可行性是由台盼蓝排除法进行评估。中性粒细胞的纯度是通过细胞离心涂片评估或流式细胞术（CD16，CD66abcd双阳性细胞）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2： 在细胞外的DNA释放测定的原理 （A）的荧光仅在嗜中性粒细胞，其血浆和核膜已经失密和膜不透过性DNA结合染料可以结合它们的DNA获得。 （B）时在黑色96孔微量使用微板荧光计进行测定。 （C）的荧光在每个记录实时荧光曲线好。中所示的一位代表结果。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：该DNA释放数据的分析（。
图4：MPO-DNA 和HNE-DNA的ELISA试验：原理与代表性的成果 （A）计划说明ING如何MPO-DNA和HNE-DNA ELISA检测工作。 （B）对人嗜中性粒细胞制备免疫荧光图像的代表性结果暴露于100nM PMA或P.绿脓杆菌 PAO1株（10 MOI）4小时。胞外DNA（DAPI，蓝色）共定位于与MPO（绿色）和瓜氨酸化组蛋白H4（红色）网。一个代表性的结果中，n = 3（C）的净释放由MPO-DNA和HNE-DNA ELISA测定暴露于相同刺激如上述的人类嗜中性粒细胞测定。平均值±SEM，N = 3。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5： 在“NET-标准”（A）中系列稀释的表征 （1：2）的净标准的制备并进行MPO-DNA的ELISA分析。测量OD值暗算的NET-标准含量％。红色“X”表示未知样本的测量的OD值。灰色箭头表示未知样品的“NET浓度”（蓝色的“X”）是如何使用装有标准曲线的中心范围来确定。连续稀释的NET-标准样品（B）中的DNA的浓度进行了测定，并绘制在MPO-DNA或HNE-DNA ELISA测定的测定OD值。灰色区域表示测定的动态范围。 （C）的蛋白酶抑制剂治疗（蛋白酶抑制剂混合物，1％）不影响MPO-DNA或HNE-DNA测定（NET-标准）的结果。平均值±SEM，N = MPO-DNA和HNE-DNA结果（OD 450纳米）的连续稀释他们的动态范围（见5B）“NET-标准”样品2（D）的相关性。 （E）冻融循环（-20℃℃或-80℃;○NE或两个）不影响MPO-DNA和HNE-DNA检测（NET标准的结果，平均值±SEM，N = 2）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
英语教师代表是中性粒细胞杀死病原体。1虽然教师的文学过去十年里，因为他们发现，与他们的生物学，机制和调控作用，一些重要的问题仍不清楚不断扩大在一个迷人的新机制。适当的方法已被开发来衡量英语教师，这非常独特的抗菌机理。本文介绍了可用于定量英语教师在高通量的方式方法。第一测定如下的膜不透DNA结合染料的荧光的动力学。此法提供了大量的斜坡上，距离中性粒细胞DNA释放速度信息。这些信息在调查研究导致NET形成的早期信号事件的关键。所有这些信息都失去了在终点测定法测定在培养结束时的DNA释放。胞系染料DNA分析不是特定为母语。它只测量DNA的释放。以确认NET时，它已被广泛接受对NET-形成嗜中性粒细胞进行免疫荧光，并显示DNA与任一颗粒标记物酶（MPO，HNE）或组蛋白的共定位。免疫荧光数据的定量是虽然非常繁琐和主观的。
这里，一个先前开发的ELISA测定法检测的MPO-DNA复合物的变形呈现。类似的ELISA测定法测量HNE-DNA复合物，代表特定网措施也被描述。3,5-两种测定法已经表征中详细叙述。5所述的MPO-DNA和HNE-DNA的ELISA测定法是定量和NET-特定同时5这些功能不受其他任何现有的方法来实现。该试验很容易执行，并提供可重复的数据。5包括有限DNA酶消化步骤，以确保直接在嗜中性粒细胞教师的提示和标准化处理。5这些试验都适合COM同时削减几个样品。在新的，控制测量它表明冷冻/解冻循环和蛋白酶不影响MPO-DNA和HNE-DNA检测的结果。它是未知的，然而，已知的蛋白质是否与DNA结合在母语（包括组蛋白和LL-37）-1,11-将与这些测定干扰。
的呈现协议关键步骤如下。它收获是在休息，静止状态并不会自发释放大量英语教师的嗜中性粒细胞是非常重要的。缺乏低渗裂解步骤以除去红血细胞中所呈现的嗜中性粒细胞分离方案是获得未活化的中性粒细胞是至关重要的。到抑制中性粒细胞的活化已被纯化的细胞后，它也是重要的悬浮嗜中性粒细胞中含有的供体自身的血清的培养基。为了获得静止期细胞还准备中性粒细胞过程中使用无热原和无污染的试剂是至关重要的。 Sponta外DNA释放法中的中性粒细胞neous净释放还可能发生。加入1％自体血清的测定培养基重要的是要防止它。更高或更低剂量的自体血清的能进行测试，以得到最佳结果。它是MPO-DNA和HNE-DNA ELISA测定该释放的DNA不应当由DNA酶过度消化，因为这将导致信号完全丢失时是至关重要的。因此，最佳剂量应为每一个新的DNA酶批次来确定。该DNA消化的参数可以稍微改变，以获得最高的ELISA信号成为可能。同样重要的是，以混合DNase和母语彻底，以确保DNA酶将具有与DNA清楚的访问。当收获消化英语教师，广泛洗井，收集所有的网。
的MPO-DNA和HNE-DNA检测的DNA的检测极限大约是10-20纳克/毫升的DNA（ 图5B）。断绝的血清和血浆游离DNA水平人几百到几千毫微克/毫升12-14报道在已经使用NET形成异常相关的疾病（癌症，全身性红斑狼疮，心肌感染）。这表明MPO-DNA和HNE-DNA ELISA测定也有潜在的能够定量人临床样品中的网。这未来MPO-DNA和HNE-DNA ELISA检测的应用程序将使定量链接母语英语教师疾病的发病机制。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human Neutrophil Elastase Rabbit Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2,000x coated |
| Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) | Millipore | 07-496 | 1:2,000x coated |
| DNase-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µg/ml used for digestion |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2.5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Cell death detection ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Microplate Spectrophotometer | Biotek | ||
| Gen5 All-in-One microplate software | Biotek | analytical tool (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0.2% final concentration/volume |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | Use 10 mM final concentration. |
| 1 M glucose | Sigma | Use 5 mM final concentration. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM final used |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Conical tubes 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Conical tubes 50 ml | Thermoscientific | 339652 | |
| Percoll (pH 8.5-9.5) | Sigma | P 1644 | Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G |
| Dextran | Spectrum | D1004 | |
| RPMI 1640 media | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 well assay plate black plate clear bottom | Costar | 3603 |
References
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