Introduction
Mikroorganizmalar her yerde ve Dünya'nın biyokimyasal döngüler 1 temel rol oynamaktadır. Şu anda, mikrobiyal topluluk yapısını ve işlevini tanımlamak için kullanılabilir birçok moleküler yaklaşımlar vardır. 4 - En yaygın 16S rRNA geninin analizi, çevre DNA 2 PCR ile amplifiye dizileri. 16S rRNA gen analizi bir dezavantajı sadece bir metabolik fonksiyonu ile ilgili çok az bilgi, filogenetik kimlik ve toplum yapısı hakkında bilgi temin etmesidir. Metagenomik, metatranscriptomics ve metaproteomics toplum yapısı ve metabolizma hakkında bilgi vermek olarak tersine, bu tür yaklaşımları. 8 - Metagenomiks veya organizmaların bir topluluğu gen içeriğinin analizi, toplum 5 yapısı ve fonksiyonel potansiyeli hakkında bilgi sağlar. Güçlü olmasına rağmen, bu fonksiyonel potansiyeli metabolik uygun olmayabilirorganizmaların faaliyetleri. Bir organizmanın genotipi RNA'ya transkribe ve ayrıca bir fenotipe yol açacak şekilde proteine tercüme edilebilir, her biri kendi gen tarafından temsil edilmektedir. Bu nedenle, bir ortamda mikrop fonksiyonel aktivite anlaşılmasına yardım etmek için, post-genomik analizi 9 yapılmalıdır. Bu, herhangi bir ortamda transkripsiyonu hangi genlerin ortaya için Metatranscriptomics ya da RNA transkriptlerinin analizinin yararlıdır. Ancak, mRNA düzeyleri nedeniyle her zaman öteleme yönetmelik, RNA yarılanma ömrü ve birden çok protein kopyaları her mRNA 10 oluşturulabilir gerçeğini bunlara karşılık gelen protein düzeyleri uyuşmuyor.
Bu nedenlerle metaproteomics için artık çevre mikrobiyolojisi için önemli bir araç olarak kabul edilmektedir. Ortak metaproteomic karmaşık bir numunede proteinlerin yakın tam tamamlayıcı genellikle tr aracılığıyla, saflaştırılmış ve eş zamanlı olarak analiz edilir bir tüfek proteomik yaklaşım kullanır analizleriBir kütle spektrometresi üzerinde peptitler ve analize Enzimatik sindirim. Daha sonra bir tandem kütle spektrometrisi (MS / MS) "peptit parmak izi" arama protein veritabanı tarafından peptid dizisi ve kaynaklı olası protein (Bir inceleme için bakınız 11) belirlemek için kullanılır. Proteomik iş genomik veri kullanılabilirliği artış ve hassasiyet ve yüksek verimli protein tanımlanması ve ölçümü 11,12 sağlayan kitle spektrometre doğruluğu artışa geçmiş 25 yıl sayesinde uzun bir yol kat etti. Proteinler gen ifadesinin nihai ürün olduğundan, metaproteomic veriler herhangi bir ortamda ve hangi proteinler dile getiriyorlar aktif olan organizmalar belirlemenize yardımcı olabilir. Çevresel değişkenler belirli bir dizi bir organizmanın ya da topluluğun fenotip nasıl etkileyeceğini belirlemek için çalışırken bu avantajlıdır. Erken, okyanusta MS / MS-tabanlı metaproteomic çalışmalarda hedeflenen belirli proteinleri belirlemek için kullanıldıSAR11 deniz bakteri 13 ışık tahrik proton pompa proteorhodopsin odaklanan ilk çalışma ile mikrobiyal soy. Daha yakın zamanlarda, karşılaştırmalı analizler metaproteomic karmaşık topluluklar arasındaki fark protein ekspresyonu aydınlatmıştır. Örnekler kıyı Kuzeybatı Atlantik Okyanusu 14 veya Antarktika Yarımadası'nın 5 metabolizmasında zamansal değişimlerin belirlenmesini içermektedir. Diğer çalışmalar son derece verimli kıyı upwelling sistemine 15 düşük besin okyanus gyre bir coğrafi transekt boyunca, örneğin, mekansal ölçekler arasında protein ekspresyonu varyasyonları nitelendirdiler. Metaproteomics daha değerlendirme için biz Schneider vd., (2010), 9 ve Williams ve ark. (2014) 16 önerilir. Hedeflenen proteomiks ayrıca çevre 17,18 belirli metabolik yollar ifadesini ölçmek için son yıllarda istihdam edilmiştir.
Thermetaproteomic analizde üç ana aşamalar e bulunmaktadır. İlk aşama, örnek toplama hücre parçalanması ve protein konsantrasyonu içeren örnek hazırlama vardır. Deniz mikrobiyoloji örnek toplama yaygın haliyle, bir 0.22 mikron kartuş kullanımı ile, serbest yaşayan mikrobiyal hücrelerin yakalanması için, süzme, ardından daha büyük bir ökaryotik hücreler, partikül ve partikül ilişkili bakteriler kaldırmak için bir ön-filtre, geçen deniz filtrasyon gerektirir Filtre ünitesi 19,20. Bu filtreler, plastik bir silindir incased edilmiştir ve filtre birimi içinde yapılabilir, bir hücre parçalama ve protein ekstre protokolü değerli bir araç olabilir. Biyokütle elde edildikten sonra, hücreler, protein ekstraksiyonu sağlamak için lize gerekir. Çeşitli yöntemler guanidin-HCl çözme 21 sodyum dodesil sülfat (SDS) tabanlı parçalama yöntemleri de dahil olmak üzere, kullanılabilir. SDS gibi deterjanlar, dikkat yoğunluğu birçok protein türleri zarları engellemeden ve çözülebilen çok verimli olmasına rağmen% 0.1 aşağı protein sindirimi ve MS analizi 22 ile müdahale gibi düşük ons. Önemli bir endişe iyon kaynağı 23 içindeki ters faz sıvı kromatografisi ve iyon bastırılması veya birikim çözme gücü, tripsin sindirim verimliliği üzerinde SDS olumsuz etkilerdir.
İkinci faz proteinleri, ilk triptik peptid primer amino asit dizisini belirlemek için kullanılabilir am / z parçalanma örnekle sonuçlanan, LC MS / MS analizi ile izlenmiştir enzimatik sindirme tabi tutulur fraksiyonasyon ve analizdir. Çeşitli sindirim yöntemleri kullanılmıştır deterjan tipleri, hem de aşağı doğru kütle spektrometrisi akışı bağlı olarak gerçekleştirilebilir. Protokolde, jelden SDS ile uzaklaştırılarak elde edilmiş 1-D PAGE elektroforez herhangi bir deterjan kontaminasyonu ortadan kaldırmak için kullanılmaktadır. , Membran proteinleri gibi, çözündürülmesi zordur proteinlerin analiz, yüksek konsantre ve kullanımını gerektirirSDS veya diğer deterjan yerel yönetim bu. Bu, SDS-jel elektroforezi ile uyumluluk sorunları yol açar. Bir çalışmanın amacı, proteinleri çözmek için bu zor çözünür hale gerektiriyorsa, tüp jel sistemi, 22,24 kullanılabilir. Tüp jel elektroforezi yöntemi kullanılmadan edilmiş jel matrisi içinde protein içerir. Ardından çözünürlük için kullanılan herhangi bir deterjanlar protein sindirimi önce kaldırılır.
Üçüncü aşama biyoinformatik analizi. Bu aşamada, MS / MS verileri peptid peptidler ve proteinler numunede mevcut olan belirlemek için çevrilen nükleotid dizilerinin bir veri tabanına karşı araştırılmıştır. Peptidler tanımlanması o karşı aranır veritabanı bağlıdır. Deniz metaproteomic veriler genellikle referans genomları, Küresel Okyanus Örnekleme veri kümesi 25 olarak metagenomic veriler yanı sıra ekilmemiş li gelen tek bir hücre amplifiye genomları oluşan veritabanları karşı aranır26,27 neages. Metaproteomic veriler 5 türetilmiş gibi protein tanımlanması aynı örnekten metagenomic dizilerin dahil edilmesi ile artırılabilir.
Burada mikrop biyokütle MS / MS-tabanlı analizi için uygun peptidler, süzme ile toplanmış ve bir RNA stabilizasyonu çözelti içinde depolanan üretimi için bir protokol sağlar. Burada açıklanan protokol DNA ve protein tüm adımları proteine yol açan DNA çökelme aynıdır, böylece aynı numuneden izole edilmesi sağlar. Sadece bir filtre protein ve DNA izolasyonu hem de gerekli olduğundan pratik açıdan bakıldığında, daha az filtrasyon gereklidir. Biz de bu protokol iki önce yayınlanmış protokolleri kombinasyonu, adaptasyon ve modifikasyon yoluyla yaratılmış olduğunu kabul etmek istiyorum. Hücre parçalama adımlar (2011) 28. Saito ve ark uyarlanan ve bileşeni sindirmek in-jel tripsin Shevche uyarlanmıştırNKO ve diğ. (2007) 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reaktifler hazırlayın
- SDS-ekstraksiyon çözeltisi hazırlayın: 0.1 M Tris-HCl pH 7.5, 5% gliserol, 10 mM EDTA ve% 1 SDS. 4 ° C'de 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak Filtre sterilize.
- Poliakrilamid jeli için ihtiyaç duyulan Stok reaktifleri hazırlayın.
- 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 hazırlanır. Oda sıcaklığında 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak Filtre sterilize.
- 0.5 M Tris-HCL pH 6.8. Oda sıcaklığında 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak Filtre sterilize.
- % 10 SDS hazırlayın. Filtre, oda sıcaklığında 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak sterilize edin.
- -Jel tripsin sindirimi ve peptit çıkarılması için gerekli çözümler hazırlayın.
- 100 mM amonyum bikarbonat hazırlayın. 4 ° C'de 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak Filtre sterilize.
- 1 M DTT stokları hazırlayın. -80 ° C de 100 mM amonyum bikarbonat ve mağaza içinde süspansiyona alınmıştır.
- 550 mM iyodoasetamit stokları hazırlayın. Içinde askıda100 mM -80 ° C de amonyum bikarbonat ve saklayın.
- 100 ng hazırlayın / tripsin stokları ul. -80 ° C'de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine 60 ul kısım ve mağaza.
- % 1 formik asit,% 2 asetonitril: ekstraksiyon çözeltisi hazırlayın.
- 5% asetonitril ve% 0.1 formik asit: yeniden süspansiyon haline çözeltisi hazırlayın.
2. RNA İstikrar Çözüm Konserve Hücreleri ile Kartuş Filtre Ünitesinde Hücre Lizis gerçekleştirin
- Kartuş filtre ünitesi (1,5 mi) içinde ve filtrenin luer-lock ucuna monte edilmiş bir 60 ml şırınga kullanılarak bir 2 ml mikrosantrifüj tüpü içine RNA stabilizasyonu çözeltisi boşaltınız.
- Herhangi bir hücre kalıntıları topak haline 17.000 x g'de 10 dakika boyunca 2 ml mikrosantrifüj tüpü santrifüjleyin. Adım 2.3 filtre yapışmasına neden kalmaması bu yapılır.
- Donma / tha parçalanmış olan hücrelerinden kaynaklanan herhangi proteinleri yakalamak için 10 K ultrasentrifugal filtre ünitesine süpernatant aktarınörnek w. Pelet atmayın. Bu adım 2.5 kullanılacaktır. 30 dakika boyunca ya da hacme kadar 3270 x g'de ultrasentrifugal filtre ünitesinin santrifüj uygulayın yaklaşık 600 ul azalttı.
- Bir p10 ucu ucu eritin ve ucu açık ucu ile kartuş filtre ünitesinin olmayan luer-lock tarafını engeller. Bu bir ekstraksiyon tampon ve biyokütle adımlar 2,5-2,7 sırasında kaçar sağlayacaktır.
- 1 ml SDS-ekstraksiyon çözeltisi içinde pelet Askıya ve orijinal kartuş filtre ünitesinin içine pipetle. Kartuş filtre ünitesine pipetle için en kolay yolu P1000 ucuna P200 ucu yığını ve pipetleme için bu çifte uç kullanmaktır.
- Toplam hacim yaklaşık 2 ml olacak şekilde kartuş filtre ünitesine SDS ekstraksiyon çözeltisi 1 ml ilave edilir ve, bir hibridizasyon etüvü içinde dönerken, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. 3 buruşuk laboratuvar 50 ml'lik konik tüp dibinde mendil yerleştirin. Kapalı kartuş filtre ünitesinin iki ucunu parafilmve 50 ml tüp içine kartuş filtre ünitesi koydu. Kapağı kapatın ve melezleme fırına tüp koymak.
- 10 dakika sonra yere Sterivex bir köpük şamandıra filtre ve luer-lock ucunda 5 ml şırınga ile yerine sabitleyin. Float ve 15 dakika için 95 ° C su banyosu içinde inkübe edilir.
- Serin kartuş filtre ünitesini Let (adım 2.6 olduğu gibi), 1 saat boyunca oda sıcaklığında döner.
- (Adım 2.3) önceki ile aynı ultrasentrifugal filtre ünitesine 60 ml'lik şırınga ile filtre üzerinden SDS ekstraksiyon çözeltisi / hücre lizat boşaltınız. Kartuş filtre birimi için taze SDS ekstraksiyon çözeltisi 1 ml ilave edilir ve elle 30 saniye boyunca karıştırılır, daha sonra 60 ml şırınga kullanılarak ultrasentrifugal filtre ünitesine kovmak. Bu, tüm proteinler kaldırılmıştır emin olmak için kartuş filtre ünitesi durulama etmektir.
- 3270 xg veya filtre ünitesinde hacme kadar 45 dakika boyunca ultrasentrifugal filtre ünitesinin üzerinde santrifüj uygulayın az 600 ul.
- Iskarta akış ve taze SDS-ekstraksiyon çözeltisi ile kontör ultrasentrifugal filtre ünitesi.
- X g 3.270 başka 45 dakika filtre ünitesini santrifüjleyin.
- Tekrarlayın iki kez daha 2.11 ve 2.12 adımları. Ultrasentrifugal filtre ünitesinde son hacim sağlamak nihai spin sonunda en az 600 ml.
- Bu noktada, iki konsantre ayrıldı. Bir fraksiyon toplandı ve DNA çökeltme için kullanılmaktadır ve bu protein çökelmesi için diğer olacaktır.
Not: fraksiyon miktarı süzüldü biyokütle miktarı ve ürünlerin kullanım amaçları bağlıdır. Bizim durumumuzda, DNA çökeltme doğru% 10 ve protein yağış doğru% 90 ile konsantre bölün.
3. Protein Yağış
- 10 sn için konsantresi ve vorteks bir hacim aseton (50:50): 4 hacim metanol ekleyin. -20 ° C de bir gece inkübe edilir.
- 30 dakika boyunca 17.000 xg aşağı doğru döndürün. Süpernatant Durusuve pelet 1 saat (veya kuru kadar) bir speedvac kuru (görünmez olabilir) olsun.
Not: over pelet kurulayın etmeyin bu tekrar süspansiyon zor hale getirebilir olarak. - SDS-ekstraksiyon çözeltisi 25 ul pelet süspanse edin. Sonra yukarı ve aşağı pipetleme tekrar süspansiyon bir saat boyunca bekletin.
- Bir protein tahlil kiti ve üreticilerin talimatları kullanarak protein niceliğini.
4. DNA Yağış
- Konsantre fraksiyonu, SDS-ekstraksiyon solüsyonu ilave 500 ul işareti kadar DNA çökeltme için kullanılır. Bu adım, çözümün hacmini artırmak daha kolay çalışmak için yapım için basitçe.
- 10 saniye boyunca ve vorteks (örneğin MPC protein yağış reaktifi gibi) bir protein yağış reaktif 0.583 hacimleri ekleyin. Sen beyaz bir çökelti şeklinde görmelisiniz.
Not: Biz de fenol kullandık: kloroform DNA ekstraksiyon yöntemleri, fakat düşük miktarlar daha zordur. Biz kullanarak daha iyi DNA verimi eldeMPC Protein Yağış Reaktif. - 17.000 x g'de santrifüjleyin ve 10 dakika boyunca 4 ° C.
- Başka bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp süpernatantı aktarın ve izopropanol 0.95 hacimlerini ekleyin. 30-40 kez ters çevirin.
- Maksimum hızda 4 ° C sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüj.
- Dikkatle süzün ve supernatant atın.
- % 70 etanol içinde 750 ul iki kez yıkayın.
- Kadar etanol pipetleme mümkün olduğunca kaldırın, ardından hava kurumaya bırakın.
Not: over DNA kurutun etmeyin bu tekrar süspansiyon zor hale getirebilir olarak. - Düşük TE tamponu, pH 8 (10 mM Tris-HCI, 0.1 mM EDTA) 25 ul içinde süspanse.
- Bir dsDNA tahlil kiti ve üreticilerin talimatları kullanarak DNA niceliğini. Kalitesini kontrol etmek için DNA 3 ul agaroz jeli (% 1) elektroforez gerçekleştirin.
Proteinlerin 5. SDS-PAGE Jeli
- Örnek tampon hazırlayın (950 ul Laemmli numune tamponu ve 50 ul β-merkaptoetanol). </ li>
- Protein 15 ug tekabül eden hacim veya numune tamponunun eşit hacimde 20 ul bir maksimum ilave edin ve 4 dakika boyunca kaynatılır. SDS-PAGE gerçekleştirilebilir kadar Örnekler hemen -80 ° C'de saklanabilir.
- % 5 akrilamid istifleme jeli ile% 10 akrilamid çözülmesi jel hazırlayın.
- Örnekler ve bir protein merdiveni 4 ul jel yükleyin. 250 kDa merdiven işaretleyici kadar sabit 120 V de jel çalıştırın, sadece çözülmesi jel ulaşmıştır.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak leke göre Coomassie kullanılarak jel leke.
6. In-jel tripsin Digest ve Peptid Ekstraksiyon
Not: 6.10 kadar buradan tüm adımlar kontaminasyonu en aza indirmek için bir biyolojik güvenlik kabini yapılmaktadır.
- Her kulvar için 10 kDa merdiven işaretinin altında aşırı jel kesti. Her kulvar ayrı ayrı MS / MS analiz edilecektir. Yüzey alanını artırmak için 1 mm x 1 mm kare içine her şerit kesin ve squa yerDüşük bağlayıcı mikro santrifüj tüpüne şerit res. Tüm şeritleri için bu işlemi tekrarlayın. (% 1 asetik asit kurutmadan ve kesmek zor hale gelen jel önlemek için kullanılabilir).
Not: kirlenmesini en aza indirgeme Bu aşamada önemli olan, bu yüzden kesme jel jel yapmak için kullanılan cam SDS-PAGE jelinin bir kalıp üzerinde bir biyolojik güvenlik kabinine gerçekleştirilir. - De-leke
- Her bir düşük bağlanma borusu yakın kapağa 100 mM amonyum bikarbonat, 50 ul koyun ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Asetonitril, yakın kapağın 50 ul koyun ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Aspire ve 150 ul atın.
- Tekrarlayın 6.2.1 ve 6.2.2 numaralı adımları.
- Aspire ve 95 ul atın.
- Dehidrasyon
- 50 ul asetonitril, yakın kapağı koyun ve 5 dakika bekleyin. Aspire ve 45 ul atmak ve 10 dakika bekleyin.
- Azaltma
- 100 mM AMM içinde seyreltilmiş 50 ul DTT (10 mM, koyunonyum bikarbonat) yakın kapak ve 37 ° C'de 30 dakika bekleyin.
- Alkilasyon
- (100 mM amonyum bikarbonat içinde seyreltilmiş 55 mM), 50 ul iodoacetamide yakın kapak dağıtma ve 37 ° C de 20 dakika bekleyin.
- Asetonitril, yakın kapağın 100 ul koyun ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edilir. Aspire ve 195 ul atın.
- Yıkama
- 50 ul, amonyum bikarbonat, yakın kapak dağıtma ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
- Asetonitril, yakın kapağın 50 ul koyun ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Aspire ve 120 ul atın.
- Dehidrasyon
- 50 ul asetonitril, yakın kapağı koyun ve 5 dakika bekleyin. Aspire ve 45 ul atın.
- Asetonitril 50 ul dağıtın, 5 dakika bekleyin.
- Aspire ve 75 ul atmak ve 5 dakika bekleyin.
- Hazım
- 25-30 ul ng 6 dağıtın / u (tripsin ul arasındantil tüm jel fragmanları) kaplıdır. Kapağı kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika bekleyin.
- 37 ° C'de gece boyunca (4,5 saat az) inkübe edin.
- 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
- Ekstraksiyon ve Peptit Transferi
- Ekstraksiyon çözeltisinin 30 ul koyun ve buz üzerinde 30 dakika boyunca kapak ile kapatın.
- Aspire 30 ul ve yeni etiketli düşük bağlayıcı tüp içinde aspire hacmini dağıtmak.
- Ekstraksiyon çözeltisi 12 ul ve (jel) ile orijinal tüp içine asetonitril 12 ul koyun. Kapağı kapatın ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir.
- Yeni bir tüp içine aspire 15 ul ve mevduat.
- Adımları tekrarlayın (6.9.3 ve 6.9.4).
- Kuru kadar SpeedVac yeni tüpler yerleştirin.
- Süspansiyon solüsyonunun 50 ul içinde süspanse. 10 dakika boyunca ortam üzerinde Vortex tekrar süspansiyon.
- Nano / LC uygun nano / LC şişeleri veya 96-kuyucuğu ya içine pipet peptid çözümüMS / MS çalışır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir gösteri olarak, yüzey ve Kuzey Kanada'da kıyı okyanus klorofil maksimum toplanan iki deniz suyu örnekleri üzerinde protokol uygulandı. Denizde, deniz suyu 6-7 L 3 mikron GF / D ön filtre geçirildi ederken, daha sonra mikrobiyal hücrelerin Walsh ve ark., 20 protokole 0.22 mikron kartuş filtre ünitesi üzerine toplanmıştır. Hücreler, hemen daha sonra işlenene kadar bir RNA stabilizasyonu çözelti içinde muhafaza edilmiştir. Burada sunulan laboratuarda döndükten sonra biz protokol uygulandı. Konsantre hücre lisatı ayrılır; DNA, hacim kalan% 10 ilâ çöktürüldü ise, protein, hacim% 90 çökeltildi. Biz 24-26 protein ug ve bu örneklerden elde edilen, yüksek kaliteli DNA 250-308 ng (Şekil 1) elde edilir. -Jel tripsin sindirim ve peptit ekstraksiyon biz Orbitrap Eli bağlanmış nano-LC kullanarak MS / MS analizine tabi sonra peptidlerte kütle spektrometresi (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD). Peptidler, biz örnek başına 23.000 üzerinde MS / MS spektrumları oluşturulur. Peptidler ve proteinler daha sonra PEAKS biyoinformatik araç (BSI, Waterloo, ON, Kanada) kullanarak özel bir içi sekans veri tabanına karşı, bu spektrumları arayarak tespit edilmiştir. Veritabanı deniz referans genomları ve metagenomes tahmin proteinlerin oluşuyordu. Arama yaklaşık 1000 peptidler ve her numune için 700-800 proteinlerin tanımlanmasına yol açmıştır. Doğal olarak, bu sonuçlar mikrobiyal hücre bolluğu, MS enstrümantasyon ve protein arama veritabanı ve algoritmalar bağlıdır. Bununla birlikte, bu sonuçlar, bu protokol ortamında protein yüzlerce tespit için uygun yeterli bir triptik peptidlerin üretilmesi için bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir. Metagenomic kütüphaneleri DNA 30 kadar az 100 ng olarak inşa edilebilir Dahası, bu protokol, aynı zamanda, DNA yeterli miktarlarını temin etmek için bir potansiyele sahipeşleşti metagenomic-metaproteomic veri setlerini oluşturmak için.
Metaproteomes taksonomik ve fonksiyonel kompozisyon BLASTP ve MEGAN (Metagenome analizörü) yazılım paketi 31,32 bir arada kullanılarak analiz edildi (Şekil 2). Alpha-proteobakteri atanan Proteinler en çok veri kümesi temsil, büyük çoğunluğu hangi SAR11 dalının ayrıldı idi. Alfa-proteobakteri of Rhododobacterales clade de son derece temsil ve yüzey sularında en sık tespit edilmiştir. Bacteroidetes atanan proteinler, eşit bir yüzey ve klorofil maksimum arasında dağıtıldı, ancak Flavobacteria proteinleri klorofil en fazla büyük bir dereceye kadar tespit edilmiştir. Gamma-proteobakteriyel proteinler eşit su kolonu boyunca dağıtıldı beta-proteobakteriyel proteinler yüzeyi baskın olarak bulunan ise . Gönderenişlevsel bir bakış açısı, metabolik yolların geniş bir tespit edilmiştir. Bu metabolik yolların Dikey yapılanma belli oldu. Örneğin, amino asit metabolizması, karbohidrat metabolizması ve prokaryotik karbon fiksasyonu geçiş yolları ile ilişkili proteinler yüzeyde esas olarak tespit edilmiştir, ve azot metabolizması yüzeyinde özel olarak bulunmuştur. Fotosentez katılan proteinler yüzey ve klorofil maksimum arasında eşit olarak tespit edilmiştir ise fotosentez karbon fiksasyonu proteinleri klorofil maksimum öncelikle gözlendi. Bu sonuçlar, mikrobiyal takson bir çeşitlilik proteinlerin geniş bir yelpazede Burada sunulan protokolü kullanılarak tespit edilebilir olduğunu göstermektedir.
Şekil 1:. Arctic istasyonunda 2 derinliklerinden Genomik DNA S633 ilk şeritli bir 1 kb DNA l 4 ul içeriyortoplayıcı, şerit 2 S633_2 m genomik DNA izolasyonu için 3 ul içeren, şerit 3 S633_20 m genomik DNA izolasyonu için 3 ul içerir ve şerit 4-6 (0.5 ul (85 ng), 2 ul (333 ng) ve 4 ul ihtiva HindIII 667 ng) ile sindirilmiş lambda DNA.
Şekil 2:. Arctic istasyonu S633 Arktik istasyon 633 yüzey ve klorofil maksimum sularının Taksonomik çeşitlilik karşılaştırılması (A) 2 derinliklerde taksonomik ve fonksiyonel analiz Megan kullanarak oluşturdu. (B) KEGG veritabanına karşı sorgulamak için Megan kullanılarak oluşturulan Arktik istasyon 633 yüzey ve klorofil maksimum sularının fonksiyonel çeşitlilik karşılaştırması. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Örnek korunması metaproteomic çalışmalara anahtarıdır ve önceki iş bir RNA stabilizasyonu çözümü öncesinde protein ekstraksiyon 28 hücreleri saklamak için kullanışlı bir depolama tampon olduğunu göstermiştir. İdeal olarak, numuneler 33,34 taşıma sırasında protein ifadesindeki vardiya inkâr yerinde korunmuş olacaktır. Aslında, yerinde numune alma ve sabitleme teknolojileri gemi dağıtılan araçlarla özerk toplama ve numunelerin saklanması için izin veren, geliştirilmiştir. Ancak, bu teknolojilere erişim her zaman mümkün değildir. Öyle değil mi ortak bir durumda, örnekler kısa sürede toplandıktan sonra muhafaza edilmelidir.
Burada yaygın olarak akuatik mikrobiyoloji kullanılan bir kartuş filtre ünitesi, toplanan RNA stabilizasyonu çözeltisi saklanan hücrelerden proteininin ekstraksiyonuna yönelik bir protokol mevcut. Protokol, PR, ardından bir SDS-lizis çözeltisi ve ısıtma kullanılarak hücre lizizine içerirgerekli tuz giderme adımı olarak iki katına ultrasentrifugal filtre üniteleri kullanılarak otein konsantrasyon adım. Bu konsantre ve tuz giderme adımları göz ardı edilemez dikkat edilmelidir. Biz üç tampon değişimi adımların en az bizim konsantre desalt için gerekli olduğunu gördük. Uygun tuz giderme oluşmazsa nedeniyle RNA stabilizasyonu çözeltisinin yüksek tuz konsantrasyonuna, çok fazla tuz gece boyunca protein çökeltme aşaması ve tuzunu giderme ve çöktürme adımı tekrar edilmesi gerekecektir sırasında çökeltilir. Tuzdan arındırma düzgün yapılmaması, ayrıca, 1D-PAGE çalışmaz ve numuneler kaybolacaktır.
Protein yağış ve DNA yağış hem de gerçekleştirilebilir böylece sonraki konsantre lizat bölündü. Bu metagenomic ve metaproteomic verileri aynı numuneler elde edilmesi genellikle arzu edildiğinden bu durum yararlıdır. Bir protein protein dizisi veritabanında temsil değilse o zaman peptit olacaktespit edilemez. Proteomik verileri nedeniyle veritabanından onun yokluğu bir protein tespit edememe riskini azaltır aynı örnekten genomik verileri de dahil olmak üzere.
Bu protokol, kartuş filtresi birimleri ile kullanım için optimize edilmiş ve kıyı okyanus mikrobiyal toplulukları üzerinde çalışmak için geçerli olmasına rağmen, çevresel numuneler ve filtreler diğer türleri ile kullanım için adapte edilebilir. Ancak, açıkça bu protokolün başarısı biyokütlesi başlangıç yeterli miktarda bağlı olduğu belirtilmelidir. Bu nedenle, biyokütle çok düşük olabilir sucul ekosistemlerde, buna göre filtrelenmiş su hacminin artırılması öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2 ml ROBO vial 9 mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
References
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
- Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).
- Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972 (1986).
- Williams, T. J., Long, E., et al. A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters. The ISME journal. 6 (10), (2012).
- Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics. Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).
- Venter, J. C., Remington, K., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).
- Tyson, G. W., Chapman, J., et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 428, 37-43 (2004).
- Schneider, T., Riedel, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities. Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).
- Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology. The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).
- Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al.
- Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton. The ISME journal. , 1-13 (2014).
- Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).
- Williams, T. J., Cavicchioli, R. Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web. Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).
- Saito, M. a, McIlvin, M. R., et al. Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers. Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).
- Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton. Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).
- Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. Methods in enzymology. 531, Elsevier Inc. 305-329 (2013).
- Da Walsh,, Zaikova, E., Hallam, S. J. Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples. Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).
- Thompson, M., Chourey, K. Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples. Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).
- Lu, X., Digestion Zhu, H. Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).
- Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization. Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).
- Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. Genomic and proteomic characterization of "Candidatus Nitrosopelagicus brevis": An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).
- Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS biology. 5 (3), e77 (2007).
- Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean. Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).
- Rinke, C., Schwientek, P., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection. Frontiers in microbiology. 2, 215 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).
- Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. Metagenomics - a guide from sampling to data analysis. Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).
- Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C.
- Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4. Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).
- Ea Ottesen,, Marin, R., et al. Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton. The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).
- Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system. The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).
