Introduction
微生物是无处不在，发挥在地球的生物地球化学循环1重要作用。目前，可用于表征微生物群落结构和功能众多的分子生物学方法。最常见的是16S rRNA基因的序列分析PCR扩增从环境的DNA 2 - 4。的16S rRNA基因分析的缺点在于，它仅提供了有关系统发育特征和社区结构信息，具有信息很少代谢功能。与此相反，方法，如宏基因组学，metatranscriptomics和metaproteomics提供群落结构和新陈代谢的信息。宏基因组学，或生物体的集合体的基因含量的分析，提供了有关社区5的结构和功能的潜在的信息- 8。虽然功能强大，该功能的潜在可能与代谢生物体的活动。一个生物体的基因型是由它的基因，其每一个可以被转录为RNA和进一步翻译为蛋白质，从而导致表型来表示。因此，为了在微生物的功能活性的理解有助于在一个环境，后基因组分析应进行9。因为它揭示了哪些基因被转录，在任何给定的环境Metatranscriptomics，或RNA转录物的分析是有用的。然而，mRNA水平并不总是与它们相应的蛋白质水平由于翻译调控，核糖核酸半衰期，并且可以为每10 mRNA的生成的多个蛋白副本的事实。
由于这些原因metaproteomics现已被公认为对环境微生物学的重要工具。常见metaproteomic分析用散弹枪蛋白质组学的方法，其中的蛋白质在复杂样品的近满装被纯化，并同时进行分析，通常是通过连接zymatic消化成肽和分析质谱仪。随后的串联质谱（MS / MS）“肽指纹识别”用于确定肽序列和原籍潜在蛋白由蛋白质数据库中搜索（综述见11）。蛋白质组的工作已经走过了漫长的道路，在过去25年由于增加的基因组数据的可用性和增加灵敏度和质谱仪，可用于高通量蛋白质鉴定和定量11,12的准确性。因为蛋白质是基因表达的终产物，metaproteomic数据可以帮助确定哪些生物体是活性，在任何给定的环境，什么蛋白他们表达。试图确定一组特定的环境变量会影响生物或社区的表型时，这是有利的。在早期，在海洋中的MS / MS基于metaproteomic研究中使用，以确定在目标特异性蛋白微生物谱系，与第一项研究聚焦在光驱动质子泵遗传工程中SAR11海洋细菌13。最近，比较metaproteomic分析已经阐明复杂的群体之间的差异蛋白质表达谱。例子包括代谢时间的变化在沿海西北大西洋14或南极半岛5的识别 。其他的研究已经在蛋白表达模式描述的变化跨越空间尺度，例如，沿一个地理断面从一个低营养海洋环流到高生产力的沿海上升流系统 15。对于metaproteomics进一步审查建议施奈德等人（2010）9和威廉姆斯等人 （2014）16。目标蛋白质组也已应用在近几年来量化在环境17,18特定的代谢途径的表达。
疗法e为在metaproteomic分析三个主要阶段。第一阶段是样品制备，其包括样品收集，细胞裂解和蛋白的浓度。海洋微生物学样品收集往往造成工作海水的过滤通过一个预过滤器，以去除较大的真核细胞，颗粒和微粒相关的细菌，然后进行过滤的游离活的微生物细胞的捕获，一般与使用0.22μm的盒的过滤单元19,20。这些过滤器incased在一个塑料缸和细胞裂解和蛋白提取协议，可以在过滤器单元内执行将是有价值的工具。一旦获得生物量，将细胞必须被裂解，以允许蛋白质提取。几种方法可以采用，包括盐酸胍裂解21和十二烷基硫酸钠（SDS）基裂解的方法。尽管像SDS洗涤剂非常有效地破坏细胞膜和溶解许多蛋白质种类，concentratiONS低至0.1％，可与下游的蛋白质的消化和质谱分析22干扰。主要关注的是SDS对胰蛋白酶消化效率的负面影响，解决的反相液相色谱法和离子抑制或堆积在离子源23中的电力。
第二阶段是分馏和分析，其中将蛋白进行酶消化，随后通过LC MS / MS分析，结果，可用于确定初始胰蛋白酶肽的一级氨基酸序列上午/ Z裂解谱。各种消化方法可根据所用洗涤剂的类型，以及下游质谱工作流来执行。在我们的协议，1-D PAGE电泳随后从凝胶去除SDS的被利用，以除去任何污染的洗涤剂。蛋白质，是难以溶解，如膜蛋白的分析，需要使用高concen的SDS或其他洗涤剂trations。这导致带SDS-凝胶电泳兼容性问题。如果研究的目标需要的这些坚硬的溶解以溶解的蛋白质，管-凝胶系统可以用来22,24。管 - 凝胶法结合了凝胶基质内的蛋白质，而无需使用电泳的。随后用于溶解任何洗涤剂蛋白质消化之前被除去。
第三个阶段是生物信息学分析。在这个阶段，MS / MS的肽数据被搜索对翻译的核苷酸序列的数据库，以确定哪些肽和蛋白质都存在于样品中。肽的识别取决于其搜索对数据库。海洋metaproteomic数据针对由参考基因组，宏基因组的数据，如全球海洋采样数据集25，以及从未开垦利单细胞扩增的基因组数据库搜索的结果通常neages 26,27。蛋白质鉴定也可以从同一个样品增加通过包含宏基因组序列作为metaproteomic数据推导5。
在这里，我们提供了一个协议，用于通过过滤收集并存储在一个稳定的RNA溶液的肽适用于MS / MS为基础的分析从微生物生物质的产生。这里所描述的协议允许DNA和蛋白质也可以从相同的样品，使所有的步骤导致到蛋白质和DNA沉淀是相同的分离。从实践的角度，需要更少的过滤，因为只有一个过滤器所需的蛋白质和DNA提取。我们还要承认，该协议是通过两个先前公布的协议相结合，改编和修改创建。细胞溶解步骤适于从齐藤等人 （2011）28和在凝胶胰蛋白酶消化成分适于从ShevcheNKO等。 （2007年）29。
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Protocol
1.准备试剂
- 制备的SDS-萃取溶液：0.1M的Tris-HCl pH为7.5，5％甘油，10mM EDTA的和1％SDS。过滤消毒使用0.22微米的过滤器，并储存在4℃。
- 备所需的聚丙烯酰胺凝胶的库存试剂。
- 准备1.5米的Tris-HCl pH值8.8。过滤消毒使用0.22微米的过滤器，并在室温下储存。
- 的0.5M的Tris-HCl pH 6.8的。过滤消毒使用0.22微米的过滤器，并在室温下储存。
- 准备10％SDS。过滤消毒使用0.22微米的过滤器，并在室温下储存。
- 需要准备在凝胶胰蛋白酶消化和肽的提取解决方案。
- 制备100mM碳酸氢铵。过滤消毒使用0.22微米的过滤器，并储存在4℃。
- 准备1 M DTT股票。在-80℃下悬浮于100mM碳酸氢铵和存储。
- 准备550毫米碘乙酰胺的股票。悬浮在100mM碳酸氢铵和储存在-80℃。
- 准备100毫微克/微升胰蛋白酶的股票。分装60微升到的1.5 ml离心管中，并储存在-80℃。
- 制备提取溶液：1％甲酸，2％乙腈。
- 制备悬浮液：5％乙腈和0.1％甲酸。
2.执行细胞裂解插装过滤单元与单元格保存在RNA稳定的解决方案
- 排出从盒滤波器单元（1.5毫升）并进入使用60毫升注射器附接在过滤器的路厄氏锁端2ml微量离心管中的RNA的稳定溶液。
- 离心2 ml离心管10分钟，在17000×g离心以沉淀任何细胞碎片。这样做是使得在步骤2.3的过滤器不堵塞。
- 转移上清液至10 K时超离心过滤器单元以捕获任何蛋白质从细胞中始发，从冻结/ THA已经裂解W精品样品。不要弃沉淀。它将在步骤2.5中使用。在3270×g离心30分钟，或直到体积进行超离心过滤装置的离心分离降低至约600微升。
- 熔化P10尖端的尖端和与尖端的开口端阻塞筒式过滤器单元的非鲁尔锁边。这将确保没有提取缓冲液和生物质在步骤2.5-2.7逸出。
- 暂停沉淀在1毫升SDS-提取解决方案，并吸取其插入原装墨盒过滤装置。以吸管进筒式过滤器单元的最简单方法是叠加P200的尖端到P1000的提示，并用这双尖移液。
- 加入1毫升的SDS提取溶液的筒式过滤器单元，以便总体积是约2ml孵育在室温下10分钟，同时在一个杂交炉旋转。放置3皱实验室湿巾在50ml锥形管的底部。封口膜筒式过滤器单元的封闭两端并把滤芯过滤单元进50毫升管。盖上盖子，把试管放入杂交炉。
- 10分钟后，代替STERIVEX筛选泡沫浮子和用5毫升注射器的鲁尔锁端将其固定在适当位置。 Float和孵育在95℃水浴15分钟。
- 让暗盒滤波器单元凉爽并旋转在室温下进行1小时（如在步骤2.6）。
- 驱逐SDS提取溶液/细胞裂解物从过滤器与一个60毫升注射器到相同的超离心过滤器单元如前（步骤2.3）。加入1毫升新鲜SDS提取溶液到盒过滤器单元，并用手混合30秒钟，然后使用60毫升注射器的驱逐进入超离心过滤器单元。这是为了冲洗筒式过滤器单元，以确保所有的蛋白质已被除去。
- 该超离心过滤单元上，在3270×g离心，或直到在过滤器单元中的体积进行离心45分钟，小于600微升。
- 弃流过加满油的超离心过滤装置用新鲜的SDS萃取液。
- 离心过滤器单元，用于在3270×g下另外45分钟。
- 重复步骤2.11和2.12两次。确保在超离心过滤单元中的最终体积为至多600微升在最后的旋转的末端。
- 在这一点上，一分为二的浓缩物。一小部分将被用于DNA沉淀，另一个用于蛋白质沉淀。
注意：分馏量取决于生物质的过滤的量和产品的预定用途。在我们的例子中，我们拆分精矿对DNA沉淀10％，对蛋白质沉淀的90％。
3.蛋白沉淀
- 添加4体积的甲醇：丙酮（50:50），以浓缩物和涡流一体积为10秒。孵育过夜，在-20℃下。
- 降速在17000 XG 30分钟。倒出上清液并让沉淀（可以是不可见的）的干燥在speedvac中1小时（或直到干）。
注意：不要过度干燥沉淀，因为这可能使其难以悬浮。 - 暂停在25微升的SDS-萃取溶液沉淀。让我们坐1小时，然后通过上下吹打重悬。
- 使用蛋白质检测试剂盒和制造商的说明定量蛋白质。
4. DNA沉淀
- 加入SDS-提取液到浓缩馏分可以用于DNA沉淀，直至500微升标记。这个步骤是简单地增加溶液的体积，使之更易于使用。
- 添加0.583体积的蛋白质沉淀试剂（如MPC的蛋白质沉淀试剂），涡旋10秒。你应该会看到一个白色的沉淀物的形式。
注意：我们也使用苯酚：氯仿提取DNA的方法，但它更困难的，由于低的卷。我们利用获得更好的DNA产量MPC蛋白沉淀试剂。 - 离心机在17000×g离心4℃10分钟。
- 上清转移到另一个的1.5 ml离心管中，加入0.95倍体积的异丙醇。倒置30-40倍。
- 离心机在4℃下10分钟，在最大速度。
- 小心倒出并弃去上清液。
- 用750微升的70％乙醇冲洗两次。
- 除去尽可能多的乙醇可以通过吸液，然后让空气干燥。
注意：不要过度干燥的DNA，因为这可能使其难以悬浮。 - 重悬在25微升的TE低缓冲液，pH 8中（10mM的Tris-HCl，0.1mM的EDTA）中的。
- 量化使用双链DNA测定试剂盒和制造商的说明将DNA。上3微升的DNA进行琼脂糖凝胶（1％）电泳以检查其质量。
蛋白质5. SDS-PAGE凝胶
- 制备样品缓冲液（950微升Laemmli样品缓冲液和50微升β巯基乙醇）。</ LI>
- 添加了15微克蛋白的相应量，或20微升max与样品缓冲液等体积和煮沸4分钟。样品现在可以储存在-80℃直至SDS-PAGE上可以执行。
- 准备用5％丙烯酰胺积层凝胶10％丙烯酰胺分辨凝胶。
- 加载样品和4微升的蛋白质梯的凝胶。运行在恒定的120 V的凝胶，直到250 kDa的阶梯标志刚刚达成的解决凝胶。
- 染色使用根据制造商的说明书基于污渍考马斯凝胶。
6.在凝胶胰蛋白酶消化和肽提取
注：在生物安全柜中进行所有从这里步骤，直到6.10，以减少污染。
- 在10 kDa的阶梯大关每个车道切掉多余的凝胶。每个线将会在MS / MS分别进行分析。切割每个泳道成1mm×1mm的正方形以增加表面面积，并放置所有SQUA水库从车道进入低结合微离心管中。重复此为所有车道。 （1％乙酸可以用来防止凝胶干涸，成为难以切割）。
注意：最小化污染是非常关键的，在这个阶段，所以凝胶切片在上用于制造凝胶的玻璃SDS-PAGE凝胶铸型生物安全柜内进行。 - 去色斑
- 分配50微升100mM碳酸氢铵成每个低结合管，靠近帽孵育在37℃下进行10分钟。
- 免除50微升的乙腈，接近上限，37℃下5分钟。
- 吸并丢弃150微升。
- 重复步骤6.2.1和6.2.2。
- 吸并丢弃95微升。
- 脱水
- 免除50微升乙腈，接近上限，并等待5分钟。吸并丢弃45微升，并等待10分钟。
- 减少
- 免除加入50μlDTT（10mM的，稀释在100mM AMM鎓碳酸氢盐），关闭盖子，等待30分钟，在37℃。
- 烷基化
- 分配50μl的碘乙酰胺（55毫，稀释在100mM碳酸氢铵），靠近帽和等待20分钟，在37℃。
- 免除100微升乙腈，靠近帽和孵化5分钟，在37℃。吸并丢弃195微升。
- 洗刷
- 分配50μl的碳酸氢铵，靠近帽并孵育10分钟，在37℃。
- 免除50微升的乙腈，接近上限，37℃下5分钟。吸并丢弃120微升。
- 脱水
- 免除50微升乙腈，接近上限，并等待5分钟。吸并丢弃45微升。
- 免除50微升乙腈，等待5分钟。
- 吸并丢弃75微升，并等待5分钟。
- 消化
- 免除微升6月25日至三十○号纳克/μL胰蛋白酶（UNTIL所有凝胶碎片覆盖）。关闭帽并等待30分钟，在室温下进行。
- 孵育过夜（4.5小时最小值），在37℃。
- 让在室温下坐30分钟。
- 提取和肽转移
- 免除30微升的提取液，盖上盖子，在冰上30分钟。
- 吸取30微升，并分配一个新的标记低结合管吸气量。
- 分配12微升提取液和12微升乙腈成原管（凝胶）。关闭盖子，并培育在冰上30分钟。
- 吸取15微升并存入新的管。
- 重复步骤（6.9.3和6.9.4）。
- 将新管在SpeedVac中待干。
- 重悬在50μl再悬浮溶液。涡流的培养基上10分钟以悬浮。
- 吸管肽溶液进入任一纳米/ LC小瓶或96孔板适于纳米/ LCMS / MS的工作。
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Representative Results
作为示范，我们进行从表面和叶绿素最大的近海在加拿大北部收集2海水样品的协议。在海上，6-7大号海水通过一个3微米的GF / D预滤器被传递，然后下面的沃尔什等人 20的协议的微生物细胞被收集到0.22微米的筒式过滤器单元。细胞立即储存在RNA稳定溶液直至进一步处理。在返回到实验室，我们执行的协议，因为它是这里提出。将浓缩的细胞裂解物分成;蛋白从90％的体积的沉淀，而DNA从该卷的剩余的10％的沉淀。我们回收24-26微克蛋白质和250-308纳克来自这些样品的高质量DNA（ 图1）。后的凝胶内胰蛋白酶消化和肽提取，我们使用纳米液相色谱联接到轨道阱利进行的肽的MS / MS分析德质谱仪（的Thermo Fisher Scientific，Waltham的，MA，USA）。从肽，我们产生每个样品23000 MS / MS谱。多肽和蛋白质，然后确定使用的峰生物信息学工具（BSI，滑铁卢，ON，加拿大）搜索这些光谱根据自定义的内部序列数据库。该数据库是由来自海洋的参考基因组和宏基因组预测的蛋白质。所述搜索结果是大约1000的肽和蛋白质700-800每个样品的鉴定。自然地，这些结果是依赖于微生物细胞丰度，MS仪器，和蛋白质搜索数据库和算法。然而，这些结果表明，该协议具有以产生适于识别所述环境数百蛋白质的充足胰蛋白酶肽的潜力。此外，由于宏基因组文库可以从少100纳克的DNA 30的构成，该协议也有可能提供足够量的DNA生成匹配的宏基因组-metaproteomic数据集。
使用经BLASTp和MEGAN（宏基因组分析仪）软件包31,32的组合metaproteomes分类学和功能组成进行分析 （图2）。分配给阿尔法变形菌蛋白是最高度数据集中代表，其中绝大多数被分配到SAR11分支。 阿尔法变形菌的Rhododobacterales分支也被高度代表和地表水最常提到。分配给拟杆菌蛋白质被均匀地分布在表面和叶绿素最大值之间，但黄杆菌蛋白质被鉴定为一个更大程度的叶绿素最大。 伽玛proteobacterial蛋白均匀地分布在整个水柱而β-proteobacterial蛋白在表面主要是发现。离功能的角度看，大范围的代谢途径进行了鉴定。这些代谢途径垂直结构是明显的。例如，与氨基酸代谢，碳水化合物代谢和原核碳固定途径相关的蛋白质被鉴定主要是在表面上，和氮代谢的混合物在表面发现只。光合固碳的蛋白质，观察主要是在叶绿素最高，而参与光合作用的蛋白质进行鉴定均匀的表面和叶绿素最大值之间。这些结果表明，可以用这里介绍的协议可以检测各种各样的从微生物类群的多样性的蛋白质。
图1：来自2深度在北极站基因组DNA S633的第一车道包含4微升1 kb的DNA升的加法器，道2含有3微升从S633_2米基因组DNA提取，泳道3包含3微升基因组DNA提取方法对S633_20 M和泳道4-6含有0.5微升（85毫微克），2微升（333毫微克）和4微升（ 667纳克）的Hind III消化的λDNA。
图2：采用MEGAN 2深度在北极站S633北极站633面和叶绿素最大水域分类多样性比较（ 一）分类和功能分析创建的。使用MEGAN兑KEGG数据库查询创建（B）北极站633面和叶绿素最大水域功能多样性比较。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
样品保存的关键是metaproteomic研究和以往的研究显示一种RNA稳定的解决方案是之前的蛋白质提取28存储单元一个有用的存储缓冲器。理想情况下，样品将在原地保留处理33,34中否定蛋白表达变化。事实上，原位采样和固定技术已经发展，其允许自主收集和保存的样品的由船部署仪器。但是，获得这些技术并不总是可行的。在于它是不常见的情况下，样品应尽快采集后保存下来。
在这里，我们提出了一个协议用于从收集在一个筒式过滤器单元，这就是通常在水生微生物学中使用的RNA的稳定保存的溶液细胞中提取的蛋白质。该协议包括细胞溶解使用的SDS-裂解溶液和加热，随后是公关使用超离心过滤装置，作为一个必要的脱盐步骤一倍otein浓缩步骤。必须指出的是，浓缩和脱盐步骤不能被忽视。我们发现，至少三缓冲液交换步骤中需要进行脱盐我们的浓缩物。由于RNA的稳定溶液的高盐浓度，如果适当的脱盐不发生，太多的盐将在过夜蛋白质沉淀步骤和脱盐和沉淀步骤将不得不重复沉淀。此外，如果淡化不正确执行1D-PAGE将无法正常工作和样品将丢失。
接着，将浓缩的溶胞产物被划分使两个蛋白沉淀和DNA沉淀可以执行。因为它往往是可取的宏基因组和metaproteomic数据被从同一样品中产生，这是很有用的。如果一个蛋白未在蛋白质序列数据库表示接着该肽将不被识别。包括从同一样品的基因组的数据作为蛋白质组数据减少不能够识别的蛋白质的风险，因为它没有从数据库。
虽然该协议被用于与筒式过滤单元使用优化和验证工作在近海的微生物群落，它可以适用于与其他类型的环境样品和过滤器的使用。然而，应该清楚地指出，本协议的成功依赖于起始生物质的足够量。因此，在水生生态系统，其中生物质可能非常低，我们建议增加水过滤相应的体积。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2 ml ROBO vial 9 mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
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