Introduction
Mikroorganismen sind allgegenwärtig und spielen eine essentielle Rolle in der Erde biogeochemischen Kreisläufen 1. Derzeit gibt es zahlreiche Ansätze zur Charakterisierung von molekularen mikrobiellen Gemeinschaft Struktur und Funktion zur Verfügung. Am häufigsten ist die Analyse der 16S-rRNA-Gensequenzen aus Umwelt-DNA 2 PCR-amplifizierte - 4. Ein Nachteil des 16S-rRNA-Gen-Analyse ist, dass es nur gibt Auskunft über phylogenetische Identität und Gemeinschaftsstruktur, mit wenig Informationen über die Stoffwechselfunktion. Im Gegensatz dazu Ansätze wie Metagenomik, metatranscriptomics und Metaproteomik Informationen über Community-Struktur und den Stoffwechsel. Metagenomik, oder die Analyse der Gen-Gehalt von einer Ansammlung von Organismen, bietet Informationen über die Struktur und funktionelle Potential der Community 5-8. Obwohl stark, kann dies Funktionspotenzial nicht auf die Stoffwechsel entsprechenAktivitäten der Organismen. Eines Organismus Genotyp von den Genen, von denen jeder zu RNA transkribiert werden und weiter zu Protein translatiert wird, was zu einem Phänotyp repräsentiert. Somit, um das Verständnis der mikrobiellen funktionelle Aktivität in einer Umgebung zu unterstützen, sollte postgenomische Analyse durchgeführt 9 werden. Metatranscriptomics oder die Analyse von RNA-Transkripten ist nützlich, weil es zeigt, welche Gene in einer bestimmten Umgebung transkribiert werden. Jedoch mRNA-Niveaus nicht immer ihre entsprechenden Proteinniveaus entsprechen aufgrund Translationsregulation, RNA-Halbwertszeit und der Tatsache, dass Mehrfachkopien-Protein kann für jede mRNA 10 erzeugt werden.
Aus diesen Gründen Metaproteomik wird jetzt als ein wichtiges Instrument zur Umweltmikrobiologie anerkannt. Gemeinsame metaproteomic Analysen verwenden eine Schrotflinte Proteomics Ansatz, wo die in der Nähe vollen Ergänzung der Proteine, die in einer komplexen Probe werden in der Regel durch en gereinigt und gleichzeitig analysiert,enzymatische Verdauung in Peptide und Analysen zu einem Massenspektrometer. Nachfolgende Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) "Peptid-Fingerprinting" wird verwendet, um die Peptidsequenz und potentiellen Proteinherkunfts durch Proteindatenbanksuche (für eine Übersicht siehe 11) zu bestimmen. Proteom-Arbeit hat einen langen Weg in den letzten 25 Jahren dank der Zunahme der genomischen Datenverfügbarkeit und der Erhöhung der Empfindlichkeit und Genauigkeit von Massenspektrometern so dass für Hochdurchsatz-Protein Identifizierung und Quantifizierung 11,12 kommen. Da Proteine sind das Endprodukt der Genexpression kann metaproteomic Daten helfen, festzustellen, welche Organismen in einem bestimmten Umfeld und welche Proteine sie ausdrücken aktiv sind. Dies ist vorteilhaft, wenn versucht wird, zu bestimmen, wie ein bestimmter Satz von Umgebungsvariablen den Phänotyp des Organismus oder Gemeinde betreffen. Schon früh, MS / MS-basierte metaproteomic Studien im Ozean wurden verwendet, um spezifische Proteine gezielt zu identifizierenmikrobielle Abstammungslinien, wobei die erste Studie über die Licht angetrieben Protonenpumpen Proteorhodopsin in SAR11 Meeresbakterien 13. In jüngerer Zeit wurden vergleichende Analysen metaproteomic differentiellen Proteinexpressionsmuster zwischen komplexen Gemeinschaften erläutert. Beispiele hierfür sind die Identifizierung von zeitlichen Verschiebungen im Stoffwechsel in der Küsten Nordwest-Atlantik 14 oder der Antarktischen Halbinsel 5. Andere Studien haben Schwankungen der Proteinexpressionsmuster auf räumlichen Skalen von einem nährstoffarmen Ozean gyre zu einer hoch produktiven Küstenauftriebssystem 15 beschrieben, zum Beispiel entlang einer geographischen Transekt. Für weitere Bewertungen von Metaproteomik empfehlen wir Schneider et al. (2010) 9 und Williams et al. (2014) 16. Gezielte Proteomik ist in den letzten Jahren verwendet worden, um die Expression von spezifischen Stoffwechselwege in die Umgebung 17,18 quantifizieren.
There sind drei Hauptphasen in metaproteomic Analyse. Die erste Phase ist die Probenvorbereitung, die Probenentnahme, die Zelllyse und die Konzentration des Proteins umfasst. Probensammlung in Marine Mikrobiologie häufig mit der Filtration von Meerwasser durch einen Vorfilter zu größeren eukaryotischen Zellen, Partikel und Partikel-assoziierten Bakterien zu entfernen, gefolgt von Filtration, für die Abscheidung von frei lebenden Mikrobenzellen, die üblicherweise mit der Verwendung eines 0,22 um Patrone Filtereinheit 19,20. Diese Filter werden in einem Plastikzylinder hüllt und eine Zelllyse und Proteinextraktionsprotokoll, das innerhalb der Filtereinheit durchgeführt werden kann, wäre ein wertvolles Werkzeug ist. Einmal Biomasse erhalten wird, müssen die Zellen lysiert werden, um die Proteinextraktion zu ermöglichen. Mehrere Verfahren können verwendet werden, einschließlich Guanidin-HCl-Lyse 21 und Natriumdodecylsulfat (SDS) basierte Lyseverfahren. Obwohl Detergenzien wie SDS sind sehr effizient bei stören Membranen und Solubilisieren vielen Proteinarten, concentrations von nur 0,1% kann mit nachgeschalteten Proteinverdauung und MS-Analyse 22 stören. Wichtiges Anliegen ist die negative Wirkung von SDS auf Trypsinverdau Effizienz, Auflösungsvermögen von Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie und Ionensuppression oder Ansammlung innerhalb der Ionenquelle 23.
Die zweite Phase ist die Fraktionierung und Analyse, wo Proteine einer enzymatischen Verdauung, gefolgt von LC MS / MS-Analyse unterzogen, was zu einer m / z-Fragmentierungsmuster, das verwendet werden kann, um die primäre Aminosäuresequenz des ursprünglichen tryptischen Peptids festzustellen. In Abhängigkeit von den Arten von Waschmitteln, sowie die nachgeschaltete Massenspektrometrie Workflow verschiedene Aufschlußmethoden durchgeführt werden. In unserem Protokoll wird 1-D-PAGE-Elektrophorese, gefolgt von Entfernung von SDS aus dem Gel, um jegliche Verunreinigungen zu entfernen Detergens verwendet wird. Die Analyse von Proteinen, die schwer zu solubilisieren, wie Membranproteine sind, erfordert die Verwendung von hohen Konzentrationen von SDS oder andere Reinigungsmittel. Dies führt zu Kompatibilitätsprobleme mit SDS-Gelelektrophorese. Wenn das Ziel einer Studie erfordert die Solubilisierung dieser schwer Proteine löslich, kann das Rohr-Gel-System verwendet werden 22,24. Das Rohr-Gel-Verfahren enthält Proteine innerhalb der Gel-Matrix ohne die Verwendung von Elektrophorese. Anschließend jegliche Detergenzien zur Solubilisierung verwendet werden, bevor die Proteinverdauung entfernt.
Die dritte Phase ist die Bioinformatik-Analyse. In dieser Phase werden die MS / MS Peptid Daten werden mit einer Datenbank von setzten Nukleotidsequenzen durchsucht, um festzustellen, welche Peptide und Proteine in der Probe vorhanden sind. Die Identifizierung von Peptiden ist von der Datenbank gegen gesucht. Meeres metaproteomic Daten werden häufig gegen Datenbanken von Referenzgenome, Metagenom-Daten wie die Global Ocean Sampling-Datensatz 25, ebenso wie einzelne Zelle verstärkt Genome von unkultivierten li umfasst gesuchtneages 26,27. Proteinidentifikation kann auch durch den Einschluss von metagenomic Sequenzen aus der gleichen Probe erhöht, wenn der metaproteomic Daten wurden 5 abgeleitet werden.
Hier stellen wir ein Protokoll für die Erzeugung von Peptiden geeignet für MS / MS-basierte Analyse von mikrobiellen Biomasse durch Filtration gesammelt und in einem RNA-Stabilisierungslösung gelagert. Das hier beschriebene Protokoll erlaubt DNA und Protein, von der gleichen Probe, so dass alle Schritte, die zu dem Protein und DNA Fällungen identisch sind, isoliert werden. Aus praktischer Sicht wird weniger Filtration erforderlich, da nur ein Filter ist sowohl für Protein und DNA-Extraktion erforderlich. Wir möchten auch, um zu bestätigen, dass dieses Protokoll wurde durch die Kombination, die Anpassung und Änderung von zwei bisher veröffentlichten Protokollen erstellt. Zelllysis Schritte von Saito et al (2011) 28 angepasst. Und die In-Gel-Trypsin-Verdauung Komponente aus Shevche angepaßtNKO et al. (2007) 29.
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Protocol
1. Bereiten Reagenzien
- Vorbereitung SDS-Extraktionslösung: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% Glycerin, 10 mM EDTA und 1% SDS. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei 4 ° C.
- Bereiten stock Reagenzien für die Polyacrylamid-Gel nötig.
- Bereiten 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei Raumtemperatur lagern.
- 0,5 M Tris-HCL pH 6,8. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei Raumtemperatur lagern.
- Bereiten Sie 10% SDS. Filter zu sterilisieren mit einem 0,22 um Filter und bei Raumtemperatur lagern.
- Bereiten Sie Lösungen für in-Gel-Trypsin zu verdauen und Peptidextraktion benötigt wird.
- Bereiten 100 mM Ammoniumbicarbonat. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei 4 ° C.
- Bereiten Sie 1 M DTT Aktien. In 100 mM Ammoniumbicarbonat und Öffnungs suspendiert bei -80 ° C.
- Bereiten 550 mM Iodacetamid Aktien. In Hänge100 mM Ammoniumbicarbonat und bei -80 ° C.
- Bereiten 100 ng / & mgr; l Trypsin Aktien. Aliquot 60 ul in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C.
- Bereiten Extraktionslösung: 1% Ameisensäure, 2% Acetonitril.
- Vorbereitung Resuspensionslösung: 5% Acetonitril und 0,1% Ameisensäure.
2. Führen Sie Cell Lysis in Patronenfilteranlage mit Zellen in RNA Stabilization Lösung konserviert
- Vertreiben die RNA Stabilisierungslösung aus dem Patronenfiltereinheit (1,5 ml) gelöst und in einem 2 ml Mikroröhre mit einer 60 ml Spritze am Luer-Ende des Filters angebracht ist.
- Zentrifugieren Sie die 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen für 10 min bei 17.000 xg, jede Zelltrümmer zu pelletieren. Dies geschieht so, dass der Filter im Schritt 2.3 nicht verstopfen.
- Überstand in einem 10 K Ultrazentrifugenfiltereinheit, um alle Proteine aus Zellen stammen, die von der Gefrier / tha lysiert wurden erfassenw der Probe. Werfen Sie die Tablette. Es wird in Schritt 2.5 verwendet werden. Zuführen Zentrifugation der Ultrazentrifugenfiltereinheit bei 3.270 × g für 30 min oder bis das Volumen auf etwa 600 & mgr; l verringert.
- Schmelzen Sie die Spitze eines p10 Spitze und blockieren die Nicht Luer-Lock-Seite des Patronenfilteranlage mit dem offenen Ende der Spitze. Dadurch wird sichergestellt, dass kein Extraktionspuffer und Biomasse während der Schritte 2,5-2,7 entweicht.
- Hängen Sie das Pellet in 1 ml SDS-Extraktionslösung pipettieren und es in die ursprüngliche Patronenfilteranlage. Der einfachste Weg, um in die Patronenfilteranlage Pipette, um eine p200 Spitze auf eine p1000 Spitze stapeln und diese Doppelspitze zum Pipettieren.
- 1 ml SDS-Extraktionslösung auf den Patronenfiltergerät so das Gesamtvolumen beträgt etwa 2 ml und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur, während in einem Hybridisierungsofen dreht. Platzieren 3 zerknitterten lab wischt den Boden eines 50 ml konischen Röhrchen. Parafilm beide Enden des Patronenfilteranlage geschlossenund setzen Sie den Patronenfilteranlage in das 50-ml-Tube. Schließen Sie den Deckel und setzen Sie den Schlauch in die Hybridisierungsofen.
- Nach 10 Minuten statt der Sterivex Filter auf einem Schaumstoff-Schwimmer und befestigen Sie sie mit einer 5-ml-Spritze am Luer-Lock-Ende. Float und Inkubation in einem 95 ° C Wasserbad für 15 min.
- Lassen Sie die Patronenfilteranlage kühl und drehen bei Raumtemperatur für 1 Stunde (wie in Schritt 2.6).
- Vertreiben die SDS-Extraktionslösung / Zelllysat aus dem Filter mit einem 60-ml-Spritze in der gleichen Ultrazentrifugen-Filtereinheit wie zuvor beschrieben (Schritt 2.3). 1 ml frisches SDS-Extraktionslösung zur Patronenfilteranlage und Mischen für 30 Sekunden mit der Hand, dann in der Ultrazentrifugen-Filtereinheit auszustoßen unter Verwendung der 60-ml-Spritze. Dies wird auf die Patronenfiltereinheit spülen, um sicherzustellen, dass alle Proteine entfernt wurden.
- Zuführen Zentrifugation auf dem Ultrazentrifugenfiltereinheit für 45 min bei 3.270 × g oder, bis das Volumen in der Filtereinheit von weniger als 600 & mgr;.
- Durchfluss verwerfen und füllen Sie die Ultrazentrifugenfiltereinheit mit frischen SDS-Extraktionslösung.
- Zentrifugieren Sie die Filtereinheit für einen weiteren 45 min bei 3270 x g.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.11 und 2.12 noch zweimal. Sicherzustellen, das Endvolumen in der Ultrazentrifugen-Filtereinheit beträgt höchstens 600 & mgr; l am Ende der letzten Schleudern.
- An diesem Punkt gespalten das Konzentrat in zwei. Eine Fraktion wird für die DNA-Niederschlag und der andere für die Proteinfällung werden.
Anmerkung: Die Fraktionierung Menge hängt von der Menge an Biomasse, die gefiltert wurde, und dem beabsichtigten Verwendungszweck der Produkte. In unserem Fall teilen wir das Konzentrat mit 10% gegenüber DNA-Niederschlag und 90% gegenüber Proteinfällung.
3. Proteinniederschlag
- In 4 Volumina Methanol: Aceton (50:50) mit einem Volumen von Konzentrat und Vortex für 10 Sekunden. Inkubieren über Nacht bei -20 ° C.
- Spin down bei 17.000 × g für 30 min. Den Überstand umfüllenund lassen Sie das Pellet trocken in einem Speedvac 1 Stunde (oder bis trocken) (kann nicht sichtbar sein).
Hinweis: Nicht über das Pellet trocknen, da dies es schwierig, wieder zu suspendieren machen kann. - Aussetzen des Pellets in 25 ul SDS-Extraktionslösung. Lassen Sie sitzen für eine Stunde dann durch Auf- und Abpipettieren resuspendiert.
- Quantifizierung Protein unter Verwendung eines Protein-Assay-Kit und den Anweisungen des Herstellers.
4. DNA-Niederschlag
- In SDS-Extraktionslösung auf den Konzentratfraktion, für DNA-Niederschlag, bis die 500 ul Zeichen verwendet werden. Dieser Schritt besteht einfach darin, das Volumen der Lösung zu erhöhen, so dass es leichter zu handhaben.
- In 0.583 Bände eines Proteins Fällungsreagenz (wie dem MPC-Protein Fällungsreagenz) und Vortex für 10 Sekunden. Sie sollten einen weißen Niederschlag Form zu sehen.
Anmerkung: Wir haben auch Phenol: Chloroform-DNA-Extraktionsverfahren, aber es ist schwieriger aufgrund der geringen Volumina. Wir erhalten eine bessere DNA-Ausbeuten unter Verwendung derMPC Protein Precipitation Reagent. - Zentrifuge bei 17.000 × g und 4 ° C für 10 min.
- Überstand in einem anderen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 0,95 Volumina Isopropanol. Kehren 30-40 mal.
- Zentrifuge für 10 min bei 4 ° C bei maximaler Geschwindigkeit.
- Dekantieren Sie vorsichtig und den Überstand verwerfen.
- Spülung zweimal mit 750 ul 70% Ethanol.
- Entfernen Sie so viel Ethanol wie möglich durch Pipettieren, dann lassen Sie an der Luft trocknen.
Hinweis: Nicht über die DNA zu trocknen, da dies es schwierig, wieder zu suspendieren machen kann. - Resuspendiere in 25 ul TE niedriger Puffer, pH 8 (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA).
- Quantifizierung der DNA unter Verwendung eines dsDNA Assay-Kit und den Anweisungen des Herstellers. Führen Agarose-Gel (1%) Elektrophorese auf 3 ul der DNA, um seine Qualität zu überprüfen.
5. SDS-PAGE-Gel von Proteinen
- Vorbereitung Probenpuffer (950 & mgr; l Laemmli-Probenpuffer und 50 & mgr; l β-Mercaptoethanol). </ li>
- Hinzufügen des entsprechenden Volumens von 15 ug Protein oder ein Maximum von 20 ul bis gleiches Volumen Probenpuffer hinzu und kocht 4 min. Proben können nun bei -80 ° C gelagert, bis SDS-PAGE durchgeführt werden kann.
- Herstellung von 10% Acrylamid-Trenngel mit einer 5% Acrylamid-Sammelgel.
- Legen Sie das Gel mit Proben und 4 & mgr; l eines Proteins Leiter. Führen Sie das Gel bei konstanten 120 V bis 250 kDa Leiter Marker hat gerade erreichte das Trenngel.
- Fleck des Gels mit Coomassie-Beize nach den Anweisungen des Herstellers.
6. In-Gel-Trypsin Digest und Peptid-Extraktion
Hinweis: Alle Schritte von hier bis 6.10 werden in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt, um eine Kontamination zu minimieren.
- Schneiden Sie überschüssiges Gel unter der 10 kDa Leiter Zeichen für jede Spur. Jede Spur wird auf dem MS / MS getrennt analysiert werden. Schneiden Sie jede Spur in 1 mm x 1 mm Quadrate, um die Oberfläche zu vergrößern und legen Sie alle squares von der Fahrspur in einen Niederbindemikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie dies für alle Spuren. (1% ige Essigsäure verwendet werden, um das Gel nicht austrocknen und schwer zu schneiden zu vermeiden).
Hinweis: Die Minimierung Verunreinigungen ist entscheidend in dieser Phase, so gel Slicing in einer biologischen Sicherheitswerkbank auf dem Glas SDS-PAGE-Gel-Form verwendet wird, um das Gel zu machen durchgeführt. - De-Flecken-
- Dispense 50 ul 100 mM Ammoniumbicarbonat in jedem Low-Bindungsröhre, in der Nähe Kappe und bei 37 ° C für 10 min.
- Dispense 50 ul Acetonitril, in der Nähe Kappe und bei 37 ° C für 5 min.
- Absaugen und entsorgen Sie 150 ul.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.2.1 und 6.2.2.
- Absaugen und entsorgen 95 & mgr; l.
- Entwässerung
- Dispense 50 ul Acetonitril, nahe Kappe und warten Sie 5 Minuten. Absaugen und entsorgen 45 & mgr; l und warten Sie 10 min.
- Reduktion
- Geben Sie 50 & mgr; l DTT (10 mM, 100 mM verdünnt ammOnium-Bicarbonat), in der Nähe Kappe und warten 30 Minuten bei 37 ° C.
- Alkylierung
- Dispense 50 ul Iodacetamid (55 mM, 100 mM Ammoniumbicarbonat verwässert), in der Nähe Kappe und warten Sie 20 min bei 37 ° C.
- Dispense 100 ul Acetonitril, nahe Kappe und Inkubation für 5 min bei 37 ° C. Absaugen und entsorgen Sie 195 ul.
- Wash
- Dispense 50 ul Ammoniumbicarbonat, nahe Kappe und Inkubation für 10 min bei 37 ° C.
- Dispense 50 ul Acetonitril, in der Nähe Kappe und bei 37 ° C für 5 min. Absaugen und entsorgen Sie 120 ul.
- Entwässerung
- Dispense 50 ul Acetonitril, nahe Kappe und warten Sie 5 Minuten. Absaugen und entsorgen 45 & mgr; l.
- Dispense 50 ul Acetonitril, warten Sie 5 Minuten.
- Absaugen und entsorgen 75 ul und warten Sie 5 Minuten.
- Verdauung
- Verzichten 25-30 ul von 6 ng / ul Trypsin (until alle Gelfragmente abgedeckt sind). Schließen Kappe und warten Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Inkubieren über Nacht (4,5 hr Minimum) bei 37 ° C.
- Lassen Sie sitzen bei Raumtemperatur für 30 min.
- Extraktion und Peptidtransfer
- Dispense 30 ul Extraktionslösung und Deckel mit Deckel für 30 Minuten auf Eis.
- Saugen Sie 30 ul und verzichten saugte Volumen in einem neuen markierten Tiefbindungsrohr.
- Verzichtet werden 12 & mgr; l Extraktionslösung und 12 ul Acetonitril in das ursprüngliche Rohr (mit Gel). Schließen Kappe und Inkubation für 30 min auf Eis.
- Saugen Sie 15 ul und Einlagen in die neue Röhre.
- Wiederholen Sie die Schritte (6.9.3 und 6.9.4).
- Legen Sie neue Rohre in einem SpeedVac bis trocken.
- Resuspendiere in 50 ul Resuspensionslösung. Vortex auf Medium für 10 Minuten, um wieder zu suspendieren.
- Pipette Peptidlösung entweder nano / LC Fläschchen oder 96-Well-Platten geeignet für Nano / LCMS / MS-Arbeit.
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Representative Results
Als Demonstration, das Protokoll führten wir auf zwei Meerwasserproben von der Oberfläche und der Chlorophyllmaximum des Küsten Ozean in Nord-Kanada gesammelt. Auf See wurde 6-7 L des Meerwassers durch eine 3 & mgr; GF / D-Vorfilter geleitet, dann mikrobiellen Zellen wurden auf eine 0,22 um-Patronenfiltergerät nach dem Protokoll von Walsh et al. 20 gesammelt. Zellen wurden sofort in einem RNA-Stabilisierungslösung bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Nach der Rückkehr in das Labor, das Protokoll führten wir wie sie hier vorgestellt. Die konzentrierte Zelllysat wurde geteilt; Protein wurde aus 90% des Volumens ausgefällt, während die DNA wurde von den restlichen 10% des Volumens ausgefällt. Geborgenen 24-26 ug Protein und 250-308 ng hochwertiger DNA aus diesen Proben (Figur 1). Nach dem In-Gel-Trypsin Verdauung und Peptidextraktion, wir MS / MS-Analyse unterzogen, die die Peptide mit Hilfe eines Nano-LC an die Orbitrap Eli gekoppeltte Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Von den Peptiden erwirtschafteten wir über 23.000 MS / MS-Spektren pro Probe. Peptide und Proteine wurden dann durch die Suche diese Spektren gegen eine kundenspezifische Inhouse-Sequenzdatenbank mit den Spitzen der Bioinformatik-Tool (BSI, Waterloo, ON, Kanada) identifiziert. Die Datenbank wurde der vorhergesagten Proteine aus marinen Referenz Genome und Metagenomen besteht. Die Suche führte zur Identifizierung von ungefähr 1000 Peptide und Proteine 700-800 für jede Probe. Selbstverständlich sind diese Ergebnisse abhängig von mikrobiellen Zellfluss, MS Instrumentierung, und Protein-Suchdatenbank und Algorithmen. Trotzdem zeigen diese Ergebnisse, dass dieses Protokoll hat das Potenzial, eine angemessene tryptischen Peptiden geeignet identifizieren Hunderte von Proteinen in der Umgebung zu erzeugen. Darüber hinaus hat seit Metagenombanken kann von so wenig wie 100 ng DNA 30 konstruiert werden dieses Protokoll auch mögliche, angemessene Mengen an DNA bietenabgeglichen Metagenom-metaproteomic Datensätzen zu generieren.
Taxonomischen und funktionale Zusammensetzung der metaproteomes wurde unter Verwendung einer Kombination von BLASTp und MEGAN (Metagenom Analyzer) Softwarepaket analysiert 31,32 (Abbildung 2). Proteine Alpha-Proteo zugeordnet als die am stärksten in der Datenmenge repräsentiert, die überwiegende Mehrheit von denen zur SAR11 Clade zugeordnet. Die Rhododobacterales Clade von Alpha-Proteobakterien wurde ebenfalls stark vertreten und am häufigsten in Oberflächengewässer identifiziert. Proteine Bacteroidetes zugewiesen wurden gleichmäßig auf der Oberfläche und Chlorophyll maximale verteilt, sondern Flavobacteria Proteine wurden in größerem Maße an der Chlorophyll Maximum identifiziert. Gamma-proteo Proteine wurden gleichmäßig in der Wassersäule verteilt und an Beta-proteo Proteine wurden überwiegend in der Oberfläche gefunden . Voneine funktionale Perspektive, eine breite Palette von Stoffwechselwege identifiziert. Vertikale Strukturierung dieser Stoffwechselwege war offensichtlich. Beispielsweise wurden Proteine mit Aminosäuremetabolismus, Kohlenhydratmetabolismus und prokaryotischen Kohlenstoff-Fixierung Wege assoziiert erster Linie an der Oberfläche identifiziert, und dem Stickstoff-Metabolismus wurde ausschließlich an der Oberfläche gefunden. Photo Kohlenstoff-Fixierung Proteine wurden in erster Linie auf das Chlorophyll maximal beobachteten während Proteine der Photosynthese beteiligt sind gleichmäßig zwischen der Oberfläche und Chlorophyll Maximum identifiziert. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine breite Vielfalt von Proteinen aus einer Vielfalt von mikrobiellen Taxa kann mit dem hier vorgestellten Protokoll erkannt werden.
Abb. 1: Genomische DNA aus 2 Tiefen bei Arctic Station S633 Die erste Spur enthält 4 ul einer 1 kb DNA-lAddierer, Spur 2 enthält 3 ul genomische DNA-Extraktion aus S633_2 m, Bahn 3 enthält 3 ul genomische DNA-Extraktion aus S633_20 m und Bahnen 4-6 enthalten 0,5 & mgr; l (85 ng), 2 ul (333 ng) und 4 ul ( 667 ng) der HindIII verdaut Lambda-DNA.
Abb. 2: Die taxonomische und funktionelle Analyse von 2 Tiefen bei Arctic Station S633 taxonomische Vielfalt Vergleich der Polarstation 633 Oberfläche und Chlorophyll maximale Wasser (A) unter Verwendung von MEGAN erstellt. Funktionsvielfalt Vergleich der Polarstation 633 Oberfläche und Chlorophyll maximale Wasser (B) unter Verwendung von MEGAN gegen die KEGG-Datenbank abfragen, erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Probenkonservierung ist der Schlüssel zur metaproteomic Studien und früheren Arbeiten gezeigt, dass ein RNA-Stabilisierungslösung ist eine nützliche Speicherpuffer zum Speichern von Zellen vor der Proteinextraktion 28. Idealerweise würden Proben in situ erhalten werden, um Verschiebungen in der Protein-Expression während der Handhabung 33,34 negieren. In der Tat, in situ Probenahme und Fixierungstechniken sind entwickelt worden, die für die autonome Sammlung und Aufbewahrung von Proben durch Schiffs eingesetzt Instrumente ermöglichen. Allerdings ist der Zugang zu diesen Technologien nicht immer durchführbar. Im häufigen Fall, daß es nicht, sollten die Proben so schnell wie möglich nach der Entnahme erhalten werden.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Extraktion von Protein aus RNA-Stabilisierung gelagerten Lösung Zellen auf einer Patronenfiltereinheit, die üblicherweise in Wasser Mikrobiologie verwendet wird gesammelt. Das Protokoll enthält die Zelllyse unter Verwendung eines SDS-Lyse-Lösung und Erhitzen, gefolgt von einer protein Konzentrationsschritt mittels Ultrazentrifugenfiltereinheiten, die als notwendige Entsalzungsschritt verdoppelt. Es muss beachtet werden, dass die Konzentration und Entsalzung Schritte können nicht übersehen werden. Wir fanden, dass ein Minimum von drei Pufferaustauschschritte erforderlich, um unsere Konzentrat entsalzt. Aufgrund der hohen Salzkonzentration des RNA Stabilisierungslösung, wenn die entsprechenden Entsalzen nicht auftritt, zu viel Salz wird über Nacht bei der Proteinfällung Schritt und der Entsalzung und Fällungsschritt muss wiederholt werden, ausgefällt werden. Darüber hinaus, wenn die Entsalzung nicht ordnungsgemäß durchgeführt wird die 1D-PAGE wird nicht funktionieren, und die Proben werden verloren gehen.
Als nächstes wurde die konzentrierte Lysat geteilt, so daß sowohl die Proteinfällung und DNA-Fällung durchgeführt werden konnte. Dies ist nützlich, da es oft wünschenswert, dass metagenomic und metaproteomic Daten aus den gleichen Proben erzeugt werden. Wenn ein Protein nicht in der Proteinsequenz-Datenbank repräsentiert dann das Peptidnicht identifiziert werden. Einschließlich der genomischen Daten aus derselben Probe wie der Proteomdaten verringert die Gefahr, nicht in der Lage, ein Protein zu identifizieren aufgrund seiner Abwesenheit von der Datenbank.
Obwohl dieses Protokoll wurde für die Verwendung mit Patronenfilteranlagen optimiert und validiert, um auf die Küstenozean mikrobiellen Gemeinschaften zu arbeiten, kann es für die Verwendung mit anderen Arten von Umweltproben und Filter angepasst werden. Es sollte jedoch klargestellt werden, daß der Erfolg dieses Protokolls ist abhängig von einer ausreichenden Menge an Ausgangs-Biomasse. Daher in aquatischen Ökosystemen, wo Biomasse kann sehr niedrig sein, empfehlen wir, die Erhöhung der Wassermenge entsprechend gefiltert.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2 ml ROBO vial 9 mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
References
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
- Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).
- Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972 (1986).
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