Protocol
The Institutional Review Board ved University of Georgia godkjente menneske studie for å samle perifert blod fra friske frivillige (UGA # 2012-10769-06). 5,7,8 Frivillige signert de nødvendige informert samtykkeskjema før blodprøvetaking. Forskningen utført i denne artikkelen er i samsvar med de etiske retningslinjene for medisinsk forskning som omfatter mennesker av Helsinkideklarasjonen.
1. Isolering av nøytrofile granulocytter fra Peripheral Human Blood (figur 1)
Merk: Det er flere måter å isolere neutrofiler fra perifert blod. Følgende protokoll gir en mulighet. Denne protokollen gir et stort antall av ikke-aktiverte humane nøytrofile celler som er i stand til å frigjøre NET på ekstern stimulering. Bruk 40 ml fullblod hentet fra friske frivillige ved venepunksjon. 7,9
- Alikvoter 20 ml blod inn i to 50 ml koniske rør. Tilsett 10 ml 6% dekstran. Bland forsiktig.
- Etter 20 min transfer leukocytt-rich øvre fase uten å ta noen pelleterte røde blodlegemer i rene 50 ml koniske rør, og fylle den opp med sterilt PBS.
- Sentrifuger ved 400 xg 10 min. Resuspender pellet i 4 ml sterilt PBS.
- Fremstille en 5-trinns Percoll-gradient på 85% -80% -75% -70% -65% i to 15 ml koniske rør og lag 2 ml leukocytt-suspensjonen på toppen av hver gradient.
- Sentrifuger 800 xg i 30 min med bremser off.
- Samle alle celler (nøytrofiler) i lagene på 75% / 80% og 70% / 75% grensesnitt.
- Vask cellene to ganger i PBS (350 x g, 10 min, RT) og telle celler ved hjelp av et hemocytometer.
2. Måling av Kinetics av ekstracellulært DNA Slipp Ved hjelp av en Micro fluorimeter
Merk: Denne metoden muliggjør måling av endringer i fluorescensen til en membran-ugjennomtrengelig DNA-bindende fargestoff som indikerer frigivelse av DNA på en 96-brønners mikroplateformat (figur 2).
- Utarbeide en suspensjon av nøytrofile i analysemedium (HBSS +1% (v / v) autologt serum + 5 mM glukose) i en konsentrasjon på 2 x 10 6 celler / ml.
- Tilsett 5 umol / L av membranen ugjennomtrengelig DNA-bindende fargestoff. Bland forsiktig.
- Delmengde humane neutrofiler (50 ul / brønn) på 96-brønn svart, gjennomsiktig bunn mikro. Sørg for at analysen medium dekker hele bunnen av brønnen. Hvis ikke, trykker platen forsiktig på siden.
- Varm opp plate inneholdende nøytrofile celler i 10 minutter ved 37 ° C.
- I mellomtiden fremstille oppløsninger av stimuli på det dobbelte av deres sluttkonsentrasjoner som skal brukes (i 37 ° C varm analysemedium). Som en positiv NET kontroll bruke humane neutrofiler med 100 nM forbol-myristat-acetat (PMA) for 4 timer å utløse maksimal NET utgivelse. 5,8 PMA stimulering for 4 timer sikrer maksimal NET utgivelsen mens spontan NET formasjon fortsatt lav 5,8.
- Fremstille mikroplaten fluorimeter for måling (4 timer, 37 ° C, 530 nm for eksitasjon og 590 nm for emisjon). </ Li>
- Stimulere nøytrofiler ved tilsetning av 50 ul stimulus oppløsning til 50 ul nøytrofile suspensjoner. Bruk 0,5 ug / ml saponin i en brønn for å måle maksimal DNA frigjøringssignal.
- Plasser platen i leseren og måle endringer i fluorescens i 4 timer ved hvert 2 min uten risting.
- For dataanalyse, beregne normaliserte økninger i fluorescens over tid.
- Trekk baseline fluorescens fra endepunkt verdier for alle brønner inkludert saponin (figur 2A, B). Rise i saponin fluorescens bør være den høyeste signal. Det er referert til som "maksimal DNA-release" (figur 2A).
- Beregn prosenter av DNA utgivelse i ukjente prøver ved å dele økning i fluorescens av ukjente prøver av maksimal DNA utgivelse.
- Gjennomsnittlig resultatene av gjentak og presentere dem som «% av maksimal DNA release" (figur 2C).
3. Kvantifisering av NET Formasjon av MPO-DNA og HNE-DNA ELISA-analyser
Merk: Disse analysene modifisert (MPO-DNA) eller konstatert (HNE-DNA) i vårt laboratorium quantitate NET dannelse ved å måle nivåer av MPO-DNA og HNE-DNA komplekser 5.
- Coat 96-brønn høy bindingskapasitet ELISA-plater over natten med capture antistoffer (50 ul / brønn): anti-MPO (1: 2000 fortynning) eller anti-HNE (1: 2000).
- Vask ELISA-plater tre ganger med PBS (200 ul / brønn) og blokkere dem med 5% BSA og 0,1% humant serum albumin i 2 timer ved romtemperatur (200 ul / brønn). Vask tre ganger med PBS.
- Seed nøytrofile celler på 96-brønners mikrotiterplater ved en tetthet på 100.000 celler / brønn i 100 ul analysemedium og stimulere NET dannelse. Inkuber cellene: 4 timer til 37 ° C.
- Utfør et begrenset DNase fordøyelsen ved å legge to U / ml DNase til nøytrofile supernatanter, bland dem godt. Hold dem ved RT.
- Stoppe den DNase etter 15 min ved tilsetning av 11 ul 25 mM EGTA (sluttkonsentrasjon 2,5 mM). Bland godt. samle supernatants i rene mikrofugerør. Spin prøver for å kvitte seg med celleavfall ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Overføre sine supernatanter i rene mikrofugerør. Hold dem på is inntil den er klar.
- Bruke en delmengde av en på forhånd fremstilt "NET standard".
Merk: NET-standarden er en blanding av DNase-fordøyd supernatanter av PMA-stimulerte nøytrofile hentet fra minst 5 forskjellige, uavhengige menneskerettighets givere.- For å kunne bruke den samme standard for en lang tid, samler og aliquot et stort volum av nøytrofile supernatantene fra hver enkelt donor. Oppsamler for eksempel 2 ml DNase-spaltet supernatanter fra PMA-stimulerte nøytrofiler vil resultere i 200 porsjoner (10 ul hver) nok til 200 ELISA-plater. Data som karakteriserer NET standard finnes i figur 5.
- Stimulere humane neutrofiler med 100 nM PMA for 4 timer og gjelder DNase fordøye deres supernatants ifølge trinn 3,4-3,5.
- Samle, basseng, delmengde (10 mL) og gratisze (-20 ° C) nøytrofile supernatanter.
- For å forberede "NET-standard", tine en delmengde / donor hentet fra minst fem forskjellige givere, bland dem og holde dem på is.
- Kast tinte prøver og bruke friske barn for neste eksperiment.
- Forbered en 1: 2 serie fortynning av NET-standard i PBS + EGTA.
- Fortynnet DNase1-fordøyd prøver (standard og ukjente supernatanter) 20 ganger i PBS + EGTA og delmengde dem på ELISA-plater belagt med fangst antistoffer.
- Inkuber ELISA-plater over natten ved 4 ° C og vaskes tre ganger med PBS.
- Gjelde detektering antistoffoppløsning (100 ul / brønn): pepperrotperoksidase konjugert anti-DNA-antistoff (1: 500, mus). Inkuber i 1 time i mørke.
- Etter fire vaskinger med PBS legge TMB-peroksidasesubstrat: 100 ul / brønn, 30 min. Blå farge er en indikasjon for peroxydaseaktivitet (NET finnes).
- Stoppe reaksjonen ved å tilsette 100 pl / brønn 1 M HCl. Deblå løsninger blir gul (figur 5A).
- Les absorbansen ved 450 nm ved anvendelse av en mikroplatefotometer.
- For dataanalyse, beregne mengden av MPO-DNA eller HNE-DNA komplekser i forhold til NET-standarden.
- Trekke fra bakgrunns optisk tetthetsverdi av målemediet fra alle prøver.
- Plotte absorbansverdiene (X-akse) av de fortynnede standardprøvene mot deres relative NET-innhold (Y-aksen) (figur 5A).
- Bruke nonsaturated spekter av denne standardkurve etablere en trendlinje (bruk beste eksponensiell tilpasning fra programvaren som brukes) (figur 5A). Ligningen for denne trendlinjen bestemmer konvertering av OD verdier til kvantitative mengder garn.
- Sett de målte OD verdiene av de ukjente inn i trendlinjeligningen fra 3.13.3 som vil gi mengden av garn i den ukjente prøven som prosentandel av NET-standard (figur 5A).
- Kalkuleregjennomsnitt av gjentak (tre paralleller) og presentere de endelige dataene som "mengde MPO-DNA eller HNE-DNA komplekser (% av standard)" (figur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tallene i dette manuskriptet beskrive fremgangsmåten til nøytrofile isolasjon, eksperimentelle prosedyrer, og presentere representative resultater med forklaring av data analyse. Figur 1 viser de sekvensielle trinnene med human neutrofil preparat. Denne protokollen representerer bare en mulig måte for nøytrofil isolasjon. Det gir store mengder hviler nøytrofiler stand til å frigi NET ved stimulering. Figur 2 viser hvordan den fluorescens-baserte DNA frigjøringsanalyse. Ved hjelp av en fluorescens mikroplateleser kinetikken av DNA frigivelse i humane neutrofiler er fulgt i 96-brønners mikroplater. Figur 3 forklarer hvert trinn i dataanalysen. Først beregne maksimal DNA signal nøytrofile behandlet med saponin (figur 3A). Økning i fluorescens blir alltid beregnes som forskjellen mellom den høyeste fluorescens-verdien og bakgrunnsfluorescens nivå (
Figur 4A viser ordningen forklare prinsippene i den MPO-DNA og HNE-DNA-ELISA-analyser. 4B viser representative immunfluorescens bilder av nonstimulated, PMA- og PAO1-aktiverte humane neutrofiler. Ekstracellulært DNA viser typisk NET morfologi og co-lokaliserer med MPO og citrullinated histon H4, en markør for NET formasjon. 6 Figur 4C viser MPO-DNA og HNE-DNA utgivelse i humane neutrofiler under samme, tidligere forhold (som figur 3B, 3C og 4B). IFant "net" ELISA-metoder er tidligere blitt karakterisert. 5 I korthet, 2 U / ml DNase-behandling (tilsvarende 1 pg / ml konsentrasjon av DNase anvendes) i 15 min ved RT resulterte i de høyeste MPO-DNA og HNE-DNA signaler . 5 Running prøver (100 ng / lane) på en agarosegel viste at DNA lengdei nedre kb range gir optimal ELISA signal. 5 DNA overdigestion (DNase dose på mer enn 20 U / ml) eller utelate enten fange eller deteksjonsantistoff avskaffet ELISA-signaler. 5
I tillegg er her assayene og "nettet standard", er videre karakterisert (figur 5A). NET-standarden inneholder i gjennomsnitt 19,5 ug / ml ekstracellulært DNA (målt ved hjelp av en standard med kjente DNA-konsentrasjon), 399 ng / ml MPO og 103,4 ng / ml HNE (kommersiell ELISAkits) (n = 8). Basert på den totale molekylvekt av MPO (84 kDa) og HNE (29,5 kDa) og det faktum at en ug DNA inneholder 9,91 x 10 14 nukleotider, inneholder den NET-standard 109 HNE-molekyler og 147 MPO-molekyler pr 1000 nukleotider (kb DNA- ). To-fold seriefortynning eksperimenter av NET-standard avslørte at de dynamiske serier av både MPO-DNA og HNE-DNA ELISA-analyser er mellom 19,0 til 609,0 ng /ml DNA-konsentrasjoner (Figur 5B). Fortynninger av lavere enn 32 ganger av NET standard resulterte i metning mens fortynninger av høyere enn 1024-fold ikke var forskjellig fra bakgrunnen (figur 5B). Behandling av NET standard med proteasehemmere ikke endre sine resultater oppnådd av MPO-DNA og HNE-DNA-analyser indikerer at proteaser ikke forstyrrer disse analysene (figur 5C). Således resultater oppnådd på samme NET-standard prøve av den MPO-DNA eller HNE-DNA-ELISA-analyser sterkt korrelert med hverandre (figur 5D). For å vise at frosne PMN-supernatanter kan også brukes i disse assays, uten å miste effektivitet, noe alikvoter av NET-standarden ble etterlatt ubehandlet eller andre ble utsatt for en eller to fryse / tine-sykluser som utføres ved -20 ° C eller -80 ° C (1 time intervall). Ingen av fryse / tine behandlinger påvirket MPO-DNA eller HNE-DNA resultater (figur 5E). OppsummertNET-standarden gir et pålitelig referansepunkt i disse NET-kvantifisere analyser muliggjør kvantitativ sammenligning av netto resultat mellom uavhengige eksperimenter.
Fig. 1: Isolering av humane nøytrofiler nøytrofile granulocytter ble isolert fra perifert blod fra frivillige i henhold til den beskrevne protokoll. Blod inneholdende antikoagulant ble anvendt for å isolere neutrofiler ved dekstransedimentering og gradientsentrifugering. Blod uten antikoagulant ble anvendt for å fremstille serum. Levedyktigheten av de nøytrofile preparater bestemmes ved trypanblått eksklusjon assay. Nøytrofile renhet er vurdert av cytospin eller flowcytometri (CD16, CD66abcd dobbel-positive celler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Prinsipper for den ekstracellulære DNA Slipp analyse (A) Fluorescens kun kan oppnås i nøytrofile som plasma og kjernefysiske membraner har blitt kompromittert og membranen-ugjennomtrengelig DNA-bindende fargestoff kan binde seg til deres DNA. (B) Analysen utføres på sort 96-brønners mikroplater ved anvendelse av en mikroplate fluorimeter. (C) Et fluorimeter registrerer sanntids fluorescens kurver i hver brønn. En representant resultater i vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Analyse av DNA-frigjøring (.
Figur 4: MPO-DNA og HNE-DNA ELISA-analyser. Prinsipp og Representative resultater (A) Scheme forklareing hvordan MPO-DNA og HNE-DNA ELISA-analyser arbeid. (B) Representative resultatene av immunfluorescens bilder forberedt på menneskelige nøytrofile utsatt til 100 nM PMA eller P. aeruginosa PAO1 stamme (10 MOI) i 4 timer. Ekstracellulært DNA (DAPI, blå) co-lokaliserer i Nets med MPO (grønn) og citrullinated histon H4 (rød). Ett representativt resultat, n = 3 (C) NET frigjøring ble målt i humane neutrofiler er utsatt for de samme stimuli som ovenfor ved den MPO-DNA og HNE-DNA-ELISA-analyser. Gjennomsnitt ± SEM, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Karakterisering av "NET-standard" (A) Serial fortynninger. (1: 2) av NET standard ble utarbeidetog utsatt for MPO-DNA ELISA. Målte OD-verdier er plottet mot% av NET-standard innhold. Red "X" angir en målt OD-verdien av en ukjent prøve. Grå pilen indikerer hvordan "NET konsentrasjon" (blå "X") av den ukjente prøve som skal bestemmes ved hjelp av det sentrale området av standardkurven montert. (B) DNA-konsentrasjoner i seriefortynnet NET-standard prøver ble bestemt og plottet mot de målte OD verdier av MPO-DNA eller HNE-DNA-ELISA-analyser. Grå områder angir de dynamiske områder av analysene. (C) Proteasehemmer behandling (proteasehemmer cocktail, 1%) påvirker ikke utfallet av MPO-DNA eller HNE-DNA-analyser (NET-standard). Gjennomsnitt ± SEM, n = 2. (D) Korrelasjonen av MPO-DNA og HNE-DNA resultater (OD 450 nm) for serielt utvannet "net-standard" prøver i sine dynamiske områder (se 5B). (E) frysing og tine sykluser (-20 ° C eller -80 ° C; one eller to) påvirker ikke resultatene av MPO-DNA og HNE-DNA-analyser (NET-standard, gjennomsnitt ± SEM, n = 2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NET representerer en fascinerende roman mekanismen som nøytrofile drepe patogener. 1 Selv om litteratur NET har vært kontinuerlig utvide i løpet av de siste ti årene siden de ble oppdaget, flere viktige spørsmål knyttet til deres rolle i biologi, mekanikk og regulering forblir uklart. Hensiktsmessig metodikk må utvikles for å måle NET, dette svært unike antimikrobielle mekanisme. Denne artikkelen beskriver fremgangsmåter som kan brukes for å kvantifisere NET i en høy gjennomstrømning måte. Den første analysen følger kinetikken av fluorescensen til en membran-ugjennomtrengelig DNA-bindende fargestoff. Denne analysen gir store mengder informasjon på skråningen og hastighet av DNA frigjøring fra nøytrofile. Denne informasjonen er viktig i undersøkelser som studerer tidlig signalanlegg hendelser som førte til NET formasjon. All denne informasjonen går tapt i endepunkt forsøk som måler DNA-frigivelse på slutten av inkubering. Den ekstracellulære DNA dye-baserte analysen er ikke spesifikke for Nets. Denbare måler DNA utgivelse. For å bekrefte NET, er det allment akseptert å utføre immunfluorescens på NET dannende nøytrofile og viser samlokalisering av DNA med enten granule markører (MPO, HNE) eller histoner. Kvantifisering av immunfluorescens data er imidlertid svært kjedelig og subjektive.
Her er en modifikasjon av en tidligere utviklet ELISA-assay detektering av MPO-DNA komplekser presentert. En tilsvarende ELISA-analyse for måling av HNE-DNA komplekser som representerer bestemte NET tiltak er også beskrevet. 3,5 Begge analyser er blitt karakterisert i detaljert. 5 MPO-DNA og HNE-DNA-ELISA-analyser er kvantitativ og NET-spesifikke samtidig . 5 Disse funksjonene ikke er oppfylt av noen annen aktuell metode. Analysene er enkle å utføre og gir reproduserbare data. 5 Et begrenset DNase fordøyelsen trinnet er inkludert som sikrer rask og standardisert håndtering av nøter direkte på nøytrofile. 5 Disse analysene er egnet til comPare flere prøver på samme tid. I nye, kontrollmålinger er det vist at fryse / tine sykluser og proteaser ikke påvirke utfallet av MPO-DNA og HNE-DNA analyser. Det er ukjent, men om proteiner som er kjent for å binde seg til DNA i NET (inkludert histoner og LL-37) 1,11 komme i konflikt med disse analyser.
Kritiske trinn i de presenterte protokoller er følgende. Det er viktig å høste nøytrofile som er i en hvile, hviletilstand og ikke slipper store mengder NET spontant. Mangel på en hypoton lyseringstrinn for å fjerne røde blodlegemer i den fremlagte nøytrofile isolasjonsprotokoll er avgjørende for å oppnå ikke-aktiverte nøytrofiler. For å hindre neutrofil aktivering etter at cellene var blitt renset, er det også viktig å resuspendere neutrofiler i et medium inneholdende donor sin egen serum. For å få hvilende celler det er også viktig å bruke pyrogen- og forurensningsfrie reagenser under nøytrofile forberedelse. Spontagent NET frigjøring av nøytrofile granulocytter under ekstracellulære DNA utgivelsen analysen kan også skje. Tilsetning av 1% autologt serum til analysemedium er viktig for å hindre det. Høyere eller lavere doser av autologt serum kan bli testet for å få optimale resultater. Det er kritisk under MPO-DNA og HNE-DNA-ELISA-analyser som ble utgitt DNA bør ikke være over-fordøyd av DNase fordi det vil resultere i fullstendig tap av signalet. Derfor bør den optimale dosen bestemmes for hver ny batch-DNase. Parametrene for DNA-spaltning kan bli noe endret for å oppnå den høyeste ELISA-signaler er mulig. Det er også viktig å blande DNase og garn grundig for å sikre at DNase vil ha fri tilgang til DNA. Når høsting av fordøyd NET, vaske godt omfattende å samle alle Nets.
DNA-påvisningsgrensen for MPO-DNA og HNE-DNA-assays er omkring 10-20 ng / ml DNA (figur 5B). Serum og plasma fri DNA nivåer av several hundre til tusen ng / ml ble rapportert i sykdommer (kreft, systemisk lupus erythematosus, hjerteinfarkt infeksjon) som har vært forbundet med unormal NET formasjon. 12-14 Dette tyder på at de MPO-DNA og HNE-DNA ELISA-analyser har også potensial å være i stand til å kvantifisere NET i humane kliniske prøver. Dette fremtidig anvendelse av MPO-DNA og HNE-DNA ELISA-analyser vil gjøre det mulig å kvantitativt knytte NET til sykdom patogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human Neutrophil Elastase Rabbit Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2,000x coated |
| Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) | Millipore | 07-496 | 1:2,000x coated |
| DNase-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µg/ml used for digestion |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2.5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Cell death detection ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Microplate Spectrophotometer | Biotek | ||
| Gen5 All-in-One microplate software | Biotek | analytical tool (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0.2% final concentration/volume |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | Use 10 mM final concentration. |
| 1 M glucose | Sigma | Use 5 mM final concentration. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM final used |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Conical tubes 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Conical tubes 50 ml | Thermoscientific | 339652 | |
| Percoll (pH 8.5-9.5) | Sigma | P 1644 | Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G |
| Dextran | Spectrum | D1004 | |
| RPMI 1640 media | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 well assay plate black plate clear bottom | Costar | 3603 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
- Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34 (2013).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
- Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
- Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
- Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205 (2013).
- Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
- Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
- Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
- Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).
