Protocol
La Junta Institucional de la Universidad de Georgia Revisión aprobó el estudio de sujetos humanos para recoger la sangre periférica de voluntarios sanos (UGA # 2012-10769-06). 5,7,8 voluntarios firmaron el consentimiento informado necesario antes de la extracción de sangre. La investigación realizada en este artículo está en conformidad con las directrices éticas para la investigación médica en seres humanos de la Declaración de Helsinki.
1. Aislamiento de los neutrófilos de sangre periférica humana (Figura 1)
Nota: Hay varias maneras de aislar los neutrófilos de sangre periférica. El siguiente protocolo proporciona una posibilidad. Este protocolo produce un gran número de neutrófilos no activadas humanos capaces de liberar TNE a la estimulación externa. Utilice 40 ml de sangre entera obtenida de voluntarios sanos por punción venosa. 7,9
- Alícuota de sangre 20 ml en dos tubos cónicos de 50 ml. Añadir 10 ml de dextrano al 6%. Mezclar suavemente.
- Después de 20 minutos, la transferencia de leucocitos-rich fase superior sin tomar ninguna glóbulos rojos sedimentados en limpios de 50 ml tubos cónicos, y llenarlo con PBS estéril.
- Centrifugar a 400 xg 10 min. Resuspender pellet en 4 ml de PBS estéril.
- Preparar un 5 a paso Percoll gradiente de 85% -80% -75% -70% -65% en dos tubos de 15 ml cónicos y capa 2 ml de suspensión de leucocitos en la parte superior de cada gradiente.
- Centrifugadora 800 xg durante 30 min con frenos estarán desactivados.
- Recoge todas las células (neutrófilos) en las capas en el 75% / 80% y la interfaz 70% / 75%.
- Lavar las células dos veces en PBS (350 xg, 10 min, RT) y contar las células usando un hemocitómetro.
2. Medición de la Cinética de ADN extracelular de liberación utilizando una microplaca Fluorimétrico
Nota: Este método permite la medición de cambios en la fluorescencia de una membrana impermeable al colorante indicativo de la liberación de ADN en un formato de microplaca de 96 pocillos de unión a ADN (Figura 2).
- Preparar una suspensión de neutrófilos en medio de ensayo (HBSS +(V / v) 1% de suero autólogo + glucosa 5 mM) a una concentración de 2 x 10 6 células / ml.
- Añadir 5 mol / L del colorante de unión a ADN impermeable membrana. Mezclar suavemente.
- neutrófilos humanos alícuota (50 l / pocillo) en 96 pocillos de fondo negro, transparente microplacas. Asegúrese de que el medio de ensayo cubre todo el fondo del pozo. Si no, toque suavemente la placa en el lateral.
- Calentar los neutrófilos placa que contiene de 10 minutos a 37 ° C.
- Mientras tanto preparar soluciones de estímulos al doble de sus concentraciones finales a utilizar (en 37 ° C medio de ensayo en caliente). Como control positivo neto utilizar los neutrófilos humanos con 100 nM de forbol-miristato-acetato (PMA) durante 4 horas para desencadenar la liberación máxima NET. 5,8 estimulación de PMA durante 4 horas asegura la liberación máxima NET NET mientras que la formación espontánea sigue siendo baja 5,8.
- Preparar el fluorímetro de microplaca para la medición (4 hr, 37 ° C, 530 nm para la excitación y 590 nm para la emisión). </ Li>
- Estimular neutrófilos mediante la adición de solución de estímulo 50 l 50 l suspensiones de neutrófilos. Utilizar 0,5 mg / ml de saponina en un pocillo para medir la señal máxima de liberación de ADN.
- Colocar la placa en el lector y medir los cambios en la fluorescencia durante 4 horas a cada 2 minutos sin agitación.
- Para el análisis de datos, calcular los aumentos en la fluorescencia normalizados a través del tiempo.
- Restar de fluorescencia base de los valores de punto final para todos los pozos que incluye saponina (Figura 2A, B). Aumento de la fluorescencia saponina debe ser la señal más alta. Se conoce como "la liberación de ADN máxima" (Figura 2).
- Calcular los porcentajes de liberación de ADN en muestras desconocidas dividiendo los aumentos en la fluorescencia de muestras desconocidas por la liberación máxima de ADN.
- Los resultados promedio de las réplicas y los presentan como "% de la liberación máxima de ADN" (Figura 2C).
3. La cuantificación de la Forma NETación por MPO-ADN y ADN-HNE ensayos ELISA
Nota: Estos ensayos (MPO-ADN) modificado o establecido (HNE-ADN) en nuestro laboratorio cuantificar la formación neta midiendo los niveles de MPO-ADN y complejos de ADN HNE-5.
- Escudo de 96 pocillos de alta unión a placas de ELISA de capacidad durante la noche con anticuerpos de captura (50 l / pocillo): anti-MPO (dilución 1: 2000) o anti-HNE (1: 2000).
- Lavar las placas de ELISA tres veces con PBS (200 l / pocillo) y bloquearlas con BSA al 5% y albúmina de suero humano 0,1% durante 2 horas a RT (200 l / pocillo). Lavar tres veces con PBS.
- neutrófilos semilla en microplacas de 96 pocillos a una densidad de 100.000 células / pocillo en 100 l de medio de ensayo, y estimular la formación de NET. Se incuban las células: 4 h para 37 ° C.
- Realizar una digestión DNasa limitada mediante la adición de 2 U de DNasa / ml de sobrenadante de neutrófilos, mezclarlos bien. Mantenerlos a temperatura ambiente.
- Detener la DNasa después de 15 minutos mediante la adición de 11 l mM EGTA 25 (concentración final 2,5 mM). Mezclar bien. recoger supernatants en tubos de microcentrífuga limpios. muestras de giro para deshacerse de los restos de células a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. Transferir sus sobrenadantes en tubos de microcentrífuga limpios. Mantenerlos en hielo hasta que esté listo.
- Se utiliza una alícuota de un preparado previamente "estándar NET".
Nota: El NET-estándar es una mezcla de sobrenadantes de DNasa-digerido de neutrófilos estimulados por PMA obtenidos a partir de al menos 5 donantes humanos diferentes e independientes.- Para utilizar el mismo estándar para un largo tiempo, recoger y alícuota un gran volumen de sobrenadantes de neutrófilos de cada donante individual. El cobro por ejemplo 2 ml de sobrenadantes de DNasa-digerido de neutrófilos estimulados por PMA dará lugar a alícuotas de 200 (10 l cada uno) suficientes para 200 placas de ELISA. Datos que caracterizan el estándar NET se encuentran en la Figura 5.
- Estimular los neutrófilos humanos con PMA 100 nM durante 4 horas y aplicar DNasa digerir a sus sobrenadantes europea Según los pasos 3.4-3.5.
- Recoger, piscina, alícuota (10 l) y libresobrenadantes ze (-20 ° C) de neutrófilos.
- Para preparar el "NET-estándar", descongelar una alícuota / donante obtenida de al menos cinco donantes por separado, mezclar y mantenerlos en hielo.
- Desechar las muestras descongeladas y el uso de los frescos para el siguiente experimento.
- Preparar una dilución 1: 2 en serie de la red estándar en PBS + EGTA.
- Diluir muestras digeridas-Dnase1 (estándar y los sobrenadantes desconocidos) 20 veces en PBS + EGTA y alícuota ellos en placas de ELISA recubiertas con anticuerpos de captura.
- Incubar las placas de ELISA durante la noche a 4 ° C y los lavar tres veces con PBS.
- Aplicar la solución de anticuerpo de detección (100 l / pocillo): peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo anti-ADN (1: 500, de ratón). Incubar durante 1 hora en la oscuridad.
- Después de cuatro lavados con PBS añadir sustrato de peroxidasa TMB: 100 l / pocillo, 30 min. coloración azul es una indicación para la actividad de la peroxidasa (TNE) presentes.
- Detener la reacción mediante la adición de 100 l / pocillo de HCl 1. lossoluciones azules se vuelven amarillas (Figura 5A).
- Leer la absorbancia a 450 nm utilizando un fotómetro de microplacas.
- Para el análisis de los datos, el cálculo de la cantidad de MPO-ADN o ADN-HNE complejos en comparación con el estándar NET.
- Restar el valor de densidad óptica de fondo del medio de ensayo de todas las muestras.
- Representar gráficamente los valores de absorbancia (eje X) de las muestras patrón diluidas en contra de su contenido neto relativo (eje Y) (Figura 5).
- El uso de la gama no saturado de esta curva estándar de establecer una línea de tendencia (utilizar mejor ajuste exponencial del software utilizado) (Figura 5). La ecuación de esta línea de tendencia determina la conversión de los valores de DO a lo cuantitativo cantidades de los TNE.
- Introduzca los valores de DO medidos de las incógnitas en la ecuación de la línea de tendencia de 3.13.3 que le dará la cantidad de TNE en la muestra desconocida como porcentaje del precio neto estándar (Figura 5A).
- Calcularpromedios de repeticiones (por triplicado) y presentar los datos finales como "cantidad de MPO-ADN o complejos de HNE-ADN (%) de la norma" (Figura 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Las cifras en este manuscrito se describe el método de aislamiento de neutrófilos, los procedimientos experimentales, y presentar los resultados representativos con la explicación de análisis de datos. La figura 1 muestra las etapas secuenciales de la preparación de neutrófilos humanos. Este protocolo representa sólo una manera posible de aislamiento de neutrófilos. Se produce grandes cantidades de neutrófilos en reposo capaces de liberar TNE a la estimulación. La figura 2 muestra cómo funciona el ensayo de liberación de ADN basada en fluorescencia. Usando una fluorescencia cinética lector de microplacas de la liberación de ADN en los neutrófilos humanos se siguen en microplacas de 96 pocillos. Figura 3 explica cada paso del análisis de datos. En primer lugar, el cálculo de señal de DNA máxima en los neutrófilos tratados con saponina (Figura 3A). Aumento de la fluorescencia siempre se calcula como la diferencia entre el valor de fluorescencia más alto y el nivel de fondo de fluorescencia (
La Figura 4A representa el esquema para explicar los principios de la MPO-ADN y ADN-HNE ensayos ELISA. La Figura 4B muestra imágenes de inmunofluorescencia representativas de nonstimulated, PMA-y neutrófilos humanos PAO1-activado. ADN extracelular muestra morfología típica NET y co-localiza con MPO y la histona H4 citrulinados, un marcador de la formación de NET. 6 La figura 4C muestra la liberación de MPO-ADN y HNE-DNA en los neutrófilos humanos en las mismas, las condiciones anteriores (como en la Figura 3B, 3C y 4B). IThe métodos ELISA "red" se han caracterizado previamente. 5 Brevemente, 2 U / tratamiento con DNasa ml (equivalente a 1 mg / ml de concentración de la DNasa se utiliza) durante 15 min a RT dado lugar a las señales de MPO-ADN y HNE-ADN más altos . 5 muestras de rodadura (100 ng / carril) en un gel de agarosa reveló que la longitud del ADNen los rendimientos de rango kb inferiores óptima ELISA señal. 5 overdigestion ADN (ADNasa dosis mayor que 20 U / ml) o la omisión o bien la captura o el anticuerpo de detección abolieron las señales de ELISA. 5
Además, aquí los ensayos y el "estándar NET" son caracteriza además (Figura 5A). El NET-estándar contiene en promedio ADN 19.5 g / ml extracelular (medida mediante el uso de un estándar con concentraciones conocidas de ADN), 399 ng / ml de MPO y HNE / ml 103,4 ng (ELISAkits comerciales) (n = 8). Basado en los pesos moleculares totales de MPO (84 kDa) y HNE (29,5 kDa) y el hecho de que 1 g de ADN contiene 9,91 x 10 14 nucleótidos, el NET-estándar contiene 109 HNE moléculas y 147 moléculas de MPO por 1.000 nucleótidos (ADN kb ). Dos veces los experimentos de dilución en serie de la red estándar revelaron que los rangos dinámicos de ensayos tanto de la MPO-ADN y ADN-HNE ELISA son entre 19,0 a 609,0 ng /concentraciones de ADN ml (Figura 5B). Las diluciones de más baja que 32 veces de la norma NET como resultado de la saturación, mientras que las diluciones de mayor que 1,024 veces no fueron diferentes de la de fondo (Figura 5B). Tratamiento de la norma NET con inhibidores de proteasa no cambió los resultados obtenidos mediante los ensayos de MPO-ADN y ADN-HNE que indican que las proteasas no interfieran con estos ensayos (Figura 5C). Por lo tanto, los resultados obtenidos en la misma muestra NET habitual por la MPO-ADN o ADN-HNE ensayos ELISA fuertemente correlacionar entre sí (Figura 5D). Para mostrar que los sobrenadantes de PMN congeladas también se pueden utilizar en estos ensayos sin perder eficacia, algunas partes alícuotas de la NET-estándar se dejaron sin tratar o otros fueron expuestos a una o dos de congelación / descongelación ciclos realizados a -20 ° C o -80 ° C (intervalo de 1 hora). Ninguno de los tratamientos de congelación / descongelación afectó a las MPO-ADN o ADN-HNE resultados (Figura 5E). En resumen, laNET-estándar proporciona un punto de referencia fiable en estos ensayos NET-cuantificación que permite la comparación cuantitativa de los resultados netos entre experimentos independientes.
Figura 1:. El aislamiento de los granulocitos neutrófilos humana de neutrófilos se aislaron de sangre periférica de voluntarios de acuerdo con el protocolo descrito. La sangre que contiene anticoagulante se utilizó para aislar los neutrófilos por sedimentación con dextrano y centrifugación en gradiente. Sangre sin anticoagulante se utilizó para preparar el suero. La viabilidad de las preparaciones de neutrófilos se evalúa mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano. La pureza de los neutrófilos es evaluada por citospina o citometría de flujo (CD16, CD66abcd células doble positivas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Principios del Ensayo de liberación de ADN extracelular (A) La fluorescencia se obtiene solamente en los neutrófilos cuyas membranas plasmática y nuclear han sido comprometida y el colorante de unión a ADN membrana impermeable puede unirse a su ADN. (B) El ensayo se realiza en negro microplacas de 96 pocillos utilizando un fluorímetro de microplaca. (C) El fluorímetro registra curvas de fluorescencia en tiempo real en cada pocillo. Uno resultados representativos se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de los datos de liberación de ADN (.
Figura 4: MPO-ADN y ADN-HNE Ensayos ELISA:. Principio y resultados representativos (A) Esquema de explicaring cómo el MPO-ADN y el trabajo ensayos HNE-DNA ELISA. (B) Los resultados representativos de las imágenes de inmunofluorescencia preparados en los neutrófilos humanos expuestos a 100 nM PMA o P. cepa PAO1 aeruginosa (10 MOI) durante 4 horas. ADN extracelular (DAPI, azul) co-localiza en las redes con MPO (verde) y la histona H4 citrulinados (rojo). Un resultado representativo, n = 3. (C) liberación NET se midió en los neutrófilos humanos expuestos a los mismos estímulos que el anterior por la MPO-ADN y ensayos de HNE-DNA ELISA. La media ± SEM, n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Caracterización de las diluciones en serie "NET-estándar" (A). (1: 2) de la norma NET se prepararony se sometió a MPO-DNA ELISA. OD valores medidos se representan frente a% de contenido neto estándar. "X" roja indica un valor de DO medido de una muestra desconocida. flecha gris indica cómo la "concentración neta" ( "X" azul) de la muestra desconocida se determinará utilizando la gama central de la curva estándar añadida. Concentraciones (B) de ADN en muestras de red estándar diluidas en serie se determinaron y representaron frente a los valores de la DO medidos de la MPO-ADN o ADN-HNE ensayos ELISA. Las áreas grises indican los rangos dinámicos de los ensayos. (C) tratamiento inhibidor de proteasa (cóctel inhibidor de proteasa, 1%) no afecta a los resultados de la MPO-ADN o ensayos de HNE-ADN (NET-estándar). La media ± SEM, n = 2. (D) La correlación de la MPO-ADN y los resultados de HNE-ADN (OD 450 nm) de muestras diluidas en serie "red estándar" en sus rangos dinámicos (Ver 5B). (E) ciclos de congelación y descongelación (-20 ° C o -80 ° C; ona o dos) no afectan los resultados de la MPO-ADN y ensayos de HNE-ADN (NET-estándar, media ± SEM, n = 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TNE representan un fascinante nuevo mecanismo por el cual los neutrófilos matar los agentes patógenos. 1 Aunque la literatura de los TNE ha sido cada vez más importante en los últimos diez años desde su descubrimiento, varias cuestiones importantes relacionadas con su papel en la biología, el mecanismo y la regulación siguen sin estar claros. metodología adecuada tiene que ser desarrollado para medir los TNE, este mecanismo antimicrobiano muy singular. Este artículo describe métodos que se pueden utilizar para cuantificar los TNE en un alto rendimiento manera. El primer ensayo sigue una cinética de fluorescencia de un colorante de unión a ADN a la membrana impermeable. Este ensayo proporciona gran cantidad de información sobre la pendiente y la velocidad de la liberación de ADN a partir de los neutrófilos. Esta información es crucial en las investigaciones que estudian los eventos de señalización que conducen a la formación temprana NET. Toda esta información se pierde en los ensayos de punto final midiendo la liberación de ADN en el final de la incubación. El ensayo basado en colorante de ADN extracelular no es específica para los TNE. Esosólo se mide la liberación de ADN. Para confirmar los TNE, es ampliamente aceptado para realizar inmunofluorescencia sobre los neutrófilos formación de NET-y mostrar co-localización de ADN, ya sea con marcadores de gránulos (MPO, HNE) o histonas. La cuantificación de los datos de inmunofluorescencia es sin embargo muy tedioso y subjetiva.
Aquí, se presenta una modificación de un ensayo de ELISA desarrollado previamente detectar los complejos de ADN-MPO. También se describe un ensayo de medición similares complejos HNE-ADN de ELISA que representan medidas específicas NET. 3,5 Ambos ensayos se han caracterizado en detalle. 5 La MPO-ADN y ADN-HNE ensayos ELISA son cuantitativos y NET-específico, al mismo tiempo . 5 Estas características no son cumplidos por cualquier otro método actual. Los ensayos son fáciles de realizar y proporcionar datos reproducibles. 5 se incluye una etapa de digestión DNasa limitada que garantiza una manipulación rápida y estandarizada de los TNE directamente sobre los neutrófilos. 5 Estos ensayos son adecuados para compare varias muestras al mismo tiempo. En las nuevas medidas de control, se demuestra que los ciclos de congelación / descongelación y proteasas no afectan a los resultados de los ensayos de MPO-ADN y ADN-HNE. No se sabe, sin embargo, si las proteínas que se sabe que se unen al ADN en las redes (incluyendo las histonas y LL-37) 1,11 interferirían con estos ensayos.
Los pasos críticos de los protocolos presentados son los siguientes. Es importante para cosechar los neutrófilos que están en una de reposo, estado de reposo y no liberan gran cantidad de TNE espontáneamente. La falta de una etapa de lisis hipotónico para eliminar las células rojas de la sangre en el protocolo de aislamiento de neutrófilos se presenta es crucial para obtener los neutrófilos no activadas. Para inhibir la activación de neutrófilos después de que se han purificado las células, sino que también es importante para volver a suspender los neutrófilos en un medio que contiene suero del propio su donante. Para obtener células quiescentes también es crucial utilizar reactivos de pirógenos y libre de contaminación durante la preparación de neutrófilos. Spontanea liberación neta de neutrófilos durante el ensayo de liberación de ADN extracelular también podría suceder. La adición de suero autólogo al 1% al medio de ensayo es importante para prevenirlo. Las dosis más altas o más bajas del suero autólogo se podrían probar para obtener resultados óptimos. Es crítico durante la MPO-ADN y ensayos de HNE-DNA ELISA que libera ADN no debe ser sobre-digerido por la DNasa porque dará lugar a la pérdida completa de la señal. Por lo tanto, la dosis óptima debe determinarse para cada nuevo lote de DNasa. Los parámetros de la digestión del ADN se podrían cambiar ligeramente para obtener la más alta ELISA posibles señales. También es importante mezclar la DNasa y redes a fondo para asegurar que la DNasa tendrá acceso claro al ADN. En la cosecha de las redes digeridos, lavar el pozo ampliamente para recoger todas las redes.
El límite de detección de ADN de la MPO-ADN y ensayos de HNE de ADN es de alrededor de 10 a 20 ml de ADN / ng (Figura 5B). Suero y plasma de ADN libre de los niveles de SeverSe informó al cien a mil ng / ml en las enfermedades (cáncer, lupus eritematoso sistémico, infección del miocardio) que han sido asociados con la formación anormal NET. 12-14 Esto sugiere que los ensayos de MPO-ADN y ADN-HNE ELISA también tienen el potencial para ser capaz de cuantificar los TNE en muestras clínicas humanas. Esta aplicación futura de la MPO-ADN y ADN-HNE ensayos ELISA permitirá vincular cuantitativamente TNE a la patogénesis de la enfermedad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human Neutrophil Elastase Rabbit Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2,000x coated |
| Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) | Millipore | 07-496 | 1:2,000x coated |
| DNase-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µg/ml used for digestion |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2.5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Cell death detection ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Microplate Spectrophotometer | Biotek | ||
| Gen5 All-in-One microplate software | Biotek | analytical tool (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0.2% final concentration/volume |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | Use 10 mM final concentration. |
| 1 M glucose | Sigma | Use 5 mM final concentration. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM final used |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Conical tubes 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Conical tubes 50 ml | Thermoscientific | 339652 | |
| Percoll (pH 8.5-9.5) | Sigma | P 1644 | Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G |
| Dextran | Spectrum | D1004 | |
| RPMI 1640 media | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 well assay plate black plate clear bottom | Costar | 3603 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
- Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34 (2013).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
- Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
- Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
- Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205 (2013).
- Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
- Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
- Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
- Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).
