Protocol
Den Institutional Review Board fra University of Georgia godkendte det menneskelige subjekt undersøgelse for at indsamle perifert blod fra raske frivillige (UGA # 2012-10769-06). 5,7,8 Frivillige underskrev den krævede informeret samtykkeerklæring før blod uafgjort. Forskningen udføres i denne artikel er i overensstemmelse med de etiske retningslinjer for medicinsk forskning med mennesket som forsøgsperson i erklæringen fra Helsinki.
1. Isolering af neutrofiler fra perifert humant blod (figur 1)
Bemærk: Der er flere måder at isolere neutrofiler fra perifert blod. Følgende protokol giver én mulighed. Denne protokol giver et stort antal af ikke-aktiverede humane neutrofiler stand til at frigive NET ved ekstern stimulering. Brug 40 ml hel blod fra raske frivillige ved venepunktur. 7,9
- Portion 20 ml blod i to 50 ml koniske rør. Tilsæt 10 ml 6% dextran. Bland forsigtigt.
- Efter 20 min overførsel leukocyt-rich øverste fase uden at tage nogen pelleteret røde blodlegemer i rene 50 ml koniske rør, og fyld den op med sterilt PBS.
- Der centrifugeres ved 400 xg 10 min. Resuspender pellet i 4 ml sterilt PBS.
- Forbered en 5-trins Percoll gradient på 85% -80% -75% -70% -65% i to 15 ml koniske rør og lag 2 ml leukocyt suspension på toppen af hver gradient.
- Centrifuger 800 xg i 30 min med bremser off.
- Indsamle alle de celler (neutrofiler) i lagene på 75% / 80% og 70% / 75% grænsefladen.
- Vask cellerne to gange i PBS (350 xg, 10 min, RT) og tælle celler under anvendelse af et hæmocytometer.
2. Måling af kinetiske parametre for Ekstracellulær DNA frigørelse med en Microplate Fluorimeter
Bemærk: Denne metode muliggør målingen af ændringer i fluorescens af en membran-impermeabel DNA-bindende farvestof indikerer DNA frigivelse på en 96-brønds mikroplade format (figur 2).
- Forbered en suspension af neutrofiler i assaymediet (HBSS +1% (v / v) autologt serum + 5 mM glucose) ved en koncentration på 2 x 10 6 celler / ml.
- Tilsæt 5 pmol / l af membranen uigennemtrængelig DNA-bindende farvestof. Bland forsigtigt.
- Alikvote humane neutrofiler (50 pl / brønd) på 96-brønds sorte, gennemsigtige bund mikroplader. Sørg assaymediet dækker hele bunden af brønden. Hvis ikke, skal du trykke på pladen forsigtigt på siden.
- Varm op på underkanten neutrofiler i 10 minutter ved 37 ° C.
- I mellemtiden forberede opløsninger af stimuli ved dobbelte af deres endelige koncentrationer der skal anvendes (i 37 ° C varmt assay medium). Som en positiv NET kontrol bruge humane neutrofiler med 100 nM phorbol-myristat-acetat (PMA) i 4 timer til at udløse maksimal NET frigivelse. 5,8 PMA stimulation i 4 timer sikrer maksimal NET frigivelse mens spontan NET dannelse er fortsat lav 5,8.
- Forbered mikropladen fluorimeteret for målingen (4 timer, 37 ° C, 530 nm for excitation og 590 nm for emission). </ Li>
- Stimulere neutrofiler ved tilsætning af 50 pi stimulus løsning på 50 pi neutrofile suspensioner. Bruge 0,5 ug / ml saponin i en brønd til at måle maksimal signal DNA frigivelse.
- Placer plade i læseren og måle ændringer i fluorescens i 4 timer ved hver 2 min uden omrystning.
- Til dataanalyse, beregne normaliserede stigninger i fluorescens over tid.
- Subtrahere basisliniefluorescensen fra endpoint værdier for alle brønde herunder saponin (figur 2A, B). Stigning i saponin fluorescens bør være den højeste signal. Det omtales som "maksimal DNA frigivelse" (figur 2A).
- Beregn procentdele af DNA-frigivelse i ukendte prøver ved at dividere stigninger i fluorescens af ukendte prøver ved maksimal DNA frigivelse.
- Gennemsnitlige resultater af gentagelser og præsentere dem som "% af maksimal DNA release" (Figur 2C).
3. Kvantificering af NET Formation af MPO-DNA og HNE-DNA ELISA-assays
Bemærk: Disse analyser modificeret (MPO-DNA) eller etableret (HNE-DNA) i vores laboratorium kvantificere NET dannelse ved at måle niveauer af MPO-DNA og HNE-DNA-komplekser 5.
- Coat 96 brønde med høj bindingskapacitet ELISA-plader natten over med indfangningsantistoffer (50 pl / brønd): anti-MPO (1: 2.000 fortynding) eller anti-HNE (1: 2.000).
- Vask ELISA-plader tre gange med PBS (200 pi / brønd) og blokere dem med 5% BSA og 0,1% humant serumalbumin i 2 timer ved stuetemperatur (200 pi / brønd). Vaskes tre gange med PBS.
- Seed neutrofiler på mikroplader med 96 brønde ved en densitet på 100.000 celler / brønd i 100 pi assaymedium, og stimulerer NET formation. Cellerne inkuberes: 4 timer til 37 ° C.
- Udfør en begrænset DNase fordøjelse ved tilsætning af 2 U / ml DNase til neutrofile supernatanter, bland dem godt. Hold dem ved RT.
- Stop DNase efter 15 minutter ved tilsætning af 11 pi 25 mM EGTA (slutkoncentration 2,5 mM). Bland godt. Saml supernatants i rene mikrocentrifugerør. Spin prøver at slippe af cellerester ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Overfør deres supernatanter i rene mikrocentrifugerør. Hold dem på is indtil den er klar.
- Brug en portion af en tidligere forberedt "NET standard".
Bemærk: NET-standarden er en blanding af DNase-fordøjet supernatanter af PMA-stimulerede neutrofiler opnået fra mindst 5 forskellige, uafhængige menneskelige donorer.- At bruge den samme standard i lang tid, indsamle og udportionerer et stort volumen neutrofile supernatanter fra hver enkelt donor. Indsamling f.eks 2 ml DNase-fordøjet supernatanter af PMA-stimulerede neutrofiler vil resultere i 200 alikvoter (10 pi hver) nok til 200 ELISA-plader. Data karakteriserer NET standard findes i figur 5.
- Stimuler humane neutrofiler med 100 nM PMA i 4 timer og anvende DNase fordøje deres supernatanter Iht trin 3,4-3,5.
- Saml, pool, portion (10 pi) og gratisze (-20 ° C) neutrofile supernatanter.
- For at forberede den "NET-standard", tø en portion / donor af mindst fem separate donorer, bland dem og holde dem på is.
- Kassér optøede prøver og bruge friske dem til den næste eksperiment.
- Forbered en 1: 2 seriel fortynding af NET-standarden i PBS + EGTA.
- Fortynd DNase1-fordøjede prøver (standard og ukendte supernatanter) 20 gange i PBS + EGTA og udportionerer dem på ELISA-plader belagt med capture-antistoffer.
- Inkuberes ELISA-plader natten over ved 4 ° C og vaske dem tre gange med PBS.
- Påfør detektionsantistof opløsning (100 ul / brønd): peberrodsperoxidasekonjugeret anti-DNA-antistof (1: 500, mus). Der inkuberes i 1 time i mørke.
- Efter fire vaske med PBS tilføje TMB peroxidase substrat: 100 pl / brønd, 30 min. Blå farve er en indikation for peroxidaseaktivitet (NET til stede).
- Stop reaktionen ved tilsætning af 100 pl / brønd 1 M HCI. Detblå løsninger bliver gul (figur 5A).
- Absorbansen aflæses ved 450 nm under anvendelse af en mikroplade-fotometer.
- Til dataanalyse, beregne mængden af MPO-DNA eller HNE-DNA-komplekser i forhold til NET standard.
- Fratræk den optiske densitetsværdi af testsubstratet fra alle prøver baggrund.
- Plot absorbansværdierne (X-akse) af de fortyndede standardprøverne mod deres relative Nettoindhold (Y-aksen) (figur 5A).
- Brug af umættet vifte af denne standardkurve etablere en tendens linje (brug bedst eksponentiel pasform fra den anvendte software) (figur 5A). Ligningen af denne tendens linje bestemmer omdannelsen af OD-værdier kvantitative mængder af NET.
- Indsæt de målte OD-værdier af de ubekendte i trend-line ligning fra 3.13.3, der vil give den mængde NET i den ukendte prøve i procent af NET-standard (figur 5A).
- Beregnegennemsnit af gentagelser (tre eksemplarer) og præsentere de endelige data som "mængde MPO-DNA eller HNE-DNA komplekser (% af standard)" (figur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tallene i dette manuskript beskriver fremgangsmåden til neutrofil isolation, eksperimentelle procedurer og nuværende repræsentative resultater med forklaring af dataanalyse. Figur 1 viser de sekventielle trin human neutrofil præparat. Denne protokol udgør kun én mulig måde af neutrofil isolation. Den giver store mængder af hvilende neutrofiler stand til at frigive NET ved stimulering. Figur 2 viser, hvordan fluorescensen-baserede DNA frigivelsesassay virker. Ved hjælp af en fluorescensmikropladelæser kinetik DNA-frigivelse i humane neutrofiler følges i mikroplader med 96 brønde. Figur 3 forklarer hvert trin i dataanalysen. Beregn først maksimal DNA-signal i neutrofiler behandlet med saponin (figur 3A). Forøgelsen i fluorescens altid beregnes som forskellen mellem den højeste fluorescens værdi og baggrundsfluorescens niveau (
Figur 4A viser reaktionsskemaet forklare principperne i MPO-DNA og HNE-DNA ELISA-assays. Figur 4B viser repræsentative immunofluorescens billeder af stimulerede, PMA- og PAO1-aktiverede humane neutrofiler. Ekstracellulær DNA viser typisk NET morfologi og co-lokaliserer med MPO og citrullinerede histon H4, en markør for NET formation. 6 Figur 4C viser MPO-DNA og HNE-DNA-frigivelse i humane neutrofiler under de samme, tidligere betingelser (som i figur 3B, 3C og 4B). IThe "Net" ELISA-metoder er tidligere blevet karakteriseret. 5 Kort fortalt, 2 U / ml DNase-behandling (svarende til 1 pg / ml koncentration af DNase anvendt) i 15 minutter ved stuetemperatur resulterede i de højeste MPO-DNA- og HNE-DNA-signaler . 5 Running prøver (100 ng / bane) på en agarosegel viste, at DNA-længdei de lavere kb range udbytter optimal ELISA-signal. 5 DNA overspaltning (DNase dosis højere end 20 U / ml) eller udelade enten indfangning eller påvisning antistof afskaffet ELISA-signaler. 5
Endvidere her assayene og "NETWORK standard" er yderligere karakteriseret (figur 5A). NET-standard indeholder gennemsnitligt 19,5 pg / ml ekstracellulært DNA (målt ved anvendelse af en standard med kendte DNA-koncentrationer), 399 ng / ml MPO og 103,4 ng / ml HNE (kommercielle ELISAkits) (n = 8). Baseret på de totale molekylvægte MPO (84 kDa) og HNE (29,5 kDa) og det faktum, at 1 ug DNA indeholder 9,91 x 10 14 nukleotider, NET-standarden indeholder 109 HNE molekyler og 147 MPO-molekyler per 1.000 nukleotider (kb DNA ). To-fold seriefortynding eksperimenter af NET-standard afslørede, at de dynamiske serier af både MPO-DNA og HNE-DNA ELISA assays er mellem 19,0 til 609,0 ng /ml DNA-koncentrationer (Figur 5B). Fortyndinger af lavere end 32-fold af NET standard resulterede i mætning henviser fortyndinger af højere end 1.024-fold ikke var forskellige fra baggrunden (figur 5B). Behandling af NET standard med proteasehæmmere ændrede ikke resultaterne opnået af de MPO-DNA- og HNE-DNA assays indikerer, at proteaser ikke interfererer med disse assays (figur 5C). Således resultater opnået på samme NET-standardprøve af MPO-DNA eller HNE-DNA ELISA-assays stærkt korrelerer med hinanden (figur 5D). For at vise, at frosne PMN supernatanter også kan anvendes i disse assays uden at miste effektivitet, nogle prøver af NET-standarden blev efterladt ubehandlet eller andre blev udsat for en eller to fryse / optøningscykler udført ved -20 ° C eller -80 ° C (1 time interval). Ingen af fryse / tø behandlinger påvirkede MPO-DNA- eller HNE-DNA resultater (figur 5E). SammenfattendeNET-standard giver en pålidelig referencepunkt i disse NET-kvantificering analyser muliggør kvantitativ sammenligning af NET resultater mellem uafhængige forsøg.
Figur 1:. Isolering af humane neutrofiler Neutrofile granulocytter blev isoleret fra perifert blod fra frivillige ifølge den beskrevne protokol. Blod indeholdende antikoagulant blev anvendt til at isolere neutrofiler ved dextransedimentering og gradientcentrifugering. Blod uden antikoagulant blev anvendt til fremstilling serum. Levedygtighed neutrofile præparater vurderes ved trypanblåt udelukkelse assay. Neutrofil renhed vurderes ved cytospin eller flowcytometri (CD16, CD66abcd dobbelt-positive celler). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Principper for det ekstracellulære DNA Frigivelse Assay (A) Fluorescens kun opnået i neutrofiler hvis plasma og nukleare membraner er blevet kompromitteret og membranen-impermeable DNA-bindende farvestof kan binde til deres DNA. (B) Assayet udføres på sort mikroplader med 96 brønde under anvendelse af en mikroplade fluorimeter. (C) Fluorimeteret registrerer realtid fluorescens kurver i hver brønd. En repræsentative resultater i vist. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Analyse af DNA Slip data (.
Figur 4: MPO-DNA og HNE-DNA ELISA assays:. Princip og Repræsentative resultater (A) Ordning forklareing hvordan MPO-DNA og HNE-DNA ELISA assays arbejde. (B) Repræsentative resultater af immunofluorescens billeder udarbejdet på humane neutrofiler udsat for 100 nM PMA eller P. aeruginosa PAO1-stamme (10 MOI) i 4 timer. Ekstracellulær DNA (DAPI, blå) co-lokaliseret i NET med MPO (grøn) og citrullinerede histon H4 (rød). Et repræsentativt resultat, n = 3. (C) NET frigivelse blev målt i humane neutrofiler udsat for de samme stimuli som ovenfor ved MPO-DNA og HNE-DNA ELISA-assays. Middelværdi ± SEM, n = 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Karakterisering af "NET-standard" (A) Seriefortyndinger. (1: 2) af NET standarden blev fremstilletog underkastet MPO-DNA ELISA. Målte OD-værdier er plottet mod% af NET-standard indhold. Rød "X" angiver en målt OD-værdi af en ukendt prøve. Grå pil angiver, hvor den "NET koncentration" (blå "X") af den ukendte prøve bestemmes ved hjælp af den centrale række af udstyret standardkurve. (B) DNA-koncentrationer i seriefortyndede NET-standard prøver blev bestemt og afbildet mod de målte OD-værdier af MPO-DNA eller HNE-DNA ELISA-assays. Grå områder angiver de dynamiske intervaller af assayene. (C) Protease-hæmmer behandling (proteasehæmmer cocktail, 1%) påvirker ikke resultatet af MPO-DNA eller HNE-DNA assays (NET-standard). Middelværdi ± SEM, n = 2. (D) Korrelation af MPO-DNA og HNE-DNA resultater (OD 450 nm) af serielt fortyndede "NET-standard" prøver i deres dynamiske områder (se 5B). (E) nedfrysning og optøning cyklusser (-20 ° C eller -80 ° C; one eller to) ikke påvirke resultaterne af MPO-DNA og HNE-DNA assays (NET-standard, gennemsnit ± SEM, n = 2). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NET repræsenterer en fascinerende roman mekanisme, hvormed neutrofile dræbe patogener. 1 Selv om litteraturen af NET er blevet stadigt voksende i de sidste ti år, siden deres opdagelse, flere vigtige spørgsmål vedrørende deres rolle i biologi, mekanisme og regulering forbliver uklart. Passende metode skal udvikles til at måle NET, denne meget unikke antimikrobielle mekanisme. Denne artikel beskriver fremgangsmåder, som kan anvendes til kvantificering garn i en high throughput måde. Den første assay følger kinetikken af fluorescens af en membran-impermeabel DNA-bindende farvestof. Denne analyse giver stor mængde information på skråningen og hastighed af DNA frigivelse fra neutrofiler. Denne information er afgørende i undersøgelser studerer tidligt signalering begivenheder, der førte til NET formation. Al denne information tabt i endpoint assays måler DNA frigivelse i slutningen af inkubationen. Det ekstracellulære DNA dye-baseret assay er ikke specifikke for NET. Detkun måler DNA frigivelse. For at bekræfte NET, er det almindeligt accepteret at udføre immunfluorescens på NET-dannende neutrofiler og vise co-lokalisering af DNA med enten granula markører (MPO, HNE) eller histoner. Kvantificering af immunfluorescens data er dog meget kedelig og subjektiv.
Her er en ændring af en tidligere udviklet ELISA-assay påvisning MPO-DNA komplekser præsenteret. Et lignende ELISA assay, der måler HNE-DNA-komplekser, der repræsenterer specifikke NET foranstaltninger er også beskrevet. 3,5 Begge assays er blevet karakteriseret i detaljeret. 5 MPO-DNA- og HNE-DNA ELISA-assays er kvantitativ og NET-specifikke samtidig . 5 Disse funktioner er ikke opfyldt af andre nuværende metode. Assayene er let at udføre og tilvejebringe reproducerbare data. 5 Et begrænset DNase-fordøjelse trin er inkluderet, som sikrer hurtig og standardiseret håndtering af NET direkte på neutrofiler. 5 Disse assays er egnede til comstudse flere prøver på samme tid. I nye, kontrolmålinger er det vist, at fryse / tø cykler og proteaser påvirker ikke resultatet af MPO-DNA og HNE-DNA-analyser. Det er ukendt, imidlertid, om proteiner, der vides at binde til DNA i NET (herunder histoner og LL-37) 1,11 ville interferere med disse assays.
Kritiske trin i de præsenterede protokoller er følgende. Det er vigtigt at høste neutrofiler, der er i hvile, hvilende tilstand og ikke frigiver store mængder af NET spontant. Mangel på en hypotonisk lyse til fjernelse af røde blodlegemer i den præsenterede neutrofil isolation protokollen er afgørende for at opnå ikke-aktiverede neutrofiler. Til at inhibere neutrofil aktivering efter at cellerne var blevet renset, er det også vigtigt at resuspendere neutrofiler i et medium indeholdende deres donorens eget serum. For at opnå hvilende celler er det også afgørende at bruge pyrogen- og forurening-fri reagenser under neutrofil forberedelse. Spontagennemstrømnings- NET frigivelse af neutrofiler under den ekstracellulære DNA frigivelsesassay kan også ske. Tilsætning af 1% autologt serum til assaymediet er vigtigt at forhindre det. Højere eller lavere doser af den autologe serum kan testes for at få optimale resultater. Det er kritisk i MPO-DNA og HNE-DNA ELISA-assays, der frigives DNA bør ikke være over-fordøjet af DNase fordi det vil resultere i fuldstændig tab af signalet. Derfor bør den optimale dosis for hver ny DNase parti. Parametrene for DNA fordøjelse kunne ændres lidt for at opnå den højeste ELISA-signaler muligt. Det er også vigtigt at blande DNase og NET grundigt for at sikre, at DNase vil have en klar adgang til DNA'et. Når man høster de fordøjede NET, vaske godt udstrakt grad til at indsamle alle de NET.
DNA detektionsgrænse MPO-DNA og HNE-DNA assays er omkring 10-20 ng / ml DNA (figur 5B). Serum og plasma fri DNA-niveauer af several hundrede til tusind ng / ml blev rapporteret i sygdomme (cancer, systemisk lupus erythematosus, myocardial infektion), som er associeret med unormal NET formation. 12-14 Dette antyder, at de MPO-DNA- og HNE-DNA ELISA-assays har også potentiale at kunne kvantificere NET til humane kliniske prøver. Denne fremtidige anvendelse af MPO-DNA og HNE-DNA ELISA assays vil gøre det muligt at kvantitativt linke NET til sygdom patogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human Neutrophil Elastase Rabbit Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2,000x coated |
| Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) | Millipore | 07-496 | 1:2,000x coated |
| DNase-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µg/ml used for digestion |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2.5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Cell death detection ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Microplate Spectrophotometer | Biotek | ||
| Gen5 All-in-One microplate software | Biotek | analytical tool (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0.2% final concentration/volume |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | Use 10 mM final concentration. |
| 1 M glucose | Sigma | Use 5 mM final concentration. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM final used |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Conical tubes 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Conical tubes 50 ml | Thermoscientific | 339652 | |
| Percoll (pH 8.5-9.5) | Sigma | P 1644 | Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G |
| Dextran | Spectrum | D1004 | |
| RPMI 1640 media | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 well assay plate black plate clear bottom | Costar | 3603 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
- Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34 (2013).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
- Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
- Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
- Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205 (2013).
- Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
- Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
- Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
- Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).
