Introduction
Mikroorganismer finns överallt och spelar viktiga roller i Jordens biogeokemiska kretslopp 1. För närvarande finns det många molekylära metoder tillgängliga för att karakterisera mikrobiell samhällsstruktur och funktion. Vanligast är analysen av 16S rRNA gensekvenser PCR-amplifierades från miljö DNA 2-4. En nackdel med 16S rRNA-genen analys är att det bara ger information om fylogenetisk identitet och samhällsstruktur, med lite information om metabolisk funktion. Däremot närmar såsom metagenomik, metatranscriptomics och metaproteomics ge information om samhällsstrukturen och metabolism. Metagenomik, eller analys av genen innehållet i en samling av organismer, ger information om struktur och funktionella potential i samhället 5-8. Även kraftfull, kan denna funktionella potential inte överensstämmer med det metabolaverksamhet organismerna. En organisms genotyp representeras av dess gener som var och en kan transkriberas till RNA och vidare översatta till protein, vilket resulterar i en fenotyp. Således, för att underlätta förståelsen av mikrobiell funktionell aktivitet i en miljö, bör efter genomisk analys utföras 9. Metatranscriptomics, eller analys av RNA-transkript är användbart eftersom det avslöjar vilka gener som transkriberas i en viss miljö. Dock inte mRNA-nivåer inte alltid matchar deras motsvarande proteinnivåer på grund av translationell reglering, RNA halveringstid och det faktum att flera protein kopior kan genereras för varje mRNA 10.
För dessa skäl metaproteomics erkänns nu som ett viktigt verktyg för miljömikrobiologi. Vanliga metaproteomic analyser använda ett hagelgevär proteomik tillvägagångssätt där nära full uppsättning av proteiner i en komplex prov renas och analyseras samtidigt, vanligtvis genom enzymatic nedbrytning till peptider och analyser på en masspektrometer. Efterföljande tandemmasspektrometri (MS / MS) "peptidfingerprinting" används för att bestämma peptidsekvensen och potentiell proteinursprungs genom proteindatabassökning (för en översikt se 11). Proteomic arbete har kommit långt under de senaste 25 åren tack vare ökningen av genomisk datatillgänglighet och ökningen av känslighet och noggrannhet masspektrometrar möjliggör hög genomströmning proteinidentifiering och kvantifiering 11,12. Eftersom proteiner är slutprodukten av genuttryck kan metaproteomic uppgifter att avgöra vilka organismer som är aktiva i en viss miljö och vilka proteiner de uttrycker. Detta är fördelaktigt när man försöker fastställa hur en viss uppsättning miljövariabler påverkar fenotypen hos en organism eller i samhället. Tidigt, MS / MS-baserade metaproteomic studier i havet har använts för att identifiera specifika proteiner i riktademikrobiella härstamningar, med den första studien med fokus på ljuset drivna protonpumps proteorhodopsin i SAR11 marina bakterier 13. På senare tid har jämförande metaproteomic analyser klardifferentialproteinuttrycksmönster mellan komplexa samhällen. Som exempel kan nämnas att identifiera tidsförskjutningar i ämnesomsättningen i kustnordvästra Atlanten 14 eller Antarktiska halvön 5. Andra studier har beskrivit variationer i proteinuttrycksmönster över rumsliga skalor, till exempel längs en geografisk transekt från en låg-näringsämne ocean gyre till en högproduktiv kust upwelling systemet 15. För ytterligare omdömen om metaproteomics rekommenderar vi Schneider et al. (2010) 9 och (2014) 16 Williams et al.. Riktade proteomik har också använts under senare år för att kvantifiera uttrycket av specifika metaboliska vägar i miljön 17,18.
There finns tre huvudsakliga faser i metaproteomic analys. Den första fasen är provberedning, som omfattar provtagning, cellys och koncentration av protein. Provsamling i marin mikrobiologi ofta innebär filtrering av havsvatten genom ett förfilter för att avlägsna större eukaryota celler, partiklar och partikelassocierade bakterier, följt av filtrering för fångst av fria levande mikrobceller, vanligen med hjälp av en 0,22 um patron filterenhet 19,20. Dessa filter är incased i en plastcylinder och en cell-lys och proteinextraktion protokoll som kan utföras inom filterenheten skulle vara ett värdefullt verktyg. När biomassa erhålls måste cellerna lyseras för att möjliggöra proteinextraktion. Kan användas flera metoder, inkluderande guanidin-HCl lys 21 och natriumdodecylsulfat (SDS) -baserade lyseringsmetoder. Även om tvättmedel som SDS är mycket effektiva på att störa membran och solubilisera många proteintyper, concentrations så låg som 0,1% kan störa nedströms protein matsmältningen och MS-analys 22. Av stor betydelse är de negativa effekterna av SDS på trypsindigerering effektivitet, upplösningsförmågan av omvänd fas vätskekromatografi och jon undertryckande eller ackumulering inuti jonkällan 23.
Den andra fasen är fraktionering och analys, där proteiner utsattes för enzymatisk digerering följt av LC MS / MS-analys, vilket resulterar i AM / z fragmenteringsmönster som kan användas för att fastställa den primära aminosyrasekvensen för det ursprungliga tryptiska peptiden. Olika uppslutningsmetoder kan utföras beroende på vilken typ av tvättmedel som används, liksom nedströms masspektrometri arbetsflöde. I våra protokoll, är en-D PAGE-elektrofores, följt av avlägsnande av SDS från gelén utnyttjas för att avlägsna eventuell kontaminering tvättmedel. Den analys av proteiner som är svåra att solubilisera, såsom membranproteiner, kräver användning av höga koncentrationer av SDS eller andra detergenter. Detta leder till kompatibilitetsproblem med SDS-gelelektrofores. Om syftet med en studie kräver solubilisering av dessa svåra att lösa proteiner, kan röret-gelsystemet användas 22,24. Röret-gelmetoden inkorporerar proteiner inuti gelmatrisen utan användning av elektrofores. Därefter alla rengöringsmedel som används för solubilisering tas bort innan proteindigestion.
Den tredje fasen är den bioinformatiska analys. I denna fas peptiddata MS / MS söks mot en databas med översatta nukleotidsekvenser för att bestämma vilka peptider och proteiner är närvarande i provet. Identifieringen av peptider är beroende av databasen är det sökas mot. Marina metaproteomic uppgifter allmänt sökas mot databaser består av referens genom, metagenomic uppgifter som Global Ocean Sampling dataset 25, liksom enstaka celler förstärks ledare för genom från obrukad lineages 26,27. Proteinidentifiering kan också ökas genom att inkludera metagenomic sekvenser från samma prov som metaproteomic uppgifter härleddes 5.
Här ger vi ett protokoll för generering av peptider som är lämpliga för MS / MS-baserad analys från mikrobiell biomassa uppsamlades genom filtrering och lagras i en RNA-stabiliseringslösning. Protokollet som beskrivs här gör det möjligt för DNA och protein som skall isoleras från samma prov, så att alla steg som leder fram till proteinet och DNA-utfällningar är identiska. Ur ett praktiskt perspektiv är mindre filtrering erfordras, eftersom endast ett filter krävs för både protein och DNA-extraktion. Vi vill också att erkänna att detta protokoll har skapats genom en kombination, anpassning och ändring av två tidigare publicerade protokoll. Cellysen steg är anpassade från Saito et al. (2011) 28 och i-gel trypsin smälta komponent är anpassad från ShevcheNKO et al., (2007) 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered Reagens
- Förbered SDS-extraktionslösning: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 5% glycerol, 10 mM EDTA och 1% SDS. Filter sterilisera med användning av ett 0,22 pm filter och förvara vid 4 ° C.
- Förbered lager reagenser som behövs för polyakrylamidgelen.
- Bered 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter sterilisera med användning av ett 0,22 pm filter och förvara vid rumstemperatur.
- 0,5 M Tris-HCl pH 6,8. Filter sterilisera med användning av ett 0,22 pm filter och förvara vid rumstemperatur.
- Bered 10% SDS. Filtrera sterilisera med användning av ett 0,22 pm filter och förvara vid rumstemperatur.
- Bered lösningar som krävs i-gel trypsin smälta och peptid extraktion.
- Bered 100 mM ammoniumbikarbonat. Filter sterilisera med användning av ett 0,22 pm filter och förvara vid 4 ° C.
- Förbered 1 M DTT lager. Suspenderas i 100 mM ammoniumbikarbonat och förvara vid -80 ° C.
- Förbered 550 mM jodacetamid lager. Suspenderades i100 mM ammoniumbikarbonat och lagra vid -80 ° C.
- Bered 100 ng / l trypsin lager. Alikvotera 60 ul i 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -80 ° C.
- Förbered extraktionslösning: 1% myrsyra, 2% acetonitril.
- Bered resuspension lösning: 5% acetonitril och 0,1% myrsyra.
2. Utför Cell Lysis i patron Filter Unit med celler bevarade i RNA Stabilization Solution
- Driva ut RNA-stabilisering lösningen från patronfilterenheten (1,5 ml) och in i ett 2 ml mikrocentrifugrör med hjälp av en 60 ml spruta fäst vid luer-lock änden av filtret.
- Centrifugera 2 ml mikrocentrifugrör under 10 minuter vid 17 tusen xg för att pelletera alla cellrester. Detta görs så att filtret i steg 2.3 inte täppa.
- Överför supernatanten till en 10 K ultracentrifugal filterenhet för att fånga några proteiner som härrör från celler som har lyserats från frys / thavikt av provet. Kasta inte bort pelleten. Den kommer att användas i steg 2.5. Utför centrifugering av ultracentrifugal filterenheten vid 3270 xg under 30 minuter eller tills volymen har minskat till cirka 600 l.
- Smält spetsen av en p10 spets och blockera icke luer-lock sidan av patronen filterenheten med den öppna änden av spetsen. Detta kommer att säkerställa att ingen extraktionsbufferten och biomassa flyr under steg 2,5-2,7.
- Suspendera pelleten i 1 ml SDS-extraktionslösning och pipettera den i den ursprungliga patronfilterenheten. Det enklaste sättet att pipettera i patronfilterenheten är att stapla en p200 spets på en P1000 spets och använda denna dubbla tips för pipettering.
- Tillsätt 1 ml av SDS-extraktionslösning till patronfilterenheten så att den totala volymen är ca 2 ml och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur under rotation i en hybridiseringsugn. Placera 3 skrynkliga lab våtservetter på botten av en 50 ml koniska rör. Parafilm båda ändarna av kassettfiltret enheten stängdaoch satte patronfilter enheten i 50 ml röret. Stäng locket och sätta röret i hybridiseringsugn.
- Efter 10 minuter placera Sterivex filtrera på en skum floater och fäst den på plats med en 5 ml spruta på luer-lock ände. Float och inkubera i en 95 ° C vattenbadet under 15 minuter.
- Låt patronfilterenheten sval och rotera vid rumstemperatur under 1 timme (som i steg 2,6).
- Utvisa SDS extraktionslösningen / cellysat ur filtret med en 60 ml spruta in i samma ultracentrifugal filterenhet som tidigare (steg 2,3). Tillsätt 1 ml färsk SDS-extraktionslösning till patronfilterenheten och blanda under 30 sek för hand, sedan driva ut in i den ultracentrifugal filterenheten med användning av 60 ml sprutan. Detta är för att skölja patronfilterenheten för att säkerställa alla proteiner har avlägsnats.
- Utför centrifugering på ultracentrifugal filterenheten under 45 minuter vid 3270 xg eller tills volymen i filterenheten är mindre än 600 l.
- Släng genomströmning och fyll på ultracentrifugal filterenheten med färsk SDS-extraktion lösning.
- Centrifugera filterenheten för ytterligare 45 minuter vid 3270 x g.
- Upprepa steg 2.11 och 2.12 gånger mer. Se till den slutliga volymen i den ultracentrifugal filterenheten är som mest 600 | j, l vid slutet av den slutliga spinn.
- Vid denna punkt, delbart koncentratet i två. En fraktion kommer att användas för DNA-utfällning och den andra för proteinutfällning.
Obs! Fraktione storlek beror på hur mycket biomassa som filtrerades och den avsedda användningen av produkterna. I vårt fall, vi dela koncentratet med 10% mot DNA nederbörd och 90% mot proteinutfällning.
3. proteinutfällning
- Lägg 4 volymer metanol: aceton (50:50) till en volym koncentrat och vortexblanda i 10 sek. Inkubera över natten vid -20 ° C.
- Centrifugera ner vid 17 tusen xg under 30 minuter. Dekantera supernatantenoch låt pellet (kan vara osynlig) torka i en speedvac under 1 timme (eller tills den är torr).
Obs: Dra inte torka pelleten eftersom detta kan göra det svårt att resuspendera. - Suspendera pelleten i 25 | il SDS-extraktionslösning. Låt sitta i en timme sedan resuspendera genom att pipettera upp och ned.
- Kvantifiera protein med användning av en proteinanalyssats och tillverkarens instruktioner.
4. DNA-Utfällning
- Lägg SDS-extraktionslösning till koncentratfraktionen som skall användas för DNA-utfällningen tills 500 pl märket. Detta steg är helt enkelt att öka volymen av lösningen, vilket gör det lättare att arbeta med.
- Lägg 0,583 volymer av en proteinutfällning reagens (såsom MPC proteinutfällning reagens) och vortexblanda i 10 sek. Du bör se en vit fällning form.
Obs: Vi har också använt fenol: kloroform-extraktion av DNA metoder, men det är svårare på grund av de låga volymerna. Vi fick bättre DNA avkastning med hjälp avMPC proteinutfällning reagens. - Centrifugera vid 17 tusen xg och 4 ° C under 10 minuter.
- Överför supernatanten till en annan 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 0,95 volymer isopropanol. Vänd 30-40 gånger.
- Centrifugera i 10 minuter vid 4 ° C vid maximal hastighet.
- Försiktigt dekantera och kassera supernatanten.
- Skölj två gånger med 750 pl av 70% etanol.
- Avlägsna så mycket etanol som möjligt genom pipettering, låt lufttorka.
Obs: Dra inte torka DNA eftersom detta kan göra det svårt att resuspendera. - Resuspendera i 25 ul av låg TE-buffert, pH 8 (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA).
- Kvantifiera DNA med en dsDNA analys-kit och tillverkarens instruktioner. Utför agarosgel (1%) elektrofores på 3 pl av DNA för att kontrollera dess kvalitet.
5. SDS-PAGE-gel av proteiner
- Bered provbuffert (950 | il Laemmli-provbuffert och 50 | il β-merkaptoetanol). </ li>
- Lägg den motsvarande volymen för 15 ^ g protein, eller ett max på 20 pl till lika stor volym av provbuffert och koka i 4 minuter. Prover kan nu lagras vid -80 ° C tills SDS-PAGE kan utföras.
- Bered 10% akrylamid upplösande gel med en 5% akrylamid uppstaplingsgelen.
- Fyll på gelén med prover och 4 ul av en proteinstege. Kör gelen vid konstant 120 V tills 250 kDa stege markör har precis nått upplösningsgelen.
- Fläck gelén med användning av en Coomassie bets enligt tillverkarens instruktioner.
6. I-gel Trypsin Digest och peptid Extraction
Obs: Alla steg härifrån tills 6,10 utförs i ett biologiskt säkerhetsskåp för att minimera kontaminering.
- Klipp bort överflödigt gel under 10 kDa stege märke för varje bana. Varje bana kommer att analyseras på MS / MS separat. Skär varje spår i 1 mm x 1 mm rutor för att öka ytan och placera alla torres från körfält till ett lågt bindande mikro centrifugrör. Upprepa detta för alla banor. (1% ättiksyra kan användas för att förhindra gelén från att torka ut och bli svårt att klippa).
Obs: Minimera förorening är avgörande i detta skede, så gelén skivning utförs i ett biologiskt säkerhetsskåp på glaset SDS-PAGE-gel form som används för att göra gelén. - De-fläck
- Dispensera 50 pl 100 mM ammonium-bikarbonat till varje låg-bindande röret, nära locket och inkubera vid 37 ° C under 10 minuter.
- Dispensera 50 ^ acetonitril, nära locket och inkubera vid 37 ° C under 5 minuter.
- Aspirera och kassera 150 pl.
- Upprepa steg 6.2.1 och 6.2.2.
- Aspirera och kassera 95 pl.
- Dehydrering
- Fördela 50 il acetonitril, stäng locket och vänta 5 min. Aspirera och kasta 45 pl och vänta 10 min.
- Reduktion
- Dispensera 50 pl DTT (10 mM, späddes i 100 mM ammonium bikarbonat), nära locket och vänta 30 min vid 37 ° C.
- Alkylering
- Dispensera 50 pl jodacetamid (55 mM, späddes i 100 mM ammoniumbikarbonat), nära locket och vänta 20 min vid 37 ° C.
- Dispensera 100 pl acetonitril, nära locket och inkubera i 5 min vid 37 ° C. Aspirera och kassera 195 pl.
- Tvätta
- Dispensera 50 pl ammoniumbikarbonat, nära locket och inkubera i 10 minuter vid 37 ° C.
- Dispensera 50 ^ acetonitril, nära locket och inkubera vid 37 ° C under 5 minuter. Aspirera och kassera 120 pl.
- Dehydrering
- Fördela 50 il acetonitril, stäng locket och vänta 5 min. Aspirera och kasta 45 ^.
- Fördela 50 il acetonitril, vänta 5 min.
- Aspirera och kasta 75 pl och vänta 5 minuter.
- Digerering
- Fördela 25-30 il 6 ng / mikroliter trypsin (until alla gelfragment täcks). Stäng locket och vänta 30 minuter vid rumstemperatur.
- Inkubera över natten (4,5 h minimum) vid 37 ° C.
- Låt stå vid rumstemperatur under 30 minuter.
- Extraktion och peptidtransfer
- Fördela 30 il extraktionslösning och täck med lock i 30 minuter på is.
- Aspirera 30 pl och fördela aspire volym i ett nytt märkt låg bindningsröret.
- Fördela 12 il extraktionslösning och 12 il acetonitril i den ursprungliga röret (med gel). Stäng locket och inkubera i 30 minuter på is.
- Aspirera 15 pl och insättning till nya röret.
- Upprepa steg (6.9.3 och 6.9.4).
- Placera nya rör i en SpeedVac tills det är torrt.
- Resuspendera i 50 fil resuspension lösning. Vortex på medium för 10 minuter för att resuspendera.
- Pipett peptidlösning i antingen nano / LC flaskor eller plattor med 96 brunnar som är lämpliga för nano / LCMS / MS-arbete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en demonstration genomförde vi protokollet om två havsvattenprover som samlats in från ytan och maximal klorofyll kust havet i norra Kanada. Till sjöss, var 6-7 liter havsvatten passera genom en 3 um GF / D förfilter, då mikrobiella celler samlades på ett 0,22 um patronfilter aggregatet enligt protokollet av Walsh et al. 20. Celler lagrades omedelbart i en RNA-stabiliseringslösning tills vidare bearbetning. På att gå till labbet, utförde vi protokollet som presenteras här. Den koncentrerade Cellysatet delades; protein fälldes ut från 90% av volymen, medan DNA utfälldes från den återstående 10% av volymen. Vi återhämtade 24-26 ^ g protein och 250-308 ng av högkvalitativt DNA från dessa prover (figur 1). Efter in-gel trypsinspjälkning och peptid utvinning, vi utsattes peptiderna till MS / MS-analys med hjälp av en nano-LC kopplat till Orbitrap Elite masspektrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Från peptiderna, vi genererat över 23.000 MS / MS-spektra per prov. Peptider och proteiner identifierades sedan genom att söka dessa spektra mot en anpassad internt sekvensdatabas med hjälp av topparna bioinformatik verktyget (BSI, Waterloo, ON, Kanada). Databasen består av förutsagda proteiner från marina referens genom och metagenomes. Sökningen resulterade i identifiering av cirka 1000 peptider och 700-800 proteiner för varje prov. Naturligtvis är dessa resultat är beroende av mikrobiell cell överflöd, MS instrumentering, och proteinökning databas och algoritmer. Trots dessa resultat visar att detta protokoll har potential att producera tillräckliga tryptiska peptider som är lämpliga för att identifiera hundratals proteiner i miljön. Eftersom metagenomic bibliotek kan konstrueras från så lite som 100 ng DNA 30, har detta protokoll också potential att ge tillräckliga mängder av DNAatt generera matchade metagenomic-metaproteomic datamängder.
Taxonomisk och funktionell sammansättning metaproteomes analyserades med användning av en kombination av BLASTP och MEGAN (Metagenome analysator) programpaket 31,32 (Figur 2). Proteiner tilldelats Alpha-Proteobacteria var den mest representerade i datamängden, de allra flesta som tilldelas SAR11 claden. Den Rhododobacterales clade Alpha-Proteobacteria var också mycket representerade och pekas oftast i ytvatten. Proteiner som tilldelats Bacteroidetes var jämnt fördelade mellan maximal yta och klorofyll, men Flavobacteria proteiner identifierades i större utsträckning på högsta klorofyll. Gamma-proteobacterial proteiner jämnt fördelade över hela vattenmassan medan Beta-proteobacterial proteiner påträffades huvudsakligen i ytan . Frånett funktionellt perspektiv, var ett stort antal av metaboliska vägar som identifierats. Vertikal strukturering av dessa metaboliska vägar var uppenbar. Till exempel, var proteiner associerade med aminosyrametabolismen, kolhydratmetabolismen och prokaryota kol fixeringsvägar identifieras främst på ytan, och kvävemetabolism konstaterades endast på ytan. Fotosyntetiska kol fixerings proteiner observerades i första hand vid den maximala klorofyll medan proteiner involverade i fotosyntesen identifierades jämnt mellan ytan och klorofyll maximum. Dessa resultat visar att ett stort antal olika proteiner från en mångfald av mikrobiell taxa kan detekteras med användning av protokollet som presenteras här.
Figur 1:. Genomisk DNA från 2 djup på Arctic station S633 Den första banan innehåller 4 il av en 1 kb DNA-ladderare, spår 2 innehåller 3 | il av genom-DNA-extraktion från S633_2 m, spår 3 innehåller 3 | il av genom-DNA-extraktion från S633_20 m och banorna 4-6 innehåller 0,5 | il (85 ng), 2 | il (333 ng) och 4 pl ( 667 ng) i Hindlll-klyvd lambda-DNA.
Figur 2:. Taxonomiska och funktionell analys av 2 djup vid Arctic station S633 jämförelse Taxonomisk mångfald av de arktiska station 633 yta och klorofyll högsta vatten (A) som skapats med MEGAN. Funktionell jämförelse mångfald av de arktiska station 633 yta och klorofyll högsta vatten (B) skapats med MEGAN att fråga mot Kegg databasen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prov bevarande är nyckeln till metaproteomic studier och tidigare arbete visade att en RNA-stabilisering lösning är ett användbart minnesbuffert för att lagra celler före proteinextraktion 28. Helst skulle proverna bevaras in situ för att hindra förändringar i proteinuttryck under hantering 33,34. I själva verket, in situ provtagning och fixeringsteknik har utvecklats, som gör det möjligt för den autonoma insamling och bevarande av proverna från fartygs utplacerade instrument. Dock är tillgång till dessa tekniker inte alltid möjligt. I det vanliga fallet att det inte bör proverna bevaras så snart som möjligt efter provtagningen.
Här presenterar vi ett protokoll för att extrahera protein från RNA stabiliseringslösning lagrade celler som samlats på en patronfilterenhet, som vanligtvis används i vatten mikrobiologi. Protokollet inkluderar cellys med användning av en SDS-lys-lösning och värme, följt av en protein koncentrationssteg med hjälp av ultracentrifugal filterenheterna som fördubblats som ett nödvändigt avsaltningssteg. Det bör noteras att de koncentrerar sig och avsaltningssteg inte kan förbises. Vi fann att minst tre buffertutbytessteg krävdes för att avsalta vår koncentrat. På grund av den höga saltkoncentrationen i RNA-stabilisering lösning, om korrekt avsaltning inte sker, för mycket salt kommer att utfällas under nattens proteinutfällning steget och avsaltning och utfällningssteget måste upprepas. Dessutom, om avsaltning inte genomförs tillfredsställande 1D-PAGE inte kommer att fungera och proverna kommer att gå förlorade.
Därefter tillsattes den koncentrerade lysatet delas så att både proteinutfällning och DNA utfällning kunde utföras. Detta är användbart eftersom det ofta är önskvärt att metagenomic och metaproteomic data tas fram från samma prover. Om ett protein inte är representerad i proteinsekvensdatabasen sedan peptiden kommerinte kan identifieras. Inklusive genetiska data från samma prov som proteomic uppgifter minskar risken att inte kunna identifiera ett protein på grund av sin frånvaro från databasen.
Även om detta protokoll var optimerad för användning med patron filterenheter och valideras för att arbeta på kust havet mikrobiella samhällen, kan det anpassas för användning med andra typer av prover och filter miljö. Det bör dock klart framgå att framgången för detta protokoll är beroende av en tillräcklig mängd utgångs biomassa. Därför i akvatiska ekosystem där biomassa kan vara mycket lågt, rekommenderar vi att öka volymen av vatten filtreras därefter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2 ml ROBO vial 9 mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
References
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
- Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).
- Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972 (1986).
- Williams, T. J., Long, E., et al. A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters. The ISME journal. 6 (10), (2012).
- Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics. Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).
- Venter, J. C., Remington, K., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).
- Tyson, G. W., Chapman, J., et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 428, 37-43 (2004).
- Schneider, T., Riedel, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities. Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).
- Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology. The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).
- Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al. Proteorhodopsin in the ubiquitous marine bacterium SAR11. Nature. 438 (7064), 82-85 (2005).
- Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton. The ISME journal. , 1-13 (2014).
- Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).
- Williams, T. J., Cavicchioli, R. Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web. Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).
- Saito, M. a, McIlvin, M. R., et al. Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers. Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).
- Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton. Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).
- Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. Methods in enzymology. 531, Elsevier Inc. 305-329 (2013).
- Da Walsh,, Zaikova, E., Hallam, S. J. Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples. Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).
- Thompson, M., Chourey, K. Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples. Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).
- Lu, X., Digestion Zhu, H. Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).
- Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization. Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).
- Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. Genomic and proteomic characterization of "Candidatus Nitrosopelagicus brevis": An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).
- Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS biology. 5 (3), e77 (2007).
- Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean. Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).
- Rinke, C., Schwientek, P., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection. Frontiers in microbiology. 2, 215 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).
- Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. Metagenomics - a guide from sampling to data analysis. Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).
- Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. MEGAN analysis of metagenomic data. Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).
- Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4. Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).
- Ea Ottesen,, Marin, R., et al. Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton. The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).
- Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system. The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).
