Protocol
조지아 대학의 임상 시험 심사위원회는 건강한 지원자 (UGA 번호 2012-10769-06)에서 말초 혈액을 수집하는 인간 대상 연구를 승인했다. 5,7,8 자원 봉사자 혈액 그리기 전에 필요한 정보 동의서에 서명했다. 이 문서에서 수행 된 연구는 헬싱키 선언의 인체를 이용한 의학 연구에 대한 윤리 지침을 준수합니다.
주변 인간의 혈액에서 호중구의 1. 분리 (그림 1)
주 : 말초 혈액 호중구를 분리하는 방법에는 여러 가지가있다. 다음 프로토콜은 하나의 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 외부 자극에 그물을 방출 할 수있는 비 - 활성화 인간 호중구 다수 산출한다. 40 ml의 정맥 천자에 의한 건강한 지원자에서 얻은 전체 혈액을 사용합니다. 7,9
- 두 50 ML 원뿔 튜브로 나누어지는 20 ml의 혈액입니다. 10 ml의 6 % 덱스 트란을 추가합니다. 부드럽게 섞는다.
- 20 분 이전 백혈구 후에 RIC깨끗한 50 ML 원뿔 튜브에 어떤 펠렛 적혈구를 복용하고, 멸균 PBS로를 작성하지 않고 시간 상위 단계입니다.
- 400 XG에 10 분 원심 분리기. 4 용액에 재현 탁 펠렛은 PBS를 멸균.
- 85 %의 5 단계 퍼콜 구배를 준비 -80 % -75 % -70 % -65 %이 15 ML 원뿔 튜브 및 레이어 2 ㎖의 백혈구 서스펜션의 각 그라데이션의 상단에.
- 브레이크 해제와 함께 30 분 동안 원심 분리기 800 XG.
- 모든 셀 75 % / 80 %에서 레이어 (호중구) 70 % / 75 % 인터페이스를 수집합니다.
- PBS에 두 번 (350 XG, 10 분, RT)을 세포를 씻으과 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
마이크로 플레이트 형광 계를 사용하여 세포 외 DNA 자료의 속도론 2. 측정
참고 :이 방법은 막 불 투과성 DNA 결합 96 웰 마이크로 포맷에 DNA 자료를 나타내는 염료 (그림 2)의 형광의 변화를 측정 할 수 있습니다.
- + 분석 매체에서 호중구의 현탁액 (HBSS 준비2 × 106 세포 / ml의 농도에서 1 % (v / v)의자가 혈청 + 5 mM의 포도당).
- 막 투과성 DNA 결합 염료의 5 μmol / L를 추가합니다. 부드럽게 섞는다.
- 나누어지는 인간 호중구 (50 μL / 웰) 마이크로 96 웰 블랙, 투명 바닥 위에. 확인 분석 배지를 웰의 전체 바닥을 포함합니다. 그렇지 않은 경우, 측면에 부드럽게 판을 누릅니다.
- 37 ° C에서 10 분간 플레이트 포함 호중구을 따뜻하게.
- 한편 최종 농도의 두 배에 자극의 솔루션을 준비하는 것은 사용되는 (37 ° C 따뜻한 분석 매체에서). 긍정적 인 NET 컨트롤이 최대 NET 자료를 트리거하기 위해 4 시간 동안 100 나노 포르 - 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)와 인간 호중구를 사용할 때 자발적 NET 형성이 낮은 5,8 남아있다. 4 시간 동안 5,8 PMA 자극은 최대 NET 자료를 보장합니다.
- 측정 (4 시간, 37 ° C, 여기에 대한 530 nm의 및 배출을위한 590 ㎚)에 대한 마이크로 형광 계를 준비합니다. </ 리>
- 50 μL 호중구 현탁액 50 μL 자극 용액을 첨가하여 호중구를 자극한다. 최대 DNA 해제 신호를 측정하기 위해 잘 한 0.5 μg의 / ㎖ 사포닌을 사용합니다.
- 리더 플레이트를 놓고없이 진탕 매 2 분에서 4 시간 동안 형광의 변화를 측정한다.
- 데이터 분석을 위해, 시간에 따른 형광의 증가 정규화를 계산한다.
- 사포닌을 포함한 모든 우물 용 엔드 포인트 값에서 빼기 기준 형광 (그림 2A, B). 사포닌 형광 상승이 가장 높은 신호이어야한다. 이것은 "DNA 최대 방출"(도 2A)로 지칭된다.
- 최대 DNA 릴리스 미지 시료의 형광의 증가를 분할하여 미지 시료에서 DNA 방출의 비율을 계산합니다.
- 복제의 평균 결과는 "최대 DNA의 출시 %"(그림 2C)로 제시.
NET 양식 3. 정량MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석 실험에 의해 ATION
참고 : 우리의 실험실에서이 분석 수정 (MPO-DNA) 또는 설립 (HNE-DNA)를 MPO-DNA와 HNE-DNA 복합체의 수준을 측정하여 NET 형성을 정량 5.
- 코트 96 웰 높은 결합 하룻밤 캡처 항체 (50 μL / 웰) 용량 ELISA 플레이트 : 안티 - MPO (1 : 2,000 희석) 또는 안티 HNE (1 : 2,000).
- PBS로 세척 ELISA 플레이트는 세 번 (200 μL / 웰)와 RT에서 2 시간 동안 5 % BSA 및 0.1 % 인간 혈청 알부민을 블록 (200 μL / 웰). PBS로 3 회 세척 할 것.
- 시드 96 웰 마이크로 / 웰로 100 ㎕를 분석 배지 중 100,000 세포의 밀도로 호중구 및 NET 형성을 자극한다. 세포를 품어 : 37 ° C 4 시간.
- 그들을 잘 혼합, 호중구 상층 액 2 U / ㎖ DNase를 추가하여 제한된 DNase의 소화를 수행합니다. 실온에서 보관하십시오.
- 11 μL 25 밀리미터 EGTA (최종 농도 2.5 mm)를 추가하여 15 분 후 DNase의를 중지합니다. 잘 섞다. 스와 수집청소의 microfuge 튜브 pernatants. 스핀 샘플 RT에서 5 분 동안 300 XG에서 세포 파편을 제거한다. 청소의 microfuge 튜브에 자신의 상층 액을 전송합니다. 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오.
- 이전에 준비 "NET 표준"의 나누어지는을 사용합니다.
주 : NET-표준은 적어도 5 개의 다른 독립적 인 인간 공여자로부터 수득 PMA 자극 호중구의 DNase 소화 상등액의 혼합이다.- 오랫동안 동일한 표준을 사용하여 수집하고 각 공여자로부터 호중구 상청액 대량 나누어지는한다. 예를 들어 PMA 자극 호중구의 DNase의 소화 상층 액을 2 ㎖를 수집하는 것은 200 분량 씩 200 ELISA 플레이트에 충분한 (10 μL 각)가 발생합니다. 인터넷 표준을 특성화 데이터는 그림 5에서 발견된다.
- 4 시간 동안 100 nm의 PMA와 인간 호중구를 자극하고 DNase의이 단계 3.4-3.5있어서 자신의 상층 액을 소화 적용됩니다.
- 수집, 수영장, 나누어지는 (10 μL) 무료ZE (-20 ° C) 호중구 상층 액.
- 적어도 5 개의 개별 기증자로부터 획득 한 나누어지는 / 기증자 해동, "표준 NET의"를 준비하려면를 혼합하고 얼음에 보관하십시오.
- 해동 샘플을 취소하고 다음 실험을 위해 신선한 것을 사용합니다.
- PBS + EGTA에서 NET-표준의 2 용액을 희석 : 1을 준비합니다.
- DNase1 소화 시료 (표준 및 알 수없는 상층 액) PBS + EGTA 20 배 희석 캡처 항체로 코팅 된 ELISA 플레이트에 그들을 나누어지는.
- 4 ° C에서 밤새 ELISA 플레이트를 품어 PBS로 세 번 씻는다.
- 검출 항체 용액을 적용 (100 μL / 웰) : 말 래 디쉬 퍼 옥시다아제 접합 항 DNA 항체 (1 : 500, 마우스). 어둠 속에서 1 시간 동안 품어.
- PBS와 네 세척 후 TMB 퍼 옥시 다제 기판을 추가 : 100 μL / 웰, 30 분. 블루 착색은 퍼 옥시 다제 활성 (현재 그물)에 대한 표시입니다.
- 잘 100 μL / 1 M 염산을 첨가하여 반응을 중지합니다. 그만큼블루 솔루션은 노란색 (그림 5A)를 설정합니다.
- 마이크로 광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 참조하십시오.
- 데이터 분석을 위해, NET 표준에 비해 MPO-DNA 또는 HNE-DNA 복합체의 양을 계산한다.
- 모든 샘플에서 분석 배지의 배경 광 밀도 값을 뺀다.
- 상대 NET 콘텐츠 (Y 축) (도 5a)에 대한 희석하여 표준 시료의 흡광도 값 (X 축)을 그린다.
- 이 표준 곡선의 nonsaturated 범위를 사용하면 (그림 5A) (사용되는 소프트웨어에서 최상의 지수 맞게 사용) 추세선을 설정합니다. 이 추세선 방정식 그물의 양을 양적하기 OD 값의 변환을 결정한다.
- 인터넷 표준 (그림 5A)의 비율로 미지 시료에 그물의 양을 줄 것이다 3.13.3에서 추세 줄 식으로 미지의 측정 된 OD 값을 삽입합니다.
- 계산하다복제 (삼중)의 평균 (그림 5C) "MPO-DNA 또는 HNE-DNA 복합체 (표준의 %)의 양"으로 최종 데이터를 제시한다.
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Representative Results
이 원고의 수치. 호중구 격리, 실험 절차 및 데이터 분석의 설명과 함께 현재 대표적인 결과의 방법을 서술 한 인간 호중구 준비의 순차적 인 단계를 보여줍니다. 이 프로토콜은 호중구 격리의 하나의 가능한 방법을 나타냅니다. 그것은 자극에 그물을 방출 할 수있는 호중구 휴식의 많은 양을 산출한다. 형광 기반의 DNA 자료 분석의 작동 방식 2는 그림. 인간의 호중구는 웰 (96) 마이크로의 준수에 DNA 자료의 형광 마이크로 플레이트 리더 반응 속도를 사용하여. 그림 3은 데이터 분석의 각 단계를 설명합니다. 먼저, 사포닌 (도 3a)으로 처리 호중구의 최대 DNA 신호를 계산한다. 형광의 증가는 항상 최고 형광 값 및 배경 형광 레벨 (차이로서 계산된다
도 4a는도 4b는 nonstimulated PMA- 및 PAO1 활성화 인간 호중구의 대표적인 면역 형광 이미지를 나타낸다. MPO-DNA-DNA와 HNE ELISA 분석의 원리를 설명하는 방식을 도시한다. 세포 외 DNA가 전형적인 NET 형태를 보여주고 MPO 및 시트룰린 히스톤 H4, NET 형성의 마커와 공동 지역화. 6 그림 4c는도 3B, 3C와 같은 같은, 이전의 조건에서 인간의 호중구의 MPO-DNA와 HNE-DNA 출시 (보여준다 및 (b)). IThe는 "NET"ELISA 방법은 이전에 특징되었습니다. 실온에서 15 분 동안 5 간단히, 2 U / ㎖ DNase를 처리 (사용의 DNase의 / ml의 농도가 1 μg의 동일) 가장 높은 MPO-DNA와 HNE-DNA 신호 결과 . 아가로 오스 겔 5 실행 샘플 (100 NG / 차선) 그 DNA의 길이를 밝혀낮은 킬로바이트 범위 수율 최적의 ELISA 신호. 5 DNA의 overdigestion 캡처 또는 검출 항체 중 하나는 ELISA 신호를 폐지 생략하거나 (DNase의보다 높은 20 U / ml의 투여 량). (5)
또한, 여기에 분석하고 "네트 표준"더 특성화 (도 5a)이다. 인터넷 표준 평균 19.5 μg의 / ml의 세포 외 (공지의 DNA 농도가 표준을 사용하여 측정) DNA, 399 ng의 / ㎖ MPO 및 103.4 NG / ㎖의 HNE (상업적 ELISAkits)에 포함 된 (N = 8). MPO (84 kDa의)와 HNE (29.5 kDa의) 총 분자량 및 1 μg의 DNA가 9.91 × 10 14 개 뉴클레오티드가 포함되어 있다는 사실에 기초하여, NET 표준 109 HNE 분자 1000 뉴클레오티드 당 147 MPO 분자 (KB의 DNA를 포함 ). 인터넷 표준의 두 배의 일련의 희석 실험에서 MPO-DNA-DNA와 HNE 모두 ELISA 분석의 동적 범위 사이에있는 것으로 밝혀 19.0-609.0 NG /ml의 DNA 농도 (도 5b). 보다 높은 1,024 배의 희석이 배경 (그림 5B)에서 차이가 없었다 반면 NET 표준의 32 배 이하의 희석은 포화 결과. 프로테아제 억제제와 NET 표준 치료 프로테아제 이러한 분석 (도 5C)과 간섭하지 않는 것을 나타내는 MPO-DNA와 HNE-DNA 분석법에 의해 얻어진 결과는 변경하지 않았다. 따라서, 결과는 서로 강하게 (그림 5D)와 상관 관계 분석 MPO-DNA 또는 HNE-DNA ELISA에 의해 같은 NET-표준 시료에서 얻어진. 효율 손실없이 고정 된 PMN 상청액은 이러한 분석에서 사용될 수 있음을 표시하기 위해, NET-표준 방치 하였다 또는 다른 -20 ° C 또는 수행 한 두 냉동 / 해동주기에 노출되어 -80 ° C의 일부 분취 (1 시간 간격). 동결 / 해동 치료 없음은 MPO-DNA 또는 HNE-DNA 결과 (그림 5E)에 영향을받지 않습니다. 요약하면,NET-표준은 독립적 인 실험 사이 NET 결과의 정량적 비교를 가능 이러한 NET-정량 분석의 신뢰성 기준점을 제공한다.
그림 1 :. 인간 호중구 호중구 과립구의 분리는 설명 프로토콜에 따라 자원 봉사자의 말초 혈액에서 분리 하였다. 혈액 포함 항응고제는 덱스 트란 침강 및 그라데이션 원심 분리하여 중성 백혈구를 분리하는 데 사용되었다. 항응고제가없는 혈액의 혈청을 제조 하였다. 호중구 준비의 생존은 트리 판 블루 배제 분석에 의해 평가된다. 호중구 순도가 cytospin에 의해 평가 또는 유동 세포 계측법된다 (CD16가 두 번 양성 세포를 CD66abcd). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 외 DNA 자료 분석의 원리 (A)는 그 형광 플라즈마 핵막 손상되었고 막 투과성 DNA 결합 염료가 DNA에 결합 할 수있는 호중구를 얻을 수있다. (B) 분석법은 마이크로 플레이트 형광 계를 사용하여 마이크로 플레이트 검정 96 웰에 대해 수행된다. (C)는 형광 계 각 웰에 실시간 형광 곡선을 기록한다. 도시의 한 대표적인 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : DNA 릴리스 데이터의 분석 (.
그림 4 : MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석 실험 :. 원리 및 대표 결과 (A) 계획 설명보내고 어떻게 MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석 작업. (B) 100 나노 PMA 또는 P.에 노출 된 인간의 호중구에 준비 면역 형광 이미지의 대표 결과 녹농균의 PAO1 변형 4 시간 (10 MOI). 세포 외 DNA (DAPI, 청색) MPO (녹색)과 시트룰린 히스톤 H4 (빨간색)와 그물에 공동-지역화. 하나의 대표적인 결과, N = 3 (C)는 NET 릴리스는 MPO-DNA-DNA와 HNE ELISA 분석법 이상과 같은 자극에 노출 된 인간의 호중구로 측정 하였다. 평균 ± SEM, N = 3 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :.은 "NET-표준"(A) 직렬 희석의 특성 (1 : 2) NET 표준의 준비 하였다및 MPO-DNA ELISA를 실시. 측정 된 OD 값은 NET-표준 콘텐츠 %의 역모를 꾸몄다됩니다. 빨간색 "X"는 미지 시료의 측정 된 OD 값을 나타냅니다. 회색 화살표는 미지 시료의 "NET 농도"(청색 "X")은 피팅 된 표준 곡선의 중심 범위를 사용하여 결정되는 방법을 나타낸다. 순차적으로 희석 NET 표준 시료 (B) DNA 농도를 측정하고, MPO-DNA-DNA 또는 HNE ELISA 분석법의 측정 된 OD 값에 대해 도시 하였다. 회색 영역은 분석의 동적 범위를 나타냅니다. (C) 프로테아제 억제제 치료 (프로테아제 억제제 칵테일, 1 %)이 MPO-DNA 또는 HNE-DNA 분석 (NET-표준)의 결과에 영향을주지 않습니다. , ± SEM을 의미 N = MPO-DNA와 직렬로 자신의 동적 범위 (5B 참조)에서 "NET-표준"샘플을 희석의 HNE-DNA 결과 (OD 450 ㎚) 2. (D)의 상관 관계. (E) 냉동 및 해동 사이클 (-20 ° C 또는 -80 ° C를, 오) 북동 또는 두 N = 2)., MPO-DNA와 HNE-DNA 분석 (NET-표준의 결과에 영향을 미칠 SEM ± 의미하지 않는다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
그물 그물의 문학은 지속적으로, 생물학,기구 및 규제에서의 역할에 관한 몇 가지 중요한 질문이 불분명 남아 자신의 발견 이후 지난 10 년에 걸쳐 확대되고 있지만 병원균을 죽인다. 1 호중구하는 매혹적인 새로운 메커니즘을 나타냅니다. 적절한 방법은 그물이 매우 독특한 항균 메카니즘을 측정하기 위해 개발되어야한다. 이 문서는 높은 처리량 방식으로 그물을 정량하는 데 사용할 수있는 방법을 설명합니다. 첫 번째 분석은 막 불 투과성 DNA 결합 염료의 형광 반응 속도를 다음과 같습니다. 이 분석은 슬로프 및 호중구에서 DNA 방출 속도에 많은 양의 정보를 제공한다. 이 정보는 NET 형성으로 이어지는 초기 신호 이벤트를 연구 조사에 매우 중요합니다. 모든이 정보는 인큐베이션의 끝에 DNA 분리 측정 종료점 분석에서 손실된다. 세포 외 DNA 염료 계 분석은 그물에 특이하지 않다. 이것단지 DNA 자료를 측정한다. 그물을 확인하기 위해 널리 NET-형성 호중구에 면역을 수행하고 과립 마커 (MPO, HNE) 또는 히스톤 중 하나와 DNA의 공동 현지화를 보여 허용됩니다. 면역 형광 데이터의 정량하지만 매우 지루하고 주관적이다.
여기서, MPO-DNA 복합체를 검출하기 이전에 개발 된 ELISA 분석의 변형이 제공된다. 특정 NET 조치를 나타내는 유사한 ELISA 어 세이 측정 HNE-DNA 복합체가 또한 설명된다. 3,5- 두 분석의 상세한 것을 특징으로하고있다. 5 MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석법 동시에 특정 NET 정량되고 . (5) 이러한 기능은 다른 현재의 방법으로 충족되지 않습니다. 분석법이 수행하고 재생 가능한 데이터를 제공하기 쉽습니다. 직접 호중구에 그물의 신속하고 표준화 된 처리를 보장 제한된 DNase의 소화 단계가 포함되어 있습니다 (5). (5) 이러한 분석은 COM에 적합동시에 여러 샘플을 깎다. 새로운 제어 측정에서는 그 동결 / 해동 사이클을 표시하고 단백질 분해 효소는 MPO-DNA와 HNE-DNA 분석의 결과에 영향을주지 않습니다. 그것은 알려진 단백질이 이러한 분석을 방해 1,11 (히스톤과 LL-37 포함) 그물에 DNA에 결합 할 것인지, 그러나, 알 수 없습니다.
제시된 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같다. 휴식, 정지 상태에있는 자발적으로 그물의 큰 금액을 공개하지 않습니다 호중구를 수확하는 것이 중요하다. 제시된 호중구 분리 프로토콜에서 적혈구를 제거하는 저장성 용해 단계의 부족은 비 활성화 된 호중구를 얻는 것이 중요하다. 세포를 정제 된 후 호중구 활성화를 억제하기 위해, 자신의 도너 자신 혈청을 함유하는 배지에 재현 탁 호중구을하는 것도 중요하다. 대기 세포를 얻기 위해 또한 호중구 준비하는 동안 pyrogen- 오염이없는 시약을 사용하는 것이 중요하다. Sponta세포 외 DNA 자료 분석 중 호중구의 neous NET 버전도 발생할 수 있습니다. 분석 배지에 1 %자가 혈청을 추가하는 것을 방지하는 것이 중요하다. 자가 혈청 높거나 낮은 용량은 최적의 결과를 얻기 위해 테스트 할 수 있습니다. 그것은 DNase의 소화를 통해-는 신호의 완전한 손실이 발생하기 때문에 DNA가 안 발표 MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석시 중요합니다. 따라서, 최적 투여 량은 각 새로운 DNase의 배치에 대해 결정되어야한다. DNA를 분해의 매개 변수는 약간 높은 ELISA 가능한 신호를 얻기 위해 변경 될 수있다. 또한 DNase의가 DNA에 대한 명확한 액세스 할 수 있는지 확인하기 위해 DNase를 철저하게 그물을 혼합하는 것이 중요합니다. 소화 그물을 수확 할 때, 모든 그물을 수집하기 위해 광범위하게 잘 씻는다.
MPO-DNA와 HNE-DNA 분석법의 DNA의 검출 한계는 약 10-20 NG / ㎖ DNA (도 5B)이다. 단절의 혈청 및 혈장 무료 DNA 수준알 십만 ng 내지 / ㎖가 비정상 NET 형성과 연관되어 질병 (암, 전신성 홍 반성 루푸스, 심근 감염)에보고되었다. 12-14이 MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석법도 가능성이 있음을 시사 인간의 임상 샘플에서 그물을 정량 할 수있다. MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석이 미래의 응용 프로그램은 정량적으로 질병의 발병 기전에 그물을 연결 할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human Neutrophil Elastase Rabbit Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2,000x coated |
| Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) | Millipore | 07-496 | 1:2,000x coated |
| DNase-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µg/ml used for digestion |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2.5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Cell death detection ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Microplate Spectrophotometer | Biotek | ||
| Gen5 All-in-One microplate software | Biotek | analytical tool (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0.2% final concentration/volume |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | Use 10 mM final concentration. |
| 1 M glucose | Sigma | Use 5 mM final concentration. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM final used |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Conical tubes 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Conical tubes 50 ml | Thermoscientific | 339652 | |
| Percoll (pH 8.5-9.5) | Sigma | P 1644 | Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G |
| Dextran | Spectrum | D1004 | |
| RPMI 1640 media | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 well assay plate black plate clear bottom | Costar | 3603 |
References
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