Abstract
Charakterisieren Thymus Absetzen Vorläufern ist wichtig, die pre-Thymus Stufen T-Zell-Entwicklung zu verstehen, wesentlich, Strategien für T-Zell-Ersatz in lymphopenischen Patienten zu erstellen. Wir untersuchten Thymus Beilegung Vorläuferzellen aus murinen embryonalen Tag 13 und 18 Thymi durch zwei komplementäre in vitro und in vivo-Techniken, die beide auf der Grundlage des "hängenden Tropfen" Methode. Diese Methode erlaubt besiedeln bestrahlten fetalen Thymus Keulen mit E13 und / oder E18 Thymus-Vorläuferzellen durch CD45 allotypische Marker und damit im Anschluss an ihre Nachkommen aus. Colonization mit gemischter Bevölkerung ermöglicht die Analyse Zell autonomen Unterschiede in biologischen Eigenschaften der Vorläuferzellen während Besiedlung mit entweder Bevölkerung beseitigt mögliche Wettbewerbsselektionsdruck. Die Kolonisierten Thymus Lappen kann auch in immundefizienten männlichen Empfängermäuse ermöglicht die Analyse der reifen T-Zellen-Nachkommen in vivo, wie Populationsdynamik von t aufgepfropft werdener peripheren Immunsystem und Besiedlung von verschiedenen Geweben und Organen. Fötalem Thymus-Organkulturen zeigte, dass E13 Vorläufern entwickelt sich rasch in alle reifen CD3 + Zellen und führten zu der kanonischen γδ T-Zell-Untergruppe, wie dendritische epithelialen T-Zellen bekannt. Im Vergleich dazu haben E18 Vorläuferzellen eine verzögerte Differenzierung und konnten dendritische epithelialen T-Zellen zu erzeugen. Die Überwachung der peripheren Blut von Thymus-gepfropft CD3 - / - Mäuse zeigten weiter, dass E18 Thymus Beilegung Vorläuferzellen zu erzeugen, mit der Zeit, eine größere Anzahl von reifen T-Zellen als ihre Gegenstücke E13, eine Funktion, die nicht in der kurzen Frist fetalen Thymus geschätzt werden konnte Organkulturen.
Introduction
T-Lymphozyten, wobei das αβ oder γδ T-Zell-Rezeptor (TCR), differenzieren in einem speziellen Organ, der Thymus. Die ausgereifte Thymus ist in zwei unterschiedliche Bereiche unterteilt: die Rinde, in der Thymus-Vorläuferzellen entwickeln und wo Thymozyten, die produktiv TCR β und α-Kette-Gene neu anordnen aus programmierten Tod (ein Verfahren, wie die positive Selektion bekannt) gerettet; und der Medulla, wo ausgewählt Thymozyten mit zu starke Reaktivität Selbstliganden werden gelöscht (negative Selektion) 1,2. Der Thymus stammt aus dem endodermalen Schicht der dritten Schlundtasche, die später von mesenchymalen Zellen 3 umgeben ist. Es wird von hämatopoetischen Vorläuferzellen ab Embryonaltag E12, und danach wird eine kontinuierliche Einstellung für den normalen T-Zell-Entwicklung 4 erforderliche besiedelt. Thymus Einwanderer entwickeln durch aufeinanderfolgende Entwicklungsstadien, von einem streng regulierten Programm, initiiert und inszeniert maidurch die Aktivierung des Notch-Signalwegs auf Thymocyten bei Wechselwirkung mit seinem Liganden, wie 4 delta ntained, ausgedrückt Thymusepithelzellen (TECs) 5.
Thymozyten-Entwicklung beginnt bei der so genannten CD4 - CD8 - doppelt negativ (DN) Stufen. , DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) und DN4 (CD25 - CD44 -) - DN Thymozyten kann weiter gemäß der Expression von CD25 und CD44 in DN1 (CD44 + CD25) unterteilt werden. CD24 (HSA) und CD117 (c-Kit) weiter unterteilt die DN1 Fach in 5 Untergruppen, wo DN1A und b entsprechen frühen Vorläuferzellen des Thymus (ETP). Thymozyten neu anordnen TCR δ, β und α-Ketten an der DN Bühne und pre-TcR Auswahl (DN3-DN4 Stufen) zu unterziehen. Sie Transit auf die CD4 + CD8 + doppelt positiven (DP) Fach, in dem der TCR α-Kette lagert sich vor der positiven und negativen selection. In dieser Phase am meisten Thymozyten eliminiert werden und nur ein kleiner Anteil (3-5%) zu erreichen, die den CD4 + oder CD8 + T-Zellen zu reifen Fach.
Die lymphatischen Differenzierungsweg schreitet durch die Stadien der HSCs, die multipotenten Vorläuferzellen (MPP) und lymphatischen grundiert multipotenten Vorläuferzellen (LMPP), die die Erythrozyten und Megakaryozyten Potential 6 verloren zu generieren. LMPP phänotypisch durch das Fehlen von differenzierten Blutzellmarker definiert (Linie negativ, Lin -), die Expression von c-Kit (CD117), Sca-1 und Flt3 / Flk2 (CD135) und das Fehlen von nachweisbaren Konzentrationen an Interleukin ( IL) -7-Rezeptor-α-Kette (IL-7rα oder CD127). LMPPs weiter zu differenzieren, die in Stamm lymphatischen Vorläuferzellen (CLP) 7, dass von diesem Zeitpunkt haben die Fähigkeit, myeloischen Zellen erzeugen verloren. CLP behalten Lymphozyten (B- und T-Zelle), NK-Zelle DC und angeborenen lymphoiden Zelle (ILC) Potential, und unterscheiden sich von LMPP durch die Expression von CD127 und das Fehlen von hohen Sca-1.
Obwohl die Art der Thymus Beilegung Vorläuferzellen (TSP) wurde ausgiebig diskutiert 8, vor kurzem wurde klar, dass TSP Änderung Phänotyp, Differenzierungspotenzial und Funktion, während der gesamten Entwicklung 9. Wir führten in vitro und in vivo-Tests, um die TSP, durch FACS-Zellsortierung entweder von E13 (erste Welle) oder E18 (zweite Welle) isoliert kennzeichnen. Fetalen Thymus Organkulturen (FTOC) mit bestrahlten Thymus Lappen kolonisiert durch die gleiche Anzahl von E13 und E18 Vorläuferzellen, die verschiedene allotypische Marker, im Anschluss an ihre Nachkommen in einer ähnlichen Entwicklungsumgebung erlaubt und offenbarte Zelle innewohnenden Eigenschaften, unterschiedlich zwischen beiden Arten von Vorläuferzellen. Thymus Lappen entweder E13 oder E18 TSP kolonisiert erlaubt Entwicklung ohne Selektion aufgrund der Konkurrenz zwischen den beiden Vorläufern. In vivo Transplantation der kolonisierten Thymus Lappen weiter gezeigt, dass auch ter reifen Nachkommen von E13 und E18 TSP haben unterschiedliche biologische Eigenschaften in vivo. FDA von der ersten Welle schnell generieren T-Zellen, sondern führen zu geringen Anzahl von αβ und γδ T-Zellen. Unter den letzteren entdeckten wir Vγ5Vδ1 dendritischen epithelialen T-Zellen (DETC), die eine Invariante TcR, wandern in die Epidermis, wo sie eine Funktion, bei der Wundheilung ausüben und werden nur während der Embryonalentwicklung 10 hergestellt haben. Im Gegensatz dazu TSP aus der zweiten Welle zu nehmen längere Zeit, um eine hohe Zahl von TcR + T-Zellen zu erzeugen und sind unfähig, DETC generieren.
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Protocol
Ethics Hinweise: Alle Experimente wurden nach dem Pasteur-Institut Ethik-Charta, von der Französisch Landwirtschaftsministerium genehmigt durchgeführt und an die EU-Richtlinien. Ein Manipulator mit Training am Kleintier-Chirurgie, von der Französisch Ministerium für Landwirtschaft zertifiziert, führt alle chirurgischen Eingriffen.
HINWEIS: Siehe Anhang in Tabelle 1, die das 5-Stufen-Plan Verfahren.
1. Auswahl der Embryonen
- Verwenden Sie 36 C57BL / 6 CD45.2 Frauen, 12 Frauen CD45.1, 12 C57BL / 6 CD45.1 Männer und 12 C57BL / 6 CD45.2 Männer. Überschreiten der Weibchen mit entweder männlich Genotyp erzeugen Embryonen CD45.1 / 2 und CD45.1 als Quelle von TSP oder CD45.2 als Quelle des Empfängers Thymus Keulen verwendet. Haus alle Männer einzeln.
- Embryonen für E18 TSP Isolation zu erhalten, setzen Sie 2 Hündinnen in einem Käfig mit einem Männchen CD45.1 um 6 Uhr, 21 Tage vor dem Pfropfen Experiment. Prüfen Sie das Vorhandensein einer vaginalen Stecker am nächsten Tag, vor Mittag. Sepabewerten die eingesteckt Weibchen.
- Um E14 Embryonen zu erhalten, die von TSP besiedelt werden, wiederholen Sie den Vorgang oben (1.2), mit Männern CD45.2, 17 Tage vor dem Pfropfen Experiment.
- Embryonen zu E13 TSP isolieren zu erhalten, wiederholen Sie den Vorgang oben (1.2), mit Männern C57BL / 6 CD45.1, 16 Tage vor dem Pfropfen Experiment.
2. Dissection des Embryos unter einem Horizontal Laminar Flow Hood
Anmerkung: Zwei Tage vor der Transplantation Experiments.
- Opfern, die schwangeren Frauen durch Genickbruch oder durch fortschreitende Verwaltung von CO 2 -Gas während mindestens 5 min, in einem geschlossenen Raum zu sättigen. Achten Sie darauf, den Tod durch endgültige Festnahme von Herz-Kreislauf-Atembewegungen. Befeuchten Sie den Bauch mit 70% Ethanol.
- Einen Längsschnitt in der Haut an der Mittellinie Bauch und öffnen Sie sie durch Ziehen der Haut auseinander. Öffnen Sie das Bauchfell mit einer Pinzette und Schere, ohne den Verdauungstrakt. Ziehen Sie das gespaltene uteruns und trennen es von der Vagina mit der Schere.
- Legen Sie die Gebärmutter in einem 90 x 15 mm Petrischale mit 40-50 ml DPBS und schneiden quer zwischen jedem Embryo decidua.
- Mit dem Paar von feinen Spitze Schere und einer feinen Pinzette entfernen Sie die Muskelmembran der Gebärmutter, nehmen Sie die Embryonen durch Schneiden zwischen der Plazenta und der Dottersack, und entfernen Sie die amnios, die Beibehaltung ist die Embryonen.
- Zeigen die Embryonen in einer Petrischale 90 x 15 mm enthält HBSS + 1% fötales Kälberserum (FCS). Für Embryonen älter als E15, entfernen Sie die Köpfe mit einer Schere vor jeder weiteren Präparation.
3. Isolierung des Thymus
- Unter der binokularen Vergrößerungslinse, setzen Sie den Embryo, liegend in Rückenlage (ventral), auf einem nassen Gaze Betten.
- Legen Sie eine Pinzette in Längsrichtung entlang der Knorpel des Brustbeins, kneifen und öffnen Sie die Brust-Netz. Mit einer gebogenen Pinzette, ziehen Sie den Brustwand zur Seite, um die t visualisierenhymic Nocken an jeder Seite der Luftröhre.
- Sorgfältig halten jeder Lappen von unterhalb Kneifen mit einer feinen Pinzette und legen Sie sie in eine Petrischale mit 1 ml HBSS + 1% FCS. Isolieren Sie die Lappen und entfernen umgebende Bindegewebe mit zwei 1 ml-Spritzen + 26 G ⅜ "Nadeln, ohne Beschädigung der Kapsel.
- Waschen der Lappen in 3 ml HBSS + 1% FCS, um Blutzellen zu eliminieren.
Hinweis: Vor dem E15 sind Thymus Nocken an jeder Seite der Luftröhre und später Sicherung in der Mitte angeordnet, um eine bi-lobar Organ bilden.
4. Zellsuspensionen
- Necken neben die Lappen unter der binokularen Vergrößerungslinse, mit zwei 26 G Nadeln auf 1 ml Spritzen montiert, in HBSS + 1% FCS. Filtern der Zellsuspension durch ein Nylonnetz.
5. Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern und Zellsortierung
HINWEIS: Alle Antikörper werden zuvor titriert, um eine optimale Definition der Bevölkerung (die titrat erhaltenIon kann mit dem Antikörper Charge variieren).
- Thymozyten (E13 oder E18) für 15-30 min Inkubation bei 4 ° C mit 100 & mgr; l eines Cocktails von biotinyliertem Antikörper an Linie positive Zellen zu färben (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , anti- CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25).
- Abzuwaschen Überschuss an Antikörpern Spin-Down der Röhrchen mit 4 ml HBSS + 1% FCS bei 280 g für 7 min, Beseitigung des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in frischem HBSS + 1% FCS. Wiederholen Sie die Zentrifugation.
- E18 Biotin-markierten Zellen mit Streptavidin-Microbeads inkubiere 15 Minuten bei 4 ° C und wäscht die Zellen zweimal in HBSS 1% FCS. Wieder die Zellen in 2 ml HBSS + 1% FCS. Esten E13 Thymozyten Linie negativ und daher nicht MACS Anreicherung vor der Zellsortierung benötigen.
- Leiten die Zellen auf dem LS-Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wenn alle die Zellsuspension eingegeben die Säule 2 ml HBSS + 1% FCS. Wiederherstellen der4 ml der Säule durchfließen und Zentrifuge die Zellen für 7 min bei 280 x g.
- Re-suspendieren des Pellets entweder abgereichertes E18 oder E13 gesamten Thymozyten in 50 ul TSP Antikörper mix (anti-CD117 APC, Anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24-FITC, anti-CD44 APCCy7 und Streptavidin Pacific Blue ) und Inkubation für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln.
- Die Zellen werden mit 4 ml HBSS + 1% FCS und Wieder die Zellen in 1 ml HBSS + 1% FCS mit Propidiumiodid.
- Sortieren Sie die TSPs Lin - CD44 + CD117 + CD24 + CD135 CD127 niedrigen + Zellen in einem FACS (mit 4-Laser) auf eine 1,5-ml-Röhrchen mit 200 ul Vollmedium + 20% FCS. Tor zunächst die Zellen entsprechend ihrer Größe und Granularität auf der FSC und SSC-Kanäle. Eliminieren abgestorbene Zellen (Färbung mit Propidiumjodid), Gate-out Dubletten und Ergebnis der Fluoreszenz in exponentiellen Skalen. Rund 100 oder 600 FDA kann von einem E13 oder E18 ein Thymus, JEWEILIGEN erhältlichEly.
6. Colonization von E14 Thymic Lobes mit Vorläufern: Hanging-Drop-Technik
- Bestrahlen (30 Grays = 30 Gy) E14 Thymus Lappen aus CD45.2 Embryonen, 3 Stunden, bevor Kultur.
HINWEIS: E14 oder E15 Thymus Lappen wurden erfolgreich als Empfänger der T-Zell-Vorläuferzellen verwendet. Verwendung Empfänger Thymus Lappen später Schwangerschaftstagen führt zu vorzeitigem Nekrose aufgrund der größeren Größe der Orgel während Thymus-Lappen in früheren Schwangerschafts Tagen entwickeln schlecht, wahrscheinlich aufgrund der unvollständigen Entwicklung der Epithelzellen. - Zentrifuge nach FDA und wieder die Zellen in Kulturmedium (OPTI-MEM komplettes Medium mit 10% FCS, Penicillin (50 Einheiten / ml), Streptomycin (50 ug / ml) und 2β-Mercaptoethanol (50 uM)), so daß 35 ul enthalten 500 TSP.
- Legen Sie eine 35 ul Tropfen Zellsuspension jedes zweite Well einer 60 gut Terasaki Platte.
HINWEIS: 35 ul Tropfen können fusionieren, wenn sie in zusammenhängende Vertiefungen gegeben werden. - Legen Sie einen Lappen auf der bestrahlten Oberfläche jeder Tropfen. Schließen Sie das Terasaki Platte und drehen Sie die Platte auf den Kopf die Zellen des apikalen Pol der Tropfen durch die Schwerkraft erreichen zu lassen.
- Schlagen Sie vorsichtig die Oberseite der umgedrehten Platte die Lappen zu zwingen, sich an der apikalen Rand des Drop verschieben. Inkubieren des invertierten Terasaki Platte in einem befeuchteten Inkubator für 48 h bei 37 ° C + 5% CO 2. Nach der Kolonisierung entweder Kultur E14 Thymi in FTOC 7 oder Transplantat unter die Nierenkapsel eines Empfänger erwachsenen Maus 8.
7. Fetal Thymic Organ Culture
- Zeigen 3 ml Vollmedium auf einer 35 mm Petrischale. Ein isoporösen Membranfilter schwimmend auf dem Medium. Platzieren Sie die rekonstituierte Lappen am Rand der Membran mit einer Pinzette (nicht mehr als 8 Keulen auf einer Membran).
- Legen Sie die Petrischalen mit den Thymus-Lappen in einem 90 mm-Petrischale, zusammen mit einem 35-mm-Schale, ohne Deckel, mit 2 ml water, um eine optimale Luftfeuchtigkeit zu gewährleisten. Inkubiere 12 Tage bei 37 ° C + 5% CO 2.
8. Grafts unter die Nierenkapsel unter sterilen Bedingungen
HINWEIS: Die Nierenparenchyms durch Ausbilden einer Kapsel Bindegewebe umgeben. Der Teilkapsel Region ist besonders reich an Blut- und Lymphgefäße, wodurch ein geeignetes Umfeld für die Entwicklung von Transplantaten (zB Thymus Lappen, Langerhans-Inseln oder Neugeborenen Herzen). Transplantate werden normalerweise auf der linken Niere gemacht, weil sie leichter zugänglich als die rechte Niere ist. CD3 - / - männliche Mäuse wurden als Empfänger wodurch Transplantat-Wirt-Reaktion aufgrund Nebenhistokompatibilitätsantigene auf dem Y-Chromosom verbunden, weil die Geschlechtsbestimmung vor E15 ist nicht leicht getan verwendet.
- Sterilisieren der Instrumente und tragen sterile Handschuhe an der Operation. Betäuben der Maus durch intraperitoneale Injektion einer Lösung von Ketamin 10 mg / ml + Xylazin 1 mg /ml in PBS verdünnt (50 bis 100 & mgr; l pro 10 g Körpergewicht), unter Verwendung einer 1 ml-Spritze. Stellen Sie sicher, Anästhesie, indem fehlende Inter Reflexe. Geben Sie einen Tropfen Hydro Optimune Gel auf jedes Auge bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
HINWEIS: Die Lösung sollte aus dem Stegreif vorbereitet und erwärmt bei Raumtemperatur vor der Injektion werden. Die Betäubung Dauer von mindestens 20 min. Der Grad der Anästhesie sollte entlang der Operation kontrolliert werden. Die Anästhesie kann durch intraperitoneale Injektion von halbe Dosis alle 20 Minuten verlängert werden. - Platzieren Sie die Maus auf der rechten Seite, unter einer horizontalen Lamina-Flow-Haube. Sterilisation des Operationsfeldes mit 70% Ethanol und 10% Iodid dermic Lösung. Mit einem Zangenteil die Maus Haare entlang eines 2 cm Länge direkt über dem Gelenk der Hinterhand. Rasieren Sie die OP-Bereich.
- Mit einem Skalpell, einen Einschnitt 1,5 cm Länge der ersten, der Hautgewebe, dann mit einer Schere das Muskelgewebe. Anwenden eines leichten Druck auf beiden Seiten des Einschnitts, Die die Niere aus der Bauchhöhle zwingen wird.
- Bewerben Kochsalzlösung mit einem Baumwollknospe, die Nieren feucht zu halten. Wenn Sie Schwierigkeiten bei der Freilegung der Orgel haben, verwenden Sie eine Flachzange, um die umliegende Gewebe Adipozyten, auf die die Niere angeschlossen ziehen. Pflegen Sie die Nieren aus dem retroperitonealen Hohlraum von einem Wattestäbchen unter der Orgel platziert.
- Mit zwei feinen Pinzette, machen Sie eine 2-3 mm Loch in der Kapsel (berühren Sie nicht die Parenchym um Blutungen zu verhindern). Während des gesamten chirurgischen Eingriffs halten die freiliegenden Nierenkapsel kontinuierlich befeuchtet.
- Setzen Sie sorgfältig die Lappen unter die Nierenkapsel, durch die Aufrechterhaltung der Wand der Kapsel geöffnet und schieben Sie das Transplantat unter der Kapsel zum Rand Pol. Platzieren Sie bis zu 6 Keulen pro Niere.
- Ersetzen Sie die Niere in der retro-Bauchhöhle. Naht der Muskel Aponeurosen, dann die Haut mit einzelnen Chirurgen Knoten. Befeuchten Sie die Wunde mit 10% Iodid Povidonlösung. Platzieren Sie die Maus auf einer beheizten pad bei 37 ° C.
- Umfrage der transplantierten Maus bis zur vollständigen Erholung von der Anästhesie durch Kontrolle der Herz-, Atemwegs- und Whisker-Bewegungen, Schleimhaut-Farben bis zur vollständigen Rückgewinnung von Selbst gesehen enthaltenen Bewegungen.
HINWEIS: Wir empfehlen Injektion von schmerzstillende Lösung (Buprenorphin, 0,1 mg / kg) intra Muskel direkt nach der Operation und die 2 Tage nach der Operation, um postoperative Schmerzen zu verhindern. - Halten Sie das betrieben Tier isoliert, bis vollständig erholt. Untersuchen Sie jeden zweiten Tag die Stiche der Wunde zu überprüfen und zu verhindern Infektion. Nie beobachtet Wundinfektion nach diesem Verfahren.
HINWEIS: wöchentliche Analyse von peripheren Blutzellen aus dem CD3 - / - Mäuse aufgepfropft uns erlauben, die Thymus-abgeleiteten Populationen entweder E13 oder E18-Vorläufern unter Verwendung der CD45 allotypische Marker und T-Zelllinie spezifische Antikörper (Abbildung 3) entstand detektieren.
9. Analyse des TSP Nachkommen mittels Durchflusszytometrie
- Stain Zellsuspensionen aus einzelnen Lappen mit einem Antikörper Mischung, die Antikörper, die CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, PE Vδ1 und inkubieren, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
- Wieder die Zellen in HBSS + 1% FCS + Propidiumiodid und in einem Strömungs analysieren Zytometer (siehe Ergebnisse in Figur 2).
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Representative Results
Um ein Verfahren zum Thymus Keulen endogener Thymozyten ermöglicht die beste Entwicklung der Kolonisierung Vorläufern führen zu wählen, verglichen wir das Niveau von T-Zell-Rekonstitution in Thymus Keulen nach Bestrahlung kolonisiert oder eine 5-Tage-desoxy-guanosin (d-Gua) Behandlung. Die Ergebnisse zeigen, dass, obwohl es keinen Unterschied am Tag 9 der Kultur enthaltenen bestrahlt Lappen mehr T-Zellen als jene mit d-Gua behandelt, am Tag 12. Somit ist die Bestrahlung geeigneter als d-Gua-Behandlung an T-Zell-Entwicklung zu erhalten, nachdem Thymus Kolonisation (Abbildung 1). Das Entwicklungspotential von E13 und E18 TSP studieren, kolonisiert wir E14 bestrahlt Thymus Keulen mit einer Mischung zu gleichen Teilen aus den beiden Arten von Vorläufern. Die Ergebnisse zeigen, dass E13 FDA führen zu weniger Thymozyten und weniger als DP E18 TSP aber dagegen E13 TSP erzeugen DETC und höheren Frequenzen von CD3 + reifen Zellen (Abbildung 2). Um die in vivo Topf analysierenrenz von E13 und E18 TSP wurden Thymus Keulen mit jeder Art von Vorläuferzellen besiedelt unter die Nierenkapsel von CD3 gepfropft - / - Empfänger. Die Ergebnisse zeigen, dass in Übereinstimmung mit der FTOC gab E13 TSP Vorrücken in T-Zellen schneller als E18 Progenitoren aber die Anzahl von zirkulierenden T-Zellen signifikant geringer (Abbildung 3).
Abbildung 1: T-Zell-Entwicklung ist effizienter in bestrahlten als in Desoxyguanosin behandelt kolonisiert Thymus Keulen E14 Thymus Lappen (CD45.2) wurden entweder mit 30 Gy bestrahlt und für 5 Tage mit desoxy-guanosin (d-Gua) behandelt.. Thymus Lappen wurden dann mit 1000 Lin kolonisiert - CD117 + Sca-1 + (LSK) E14 FL-Zellen aus CD45.1 / 2 Embryonen isoliert, in hängenden Tropfen für 48 Stunden kultiviert und auf einem Filter. Der Effizienz en wurden keine Unterschiede beobachtetendogene Thymozyten Verarmungs zwischen den beiden Gruppen von Thymus Lappen. Entwicklung von Thymozyten mit Antikörpern gegen CD45.1, CD45.2, CD3, Vγ5, Vδ1 und CD4 gefärbt wurden am Tag 9 und 12 mittels FACS analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 2: Im Gegensatz zu E18, E13 TSPs erzeugen DETC Vγ5Vδ1 CD45.2 Thymus Lappen wurden bestrahlt und für 48 Stunden besiedelt mit einer gemischten Gruppe von 500 E13 TSP aus CD45.1 / 2 Embryonen und 500 E18 TSP aus CD45.1 Embryonen . Unter diesen experimentellen Bedingungen, E13 und E18 TSP entwickeln in der gleichen Umgebung und Unterschiede in der Geschwindigkeit der nach Kultur beobachtet Differenzierung und reifen T-Zellen-Untergruppen können nur Unterschiede in der Zell intrinsische biologische reflektierenEigenschaften. Nach 12 Tagen in Kultur Thymozyten aus einzelnen Lappen wurden durch Flusszytometrie nach Färben mit Antikörpern, die CD45.1, CD45.2, CD4, CD8, CD3, Vγ5, Vδ1 analysiert. (A) Panels zeigen die Anzahl von Zellen in jedem Lappen gewonnen. (B) Repräsentative Durchflusszytometrie Profile. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: E13 TSPs entwickeln schneller als E18 TSPs CD45.2 Thymus Lappen wurden bestrahlt und 48 h mit 500 E13 TSP oder 500 E18 TSP aus CD45.1 Embryonen besiedelt.. CD3 - / - Mäuse wurden mit 4 Thymus Keulen entweder E13 oder E18 FDA kolonisiert gepfropft. Peripheres Blut wurde in wöchentlichen Abständen gesammelt und durch FACS für do analysiertnoch (CD45.1) CD3 + T-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Schritt 1 | Paarung Mäuse E18 Embryonen (Tag -21) zu erhalten; Paarung Mäuse E14 Embryonen (Tag -17) zu erhalten; Paarung Mäuse E13 Embryonen zu erhalten (Tag -16) | ||
| Schritt 2a | Dissection der Embryonen, Tag -2 | ||
| Schritt 2 b | Die Bestrahlung von E14 Thymus Lappen, Tag -2 | ||
| Schritt 2 c | Vorbereitung, Färbung und Sortieren von Zellen von E13 und E18 Thymus Lappen, Tag -2 | ||
| Schritt 2d | Hängenden Tropfen Kultur, Tag -2 | ||
| Schritt 3a | Fetal Thymic Orgel Kultur, Tag 0 | ||
| Schritt 3b | Graft unter die Nierenkapsel, Tag 0 | Schritt 4 | FTOC: Durchflusszytometrie, Tag 12 |
| Schritt 5 | Graft: wöchentlich Durchflusszytometrie-Analyse von zirkulierenden T-Zellen, Tagen 15, 22, 35 |
Tabelle 1:. Das 5-Schritt-Verfahren in der Versuchszeit-Tabelle des Experiments aus der Paarung der verschiedenen Mausstämme bis zur Analyse der gepfropften Mäusen verfolgt. Transplantate werden in 7 Wochen alten Mäusen durchgeführt. Sich die Zeit der Transplantation als Tag 0, Tag -21 ist die Paarung von Mäusen, E18-Embryonen erhalten, Tag -17 bis E14 Embryonen erhalten, Tag -16 bis E13 Embryonen zu erhalten, und in Tag -2 die Sortierung von E13 und E18 TSP Bestrahlung des Thymus Keule und hängenden Tropfen-Technik.
| Antikörper | Clone Anzahl | Antikörper | Clone Anzahl | |
| CD25 | 7D4 | CD19 | 6D5 | |
| CD44 | IM7 | Ter 119 | TER-119 | |
| CD24 | M1 / 69 | NK1.1 | PK 136 | |
| CD117 | 2B8 | CD11c | HL3 | |
| CD3 | 145-2C11 | Gr1 | RB6-8C5 | |
| CD4 | RM4-5 | GD | eBioGL3 | |
| CD8 | 53-6,7 | Sca-1 | D7 | |
| CD135 | A2F10 | CD45.2 | 104 | |
| CD127 | A7R34 | Ly5.1 | A20 |
Tabelle 2: Antikörper und Klon-Nummern.
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Discussion
Zwei Assays können verwendet werden, um T-Zell-Differenzierung ex vivo zu analysieren. Die zuletzt gemeldet ist die Co-Kultur von hämatopoetischen Vorläuferzellen mit BM-Stromazellen, OP9, Expression der Liganden der Noth1, delta wie 1 oder 4 12. Das 2-D-Assay ist leicht durchzuführen, sehr leistungsfähig und empfindlich, so dass bei Analyse Einzelzellebene. Es wird jedoch weder unterstützt T-Zell-Entwicklung über die Stufe der DP noch die Erzeugung von γδ DETC 13, die beide eine direkte Interaktion mit dem Thymusepithel.
FTOCs seit langem verwendet, um T-Zell-Entwicklung 3 analysieren. Die große Stärke dieses Assays wird so die Erzeugung von allen reifen T-Zellen-Fächer, eine Eigenschaft, durch die effiziente 3-D-Wechselwirkungen von Thymozyten mit dem Thymusepithel gewährt. Wir testeten hier zwei Methoden, die derzeit zur endogenen Thymozyten somit eine effiziente Besiedlung durch exogenen Vorläuferzellen zum Abbau. Sowohl ionisierender Strahlung und Desoxyguanosin Behandlung effizient erschöpft Entwicklung Thymozyten. Jedoch entsteht nur bestrahlten Thymus Keulen eine robuste T-Zell-Entwicklung für längere Zeit darauf hindeutet, dass d-Gua Behandlung könnte auch Komponenten des epithelialen Fach beeinflussen. Embryonale Thymus Lappen wurden von exogenen Vorläuferzellen unter Verwendung des "hängenden Tropfen" Verfahren besiedelt. Colonization von bestrahlten Keulen mit beiden Bevölkerungsgruppen in den Wettbewerb ermöglicht Erfassung verschiedener Zell autonomen biologischen Eigenschaften. Colonization mit nur einer der Teilmengen TSP enthüllt ihre Differenzierungsfähigkeit in einem nicht-kompetitiven Umfeld.
Der Nachteil dieser Methode ist eine geringere Effizienz in der Frequenz der TSP, die in T-Zellen zu entwickeln, verglichen mit OP9Dl Kokulturen 14. Jedoch haben wir einzelne DN1 oder DN2-Zellen durchgeführt, um einzelne Thymus Keulen mit Effizienz näher an den Stromazellen erhalten kolonisieren. Eine zehnfache Reduction in der Effizienz der T-Zell-Produktion festgestellt wird, wenn FL oder BM hämatopoetische Vorläufer für die FTOC die nicht in der OP9 delta dergleichen Kulturen beobachtet verwendet. Diese weniger effiziente Entwicklung deutet darauf hin, dass nicht alle BM oder FL-Zellen mit T-Zell-Potential können die Thymus besiedeln.
Pfropfen kolonisiert Thymus Lappen bietet eine bessere Nährstoff- und Sauerstoffversorgung in Entwicklungs Thymi als in FTOC, und die Möglichkeit, das Schicksal der Nachkommen von TSP folgen, in vivo. Unter Verwendung dieser beiden kombinierte Strategien könnten wir die Schritte der Differenzierung und funktionelle Potential der Nachkommenschaft der FDA zu beschreiben. Da CD3 - / - Mäusen CD45.2 15, die reife T-Zellen entwickeln können, wurden als Gastgeber gemeinsam mit den CD45 allotypische Unterschiede verwendet, wir könnten, eindeutig folgen Sie den neu generierten T-Zellen in ihrer natürlichen Umgebung
Die neuen Aspekte der hier beschriebenen experimentellen Verfahrensweise ist die Kombination von rekonstituierten FTOCmit in vivo-Transplantation. Dies ermöglichte die Identifizierung und Rückverfolgung der Nachkommen von definierten Teilmengen von hämatopoetischen Vorläuferzellen. Wir fanden, dass TSP aus den ersten und zweiten Wellen zu erzeugen unterschiedliche Untergruppen von γδT Zellen können unterschiedliche Anzahlen von αβT Zellen und unterschiedliche Kinetik der Differenzierung.
Stadium der Embryonen: Tag 0 wird 18 Stunden nach der Paarung der Mäuse betrachtet, gemäß dem Plug-Detektion. Dissektionen der Thymi erfordert ein gutes Kaltlicht 150 W, ein Fernglas Dissektionsmikroskop und einige Übung für Dissektionen, Anästhesie und Transplantatverfahren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Unterstützt durch das Institut Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant Lymphopoese '), der REVIVE Zukunftsinvestitionsprogramm und "La Ligue contre le Cancer".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility actions |
| Ketamine 100 mg/ml (stock solution) | MERIAL | Anesthesic | |
| Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution | AXIENCE | Morphinic analgesic | |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | Eye protection | |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fetal calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2-Mercaptoethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine iris scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| 2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1x270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
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- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
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- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
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