Introduction
Mikroorganismer er allestedsnærværende og spille viktige roller i jordens biogeokjemiske sykluser 1. For tiden er det mange molekylære metoder som er tilgjengelige for å karakterisere mikrobiell samfunnsstruktur og funksjon. Mest vanlig er analysen av 16S rRNA gensekvensene fra PCR-amplifisert DNA fra miljø 2 - 4. En ulempe med 16S rRNA-genet analysen er at den bare gir informasjon om fylogenetisk identitet og samfunnsstruktur, med lite informasjon om metabolsk funksjon. I kontrast, tilnærminger som metagenomikk, metatranscriptomics og metaproteomics gi informasjon om samfunnsstruktur og metabolisme. Metagenomikk, eller analyse av genet innholdet av en samling av organismer, gir informasjon om strukturen og funksjonelle potensialet i samfunnet 5-8. Selv kraftig, kan dette funksjonelle potensialet ikke samsvarer med den metabolskeaktiviteter av organismer. En organismes genotype er representert ved sine gener, som hver kan bli transkribert til RNA og ytterligere oversatt til protein, noe som resulterer i en fenotype. Derfor, for å hjelpe til i forståelsen av mikrobiell funksjonell aktivitet i et miljø, bør post-genomisk analyse bli utført ni. Metatranscriptomics, eller analyse av RNA-transkripter er nyttig fordi den avslører hvilke gener som er transkribert i et gitt miljø. Men ikke mRNA nivåer ikke alltid samsvarer med deres tilsvarende proteinnivåer på grunn av translasjonsforskning regulering, RNA halveringstid, og det faktum at flere protein kopier kan genereres for hver mRNA 10.
Av disse grunner metaproteomics er nå anerkjent som et viktig verktøy for miljømikrobiologi. Felles metaproteomic analyserer bruke en hagle proteomikk tilnærming hvor nær full bemanning av proteiner i en kompleks prøve er renset og analysert samtidig, vanligvis gjennom enzymatic fordøyelse inn peptider og analyse på et massespektrometer. Etterfølgende tandem massespektrometri (MS / MS) "peptid fingerprinting" er brukt for å bestemme den peptidsekvens og potensielle protein er utstedt av protein databasesøk (for en oversikt se 11). Proteomikk arbeidet har kommet langt de siste 25 årene takket være økningen i genomisk data tilgjengelighet og økningen i følsomhet og nøyaktighet massespektrometre slik at for høy gjennomstrømming protein identifisering og kvantifisering 11,12. Ettersom proteiner er sluttproduktet av genekspresjon, kan metaproteomic dataene bidra til å bestemme hvilke organismer som er aktive i et gitt miljø, og hvilke proteiner de uttrykker. Dette er fordelaktig når man prøver å finne ut hvordan et bestemt sett av miljømessige variabler vil påvirke fenotypen av en organisme eller gruppe. Tidlig på, ble MS / MS-baserte metaproteomic studier i havet brukes til å identifisere spesifikke proteiner i målrettetmikrobielle slektsnavn, med den første studien fokuserer på lyset drevet protonpumpe proteorhodopsin i SAR11 marine bakterier 13. Mer nylig har komparative metaproteomic analyser belyst differensial protein uttrykk mønstre mellom komplekse samfunn. Eksempler inkluderer identifisering av tidsmessige endringer i stoffskiftet i kystNorthWest Atlantic Ocean 14 eller den antarktiske halvøya 5. Andre studier har beskrevet variasjoner i protein uttrykk mønstre på tvers av romlige skalaer, for eksempel langs en geografisk transekt fra en lav-næringsstoff havet gyre til en svært produktiv kyst oppstrømning system 15. For ytterligere vurderinger av metaproteomics anbefaler vi Schneider et al. (2010) 9 og Williams et al. (2014) 16. Målrettede proteomikk har også vært ansatt de siste årene for å kvantifisere uttrykket av spesifikke metabolske veier i miljøet 17,18.
There er tre hovedfaser i metaproteomic analyse. Den første fasen er prøvepreparering, som omfatter prøvetaking, cellelysering og konsentrasjon av protein. Prøvetaking på marin mikrobiologi medfører ofte filtrering av sjøvann gjennom et forfilter for å fjerne større eukaryote celler, partikler og partikkelassosiert bakterier, fulgt av filtrering for fangst av frie levende mikrobielle celler, vanligvis ved anvendelse av et 0,22 um patron filterenheten 19,20. Disse filtrene incased i en plastsylinder og en cellelyse og utvinning protein protokoll som kan utføres innenfor filterenheten vil være et verdifullt verktøy. Når biomassen er oppnådd, må cellene lyseres for å gi rom for proteinekstraksjon. Flere metoder kan anvendes, inkludert guanidin-HCl lyse 21 og natriumdodecylsulfat (SDS) -baserte lyseringsmetoder. Selv vaskemidler som SDS er svært effektiv på å forstyrre membraner og oppløsende mange proteintyper, concentrations så lavt som 0,1% kan forstyrre nedstrøms protein fordøyelse og MS analyse 22. Av stor bekymring er de negative effektene av SDS på trypsin fordøyelsen effektivitet, oppløsningsevne omvendt fase væskekromatografi og ion undertrykkelse eller opphopning inne i ionekilde 23.
Den andre fasen er fraksjonering og analyse, hvor proteinene blir utsatt for enzymatisk nedbrytning, etterfulgt av LC MS / MS-analyse, noe som resulterer i en m / z fragmenteringsmønster som kan brukes til å fastslå den primære aminosyresekvens av den innledende tryptiske peptid. Ulike fordøyelsen metoder kan utføres avhengig av hvilke typer rengjøringsmidler som brukes, samt nedstrøms massespektrometri arbeidsflyt. I protokollen, er en D-PAGE-elektroforese etterfulgt av fjerning av SDS fra gelen anvendt for å fjerne eventuell forurensning vaskemiddel. Analysen av proteiner som er vanskelige å oppløseliggjøre, slik som membranproteiner, krever bruk av høye konsensentrasjoner av SDS eller andre vaskemidler. Dette fører til kompatibilitetsproblemer med SDS-gel elektroforese. Dersom formålet med en studie krever oppløseliggjøring av disse vanskelig for å oppløse proteinene, kan rør-gelsystemet brukes 22,24. Røret-gel metode omfatter proteiner i gelmatriksen uten bruk av elektroforese. Deretter noen rengjøringsmidler som brukes for oppløsning er fjernet før protein fordøyelse.
Den tredje fasen er det bioinformatisk analyse. I denne fasen MS / MS-peptid-data er søkt mot en database med oversatte nukleotidsekvenser for å bestemme hvilke peptider og proteiner er til stede i prøven. Identifiseringen av peptidene er avhengig av den database den er søkt mot. Marine metaproteomic data blir ofte søkte mot databaser som består av referanse genomer, metagenomic data som Global Ocean Sampling datasett 25, samt encellete forsterket genom fra udyrket lineages 26,27. Protein identifikasjon kan også økes ved å inkludere metagenomic sekvenser fra den samme prøven som metaproteomic data ble utledet 5.
Her gir vi en protokoll for generering av peptider som er egnet for MS / MS-analyse basert fra mikrobiell biomasse som samles ved filtrering og lagret i en RNA stabilisering løsning. Protokollen er beskrevet her gjør det mulig for DNA og protein kan isoleres fra den samme prøven, slik at alle trinn som fører opp til protein og DNA-utfellinger er identiske. Fra et praktisk perspektiv, er mindre filtrering nødvendig siden bare ett filter er nødvendig for både protein og DNA-ekstraksjon. Vi ønsker også å erkjenne at denne protokollen ble skapt gjennom kombinasjonen, tilpasning og ombygging av to tidligere publiserte protokoller. De cellelysetrinn er tilpasset fra Saito et al. (2011) 28, og den i-gel trypsin fordøye komponent er tilpasset fra ShevcheNKO et al. (2007) 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered Reagenser
- Forbered SDS-utvinning løsning: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% glycerol, 10 mM EDTA og 1% SDS. Filter-sterilisere ved hjelp av en 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C.
- Forbered lager reagenser som er nødvendig for polyakrylamidgel.
- Forbered 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-sterilisere ved hjelp av en 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved romtemperatur.
- 0,5 M Tris-HCl pH 6,8. Filter-sterilisere ved hjelp av en 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved romtemperatur.
- Forbered 10% SDS. Filter sterilisere bruker en 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved romtemperatur.
- Forbered løsninger som trengs for i-gel trypsin fordøye og peptid utvinning.
- Forbered 100 mM ammoniumbikarbonat. Filter-sterilisere ved hjelp av en 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C.
- Forbered 1 M DTT aksjer. Suspendert i 100 mm ammoniumbikarbonat og oppbevares ved -80 ° C.
- Forbered 550 mm iodoacetamide aksjer. Suspendert i100 mm ammonium bicarbonate og lagre ved -80 ° C.
- Forbered 100 ng / mL trypsin aksjer. Delmengde 60 mL til 1,5 ml mikrosentrifugerør og oppbevares ved -80 ° C.
- Forbered utvinning Løsning: 1% maursyre, 2% acetonitril.
- Forbered resuspendering løsning: 5% acetonitril og 0,1% maursyre.
2. Utfør Cell Lysis i Cartridge Filter Unit med Cells bevart i RNA Stabilization Solution
- Utvise RNA stabilisering oppløsningen fra patronfilterenhet (1,5 ml) og inn i et 2 ml mikrosentrifugerør ved anvendelse av en 60 ml sprøyte festet til luer ende av filteret.
- Sentrifuger 2 ml mikrosentrifugerør i 10 minutter ved 17.000 xg for å pelletisere en hvilken som helst cellerester. Dette er gjort slik at filteret i trinn 2.3 ikke tetter.
- Overfør supernatanten til et 10 K ultracentrifugal filterenhet for å fange opp eventuelle proteiner som stammer fra celler som har lysert fra fryse / thavekt av prøven. Ikke kast pelleten. Den vil bli brukt i trinn 2,5. Utfør sentrifugering av ultracentrifugal filterenheten ved 3270 xg i 30 minutter eller inntil volumet er redusert til ca 600 mL.
- Smelt spissen av en p10 spiss og blokkere den ikke luer-lock side av patronen filterenheten med den åpne enden av spissen. Dette vil sikre at ingen utvinning buffer og biomasse unnslipper under punkt 2,5-2,7.
- Suspendere pellet i 1 ml SDS-utvinning løsning og pipette det i den opprinnelige patronen filterenheten. Den enkleste måten å pipettere i patronen filterenheten er å stable en P200 tips på en P1000 tips og bruke denne doble tip for pipettering.
- Tilsett 1 ml av SDS ekstraksjon løsning på patronfilterenheten slik at det totale volum er ca. 2 ml og inkuberes i 10 minutter ved romtemperatur mens den roterer i en ovn hybridisering. Plasser 3 krøllet lab tørker på bunnen av en 50 ml konisk rør. Parafilm begge ender av patronfilterenheten lukketog setter kassetten filterenheten inn i 50 ml tube. Lukk lokket og sette røret inn i hybridisering ovnen.
- Etter 10 min plass på Sterivex filtrere på en skum floater og sikre det på plass med en 5 ml sprøyte på luer-lock slutten. Flyte og inkuberes i et 95 ° C vannbad i 15 min.
- La patronfilterenheten kul og rotere ved romtemperatur i 1 time (som i trinn 2.6).
- Utvise SDS ekstraksjonsløsningen / cellelysat ut av filteret med en 60 ml sprøyte inn i samme ultracentrifugal filterenheten som før (trinn 2.3). Tilsett 1 ml friskt SDS ekstraksjon løsning på patronfilterenhet og bland i 30 sekunder for hånd, og deretter fordrive i det ultracentrifugal filterenheten ved hjelp av 60 ml sprøyte. Dette er for å skylle filterpatron enheten for å sikre at alle proteiner er blitt fjernet.
- Utfør sentrifugering på ultracentrifugal filterenheten i 45 minutter ved 3270 xg eller til volumet i filterenheten er mindre enn 600 mL.
- Forkast gjennomstrømning og topp opp ultracentrifugal filterenheten med fersk SDS-utvinning løsning.
- Sentrifuger filterenheten for en annen 45 minutter ved 3270 x g.
- Gjenta trinn 2.11 og 2.12 ganger mer. Sikre at sluttvolumet i ultracentrifugal filterenheten er høyst 600 ul ved slutten av sentrifugering.
- På dette punkt, deles i to konsentratet. En fraksjon vil bli brukt for DNA utfelling og den andre for proteinutfelling.
Merk: fraksjonering mengde avhenger av mengden av biomasse som ble filtrert og den tiltenkte bruk av produktene. I vårt tilfelle, delt vi konsentrat med 10% mot DNA nedbør og 90% mot protein nedbør.
3. Protein Nedbør
- Tilsett 4 volumer metanol: aceton (50:50) til en volum av konsentrat og virvle i 10 sek. Inkuber over natten ved -20 ° C.
- Spinne ned på 17 000 xg i 30 min. Dekanter supernatantenog la pellet (kan være usynlig) tørr i en speedvac for en time (eller til den er tørr).
Merk: Ikke over tørk pellet da dette kan gjøre det vanskelig å suspendere. - Suspendere pellet i 25 ul av SDS-utvinning løsning. La stå i en time og deretter suspendere ved å pipettere opp og ned.
- Kvantifisere protein ved hjelp av et protein assay kit og produsentens anvisninger.
4. DNA Nedbør
- Legg SDS-ekstraksjon løsning til konsentratet fraksjonen som skal anvendes for DNA-utfelling før 500 ul merket. Dette trinnet er ganske enkelt å øke volumet av løsningen, slik at det er lettere å arbeide med.
- Legg 0.583 volumdeler av en proteinutfelling reagens (slik som MPC proteinutfelling reagens) og virvle i 10 sek. Du skal se en hvit utfelling form.
Merk: Vi har også benyttet fenol: kloroform-ekstraksjon DNA-metoder, men det er mer vanskelig på grunn av de lave volumer. Vi fikk bedre DNA avkastning ved hjelp avMPC Protein Nedbør Reagens. - Sentrifuger ved 17000 xg og 4 ° C i 10 min.
- Overfør supernatanten til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og tilsett 0,95 volumdeler isopropanol. Invertere 30-40 ganger.
- Sentrifuger i 10 minutter ved 4 ° C ved maksimal hastighet.
- Nøye dekanter og kast supernatanten.
- Skyll to ganger med 750 ul 70% etanol.
- Fjern så mye etanol som mulig ved pipettering, så la lufttørke.
Merk: Ikke over tørk DNA da dette kan gjøre det vanskelig å suspendere. - Resuspender i 25 pl lav TE-buffer, pH 8 (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA).
- Kvantifisere DNA ved hjelp av en dsDNA analysesett og produsentens anvisninger. Utføre agarosegel (1%) elektroforese på 3 ul av DNA for å kontrollere kvaliteten.
5. SDS-PAGE gel av Proteiner
- Tilberede prøvebuffer (950 pl Laemmli-prøvebuffer og 50 ul β-merkaptoetanol). </ li>
- Legge til den tilsvarende volum av 15 ug protein, eller et maks på 20 ul til likt volum prøvebuffer og koke i 4 min. Prøvene kan lagres ved -80 ° C inntil SDS-PAGE kan utføres.
- Forbered 10% akrylamid løse gel med en 5% akrylamid stabling gel.
- Installering av gelen med prøver og 4 ul av en protein stige. Kjør gelen ved konstant 120 V til 250 kDa stigen markør har nettopp nådd løse gel.
- Beis gel ved hjelp av en coomassie basert flekken i henhold til produsentens instruksjoner.
6. I-gel Trypsin Digest og Peptide Extraction
Merk: Alle trinn fra her til 6,10 er utført i et biologisk sikkerhetskabinett for å minimere forurensning.
- Skjær av overflødig gel under 10 kDa stigen mark for hvert kjørefelt. Hvert felt vil bli analysert på MS / MS separat. Skjær hver kjørefelt i 1 mm x 1 mm rutene for å øke arealet og plassere alle firres fra kjørefelt i en lav-bindende mikro-sentrifugerør. Gjenta dette for alle baner. (1% eddiksyre kan benyttes for å hindre gelen fra å tørke ut og bli vanskelig å klippe).
Merk: Minimalisering av forurensning er kritisk på dette stadium, slik at gelen kutting utføres i en biologisk sikkerhetskabinett på glasset SDS-PAGE-gel form som benyttes for å gjøre gelen. - De-flekken
- Dispensere 50 ul av 100 mM ammoniumbikarbonat inn i hverandre med lav bindingsrøret, i nærheten av lokket og inkuber ved 37 ° C i 10 min.
- Dispensere 50 ul acetonitril, nær lokket og inkuber ved 37 ° C i 5 min.
- Aspirer og kast 150 ul.
- Gjenta trinn 6.2.1 og 6.2.2.
- Aspirer og kast 95 pl.
- Dehydrering
- Tilsett 50 mL acetonitril, tett lokk og vent 5 min. Aspirer og kast 45 ul og vente 10 min.
- Reduksjon
- Tilsett 50 ul DTT (10 mM, fortynnet i 100 mM ammonium bikarbonat), tett lokk og vente 30 min ved 37 ° C.
- Alkylering
- Fordeles 50 ul jodacetamid (55 mM, fortynnet i 100 mM ammoniumbikarbonat), nær lokket og vente 20 minutter ved 37 ° C.
- Dispensere 100 ul acetonitril, tett lokk og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C. Aspirer og kast 195 mL.
- Vask
- Fordeles 50 ul ammoniumbikarbonat, tett lokk og inkuberes i 10 min ved 37 ° C.
- Dispensere 50 ul acetonitril, nær lokket og inkuber ved 37 ° C i 5 min. Aspirer og kast 120 mL.
- Dehydrering
- Tilsett 50 mL acetonitril, tett lokk og vent 5 min. Aspirer og kast 45 pl.
- Tilsett 50 mL av acetonitril, vent 5 min.
- Aspirer og kast 75 ul og vente 5 min.
- Fordøyelse
- Tilsett 25-30 ul 6 ng / mL Trypsin (until alle gel fragmenter er dekket). Lukk lokket og vent i 30 minutter ved romtemperatur.
- Inkuber over natten (4,5 hr minimum) ved 37 ° C.
- La stå ved romtemperatur i 30 minutter.
- Utvinning og Peptide Transfer
- Tilsett 30 mL av utvinning løsning og dekk med lokk i 30 minutter på isen.
- Aspirer 30 ul og dispensere aspirerte volum i en ny merket med lav bindingsøret.
- Dispensere 12 pl ekstraksjonsoppløsning og 12 ul av acetonitril i det opprinnelige rør (med gel). Lukk lokket og inkuberes i 30 min på is.
- Aspirer 15 mL og innskudd til det nye røret.
- Gjenta trinn (6.9.3 og 6.9.4).
- Plassere nye rør i en speedvac til den er tørr.
- Resuspender i 50 ul av resuspensjon løsning. Vortex på medium i 10 min for å suspendere.
- Pipetter peptid løsningen i enten nano / LC ampuller eller 96-brønners plater som egner seg for nano / LCMS / MS arbeid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en demonstrasjon, utførte vi protokollen på to sjøvannsprøver samlet inn fra overflaten og klorofyll maksimalt kyst havet i Nord-Canada. Til sjøs, ble 6-7 liter sjøvann føres gjennom et 3 mikrometer GF / D forfilter, da mikrobielle celler ble samlet opp på en 0,22 um filterpatron enheten følge protokollen av Walsh et al., 20. Celler ble umiddelbart lagret i en RNA-stabilisering løsning inntil videre behandling. På vei tilbake til laboratoriet, utførte vi protokollen slik den er presentert her. Den konsentrerte cellelysat ble delt; protein ble utfelt fra 90% av volumet, mens DNA ble utfelt fra den gjenværende 10% av volumet. Vi har funnet 24-26 ug protein og 250-308 ng av høy kvalitet DNA fra disse prøvene (figur 1). Etter in-gel trypsin fordøyelse og peptid ekstraksjon, vi utsatt peptidene i MS / MS-analyse ved anvendelse av en nano-LC koplet til Orbitrap Elite massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Fra peptidene, genererte vi enn 23.000 MS / MS-spektra per prøve. Peptider og proteiner ble deretter identifisert ved å søke disse spektra mot en tilpasset in-house sekvens database ved hjelp av toppene bioinformatikk verktøy (BSI, Waterloo, ON, Canada). Databasen var omfattet av predikerte proteiner fra marine referanse genomer og metagenomes. Jakten resulterte i identifisering av rundt 1000 peptider og 700-800 proteiner for hver prøve. Naturligvis, disse resultatene er avhengige av mikrobiell celle overflod, MS instrumentering, og protein søk database og algoritmer. Likevel, disse resultater viser at denne protokollen har potensial til å produsere tilstrekkelige tryptiske peptider som er egnet for å identifisere hundrevis av proteiner i miljøet. Dessuten, siden metagenomic bibliotek kan konstrueres fra så lite som 100 ng av DNA 30, har denne protokollen også mulighet for å tilveiebringe tilstrekkelige mengder av DNAå generere matchet metagenomic-metaproteomic datasett.
Taksonomisk og funksjonelle sammensetning av metaproteomes ble analysert ved bruk av en kombinasjon av BLASTp og MEGAN (Metagenome analysator) programvarepakken 31,32 (Figur 2). Proteiner er tildelt Alpha-Proteobacteria var den mest høyt representert i datasettet, de aller fleste av disse ble tildelt til SAR11 clade. Den Rhododobacterales clade av Alpha-Proteobacteria ble også sterkt representert og identifisert oftest i overflatevann. Proteiner som er tilordnet bacteroidetes var jevnt fordelt mellom overflaten og klorofyll maksimum, men Flavobacteria proteiner ble identifisert i større grad ved klorofyll maksimale. Gamma-proteobacterial proteiner ble jevnt fordelt i hele vannsøylen, mens beta-proteobacterial proteiner ble funnet hovedsakelig i overflaten . Fraet funksjonelt perspektiv, ble en rekke metabolske veier identifisert. Vertikal strukturering av disse metabolske veier var tydelig. For eksempel ble proteiner forbundet med aminosyre metabolisme, karbohydrat-metabolisme og prokaryote karbonfeste pathways identifisert i første rekke ved overflaten, og nitrogenmetabolisme ble funnet utelukkende ved overflaten. Fotokarbonfiksering proteiner ble observert i første rekke på klorofyll maksimale, mens proteiner involvert i fotosyntesen ble identifisert jevnt mellom overflaten og klorofyll maksimum. Disse resultater viser at et stort utvalg av proteiner fra et mangfold av mikrobielle arter kan påvises ved anvendelse av protokollen som presenteres her.
Figur 1:. Genomisk DNA fra 2 dybder på Arctic stasjonen S633 Den første kjørefelt inneholder 4 pl av en 1 kb DNA ladderer, spor 2 inneholder 3 mL av genomisk DNA-ekstraksjon fra S633_2 m, inneholder spor 3 3 ul av genomisk DNA-ekstraksjon fra S633_20 m og baner 4-6 inneholder 0,5 pl (85 ng), 2 pl (333 ng) og 4 mL ( 667 ng) av HindiII fordøyd lambda DNA.
Figur 2:. Taksonomisk og funksjonell analyse av 2 dybder på Arctic stasjonen S633 Taksonomisk mangfold sammenligning av de arktiske stasjonen 633 overflaten og klorofyll maksimum farvann (A) opprettet ved hjelp MEGAN. Funksjonelle mangfold sammenligning av de arktiske stasjonen 633 overflaten og klorofyll maksimum farvann (B) er opprettet ved hjelp MEGAN å spørre mot KEGG databasen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sample bevaring er nøkkelen til metaproteomic studier og tidligere arbeid vist at et RNA stabilisering løsning er en nyttig lagring buffer for lagring av celler før proteinekstraksjon 28. Ideelt sett ville prøvene bli bevart in situ å oppheve endringer i proteinuttrykk under håndtering 33,34. Faktisk, in situ prøvetaking og feste teknologi har blitt utviklet, noe som gir mulighet for den autonome innsamling og bevaring av prøver med skips utplassert instrumenter. Imidlertid er adgang til disse teknologiene ikke alltid gjennomførbart. I det vanlige tilfelle at det ikke er det, må prøvene bevares så snart som mulig etter innsamling.
Her presenterer vi en protokoll for å utvinne protein fra RNA stabiliseringsløsning lagret celler samlet på en patron filter enhet, som vanligvis brukes i akvatisk mikrobiologi. Protokollen omfatter cellelysering ved hjelp av en SDS-lysis-løsning og oppvarming, etterfulgt av en protein konsentrasjon trinn bruker ultracentrifugal filter enheter som doblet som et nødvendig avsalting trinn. Det må bemerkes at de konsentrerer seg og avsaltings trinn ikke kan overses. Vi har funnet at et minimum på tre buffer vekslingstrinn var nødvendig for å avsalte vår konsentrat. På grunn av den høye saltkonsentrasjonen av RNA stabilisering løsning, hvis riktig avsalting ikke forekommer, for mye salt vil bli utfelt i løpet av natten proteinutfelling trinnet og avsalting og utfellingstrinnet vil måtte bli gjentatt. I tillegg, hvis avsalting ikke er riktig utført 1D-PAGE ikke vil fungere og prøvene vil bli tapt.
Deretter ble den konsentrerte lysatet fordelt slik at både proteinutfelling og DNA-utfellingen kan utføres. Dette er nyttig fordi det ofte er ønskelig at metagenomic og metaproteomic data bli generert fra de samme prøvene. Hvis et protein ikke er representert i proteinsekvens-database deretter peptidet vilikke bli identifisert. Inkludert de genomiske data fra den samme prøven som proteomikk data reduserer risikoen for ikke å være i stand til å identifisere et protein på grunn av dens fravær fra databasen.
Selv om denne protokoll ble optimalisert for bruk med patronfilterenhetene og valideres for å arbeide på kyst hav mikrobielle samfunn, kan det tilpasses for bruk med andre typer miljøprøver og filtre. Imidlertid bør det fremgå klart at suksessen til denne protokollen er avhengig av et tilstrekkelig antall starter biomasse. Derfor i akvatiske økosystemer der biomassen kan være svært lav, anbefaler vi å øke volumet av vannet filtreres deretter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2 ml ROBO vial 9 mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
References
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
- Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).
- Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972 (1986).
- Williams, T. J., Long, E., et al. A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters. The ISME journal. 6 (10), (2012).
- Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics. Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).
- Venter, J. C., Remington, K., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).
- Tyson, G. W., Chapman, J., et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 428, 37-43 (2004).
- Schneider, T., Riedel, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities. Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).
- Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology. The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).
- Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al. Proteorhodopsin in the ubiquitous marine bacterium SAR11. Nature. 438 (7064), 82-85 (2005).
- Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton. The ISME journal. , 1-13 (2014).
- Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).
- Williams, T. J., Cavicchioli, R. Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web. Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).
- Saito, M. a, McIlvin, M. R., et al. Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers. Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).
- Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton. Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).
- Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. Methods in enzymology. 531, Elsevier Inc. 305-329 (2013).
- Da Walsh,, Zaikova, E., Hallam, S. J. Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples. Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).
- Thompson, M., Chourey, K. Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples. Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).
- Lu, X., Digestion Zhu, H. Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).
- Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization. Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).
- Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. Genomic and proteomic characterization of "Candidatus Nitrosopelagicus brevis": An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).
- Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS biology. 5 (3), e77 (2007).
- Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean. Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).
- Rinke, C., Schwientek, P., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection. Frontiers in microbiology. 2, 215 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).
- Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. Metagenomics - a guide from sampling to data analysis. Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).
- Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. MEGAN analysis of metagenomic data. Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).
- Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4. Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).
- Ea Ottesen,, Marin, R., et al. Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton. The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).
- Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system. The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).
