Introduction
מיקרואורגניזמים נמצאים בכל מקום ולשחק תפקידים חיוניים במחזורי biogeochemical של כדור הארץ 1. נכון לעכשיו, יש גישות מולקולריות רבות זמינות לאפיון מבנה קהילת חיידקים ותפקוד. הנפוץ ביותר הוא הניתוח של גן 16S rRNA רצפי PCR-מוגבר מ- DNA הסביבתי 2 - 4. חסרון של ניתוח גנטי 16S rRNA הוא שזה רק מספק מידע על זהות פילוגנטי ומבנה קהילה, עם מעט מידע על תפקוד מטבולים. לעומת זאת, גישות כגון metagenomics, metatranscriptomics וmetaproteomics לספק מידע על מבנה קהילה וחילוף חומרים. Metagenomics, או הניתוח של תוכן הגן של מכלול של אורגניזמים, מספק מידע על המבנה ואת הפוטנציאל התפקודי של הקהילה 5 - 8. למרות עוצמה, פוטנציאל פונקציונלי זה לא מתאים מטבוליםפעילות של אורגניזמים. גנוטיפ של האורגניזם מיוצג על ידי הגנים שלו, כל אחד מהם יכול להיות עיבד ותרגמו לרנ"א לחלבון נוסף, וכתוצאה מכך פנוטיפ. לכן, כדי לסייע בהבנה של פעילות פונקציונלית של חיידקים בסביבה, ניתוח שלאחר הגנומי צריך להתבצע 9. Metatranscriptomics, או הניתוח של תעתיקי רנ"א הוא שימושי משום שהוא חושף שגנים מתועתקים בכל סביבת נתונה. עם זאת, רמות ה- mRNA לא תמיד תואמות את רמות החלבון המתאימים בשל רגולציה translational, RNA מחצית חיים, והעובדה שעותקים חלבון מרובים יכולים להיות שנוצרו עבור כל mRNA 10.
לmetaproteomics מסיבות אלה מוכר כיום ככלי חשוב למיקרוביולוגיה הסביבתית. הנפוץ metaproteomic מנתח להשתמש בגישת proteomic רובה שבו ההשלמה מלאה ליד של חלבונים במדגם מורכב הם מטוהרים ונותחה בו-זמנית, בדרך כלל באמצעות enעיכול zymatic לפפטידים וניתוח על ספקטרומטר מסה. ספקטרומטר מסת טנדם לאחר (MS / MS) "טביעת אצבע פפטיד" משמשת כדי לקבוע את רצף הפפטיד וחלבון פוטנציאלי ממוצא ידי מסד נתוני חלבון חיפוש (לסקירה ראה 11). עבודת proteomic יש כברת דרך ארוכה ב -25 השנים האחרונות הודות לעלייה בזמינויות הנתונים הגנומי והעלייה ברגישות והדיוק של ספקטרומטרים המוניים המאפשרים זיהוי חלבון תפוקה גבוהה וכימות 11,12. מאז חלבונים הם המוצר הסופי של ביטוי גנים, נתונים metaproteomic יכולים לעזור לקבוע אילו אורגניזמים פעילים בכל סביבה ומה חלבונים הם מביעים נתון. זהו יתרון כאשר מנסים לקבוע איך קבוצה מסוימת של משתנים סביבתיים תשפיע על הפנוטיפ של האורגניזם או קהילה. בשלב מוקדם, מחקרי metaproteomic מבוססי MS MS / בים היו משמשים לזיהוי חלבונים ספציפיים בממוקדשושלות חיידקים, עם המחקר הראשון מתמקד בproteorhodopsin משאבת פרוטון האור מונע בחיידקים הימיים SAR11 13. לאחרונה, ניתוחי metaproteomic השוואתיים שהובהרו דפוסי ביטוי חלבון ההפרש בין קהילות מורכבות. דוגמאות כוללות זיהוי של משמרות זמניות בחילוף חומרים בצפון-מערב האוקיינוס האטלנטי חוף 14 או חצי האי האנטארקטי 5. מחקרים אחרים תיארו שינויים בדפוסי ביטוי חלבון על פני קשקשים מרחבית, למשל, לרוחב, גיאוגרפי מסיבובי אוקיינוס נמוך תזונתיים למערכת upwelling חוף פרודוקטיבי 15. לביקורות נוספות של metaproteomics אנו ממליצים שניידר et al. (2010) 9 ווויליאמס et al. (2014) 16. פרוטאומיקה ממוקדת גם הועסקה בשנים האחרונות לכמת ביטוי של מסלולי מטבוליים מסוימים בסביבה 17,18.
Therדואר שלושה שלבים עיקריים בניתוח metaproteomic. השלב הראשון הוא הכנת מדגם, הכוללת איסוף דגימה, תמוגה תא וריכוז של חלבון. אוסף מדגם במיקרוביולוגיה הימית לעתים קרובות כרוך בסינון של מי ים דרך מראש מסנן כדי להסיר תאים גדולים יותר אוקריוטים, חלקיקים וחיידקים הקשורים חלקיקים, ואחרי סינון ללכידתו של תאי חיידקי חיים חופשיים, בדרך כלל עם השימוש במחסנית 0.22 מיקרומטר יחידת מסנן 19,20. מסננים אלה עטויות כפפה בגליל פלסטיק ותמוגה תא ופרוטוקול מיצוי חלבון שניתן לבצע בתוך יחידת המסנן יהיה כלי רב ערך. ברגע שמתקבלת ביומסה, התאים חייבים להיות lysed כדי לאפשר מיצוי חלבון. יכולים להיות מועסקים במספר שיטות, כולל סולפט guanidine-HCl dodecyl תמוגה 21 ונתרן (SDS) שיטות תמוגה מבוססות. למרות שחומרי ניקוי כמו SDS הם מאוד יעילים בשיבוש קרומים וsolubilizing סוגים רבים חלבון, concentratiONS נמוך כמו 0.1% יכולים להפריע לעיכול חלבון במורד הזרם וניתוח MS 22. דאגה עיקרית הוא ההשפעות השליליות של SDS על יעילות עיכול טריפסין, פתרון כוח של כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה שלב ודיכוי יון או הצטברות בתוך יון המקור 23.
השלב השני הוא חלוקה וניתוח, שבו חלבוני נתונים לעיכול אנזימטי ואחרי ניתוח LC MS / MS, וכתוצאה מכך דפוס פיצול בבוקר / z שניתן להשתמש בי לברר את רצף חומצות אמינו העיקרי של הפפטיד tryptic הראשוני. ניתן לבצע שיטות עיכול שונות בהתאם לסוגים של חומרי ניקוי המשמשים, כמו גם את העבודה ספקטרומטר מסה במורד הזרם. בפרוטוקול שלנו, אלקטרופורזה עמוד 1-D ואחריו ההסרה של SDS מג'ל מנוצלת כדי להסיר כל זיהום חומר ניקוי. הניתוח של חלבונים שקשה solubilize, כגון חלבוני קרום, מחייב השימוש גבוה concentrations של SDS או חומרי ניקוי אחרים. זה מוביל לבעיות תאימות עם אלקטרופורזה SDS-ג'ל. אם מטרתו של מחקר דורשת solubilization קשה אלה לsolubilize חלבונים, מערכת הצינור-ג'ל ניתן להשתמש 22,24. שיטת הצינור-ג'ל משלבת חלבונים בתוך מטריצת ג'ל ללא השימוש באלקטרופורזה. בהמשך לכך כל חומרי ניקוי המשמש לsolubilization יוסרו לפני עיכול חלבון.
השלב השלישי הוא ניתוח bioinformatic. בשלב זה נתונים פפטיד MS / MS הם חיפשו מול מסד נתונים של רצפי נוקליאוטידים תרגמו כדי לקבוע אילו פפטידים וחלבונים נמצאים במדגם. זיהוי של פפטידים תלוי בבסיס הנתונים שהוא חיפש נגד. נתונים metaproteomic ימיים חיפשו נפוצים מול מסדי נתונים מורכבים מהגנום התייחסות, נתונים metagenomic כגון בסיס הנתונים הגלובלי אוקיינוס דגימת 25, כמו גם הגנום תא מוגבר אחד מli הבורneages 26,27. זיהוי חלבון גם יכול להיות מוגבר על ידי ההכללה של רצפי metagenomic מאותו המדגם נתונים metaproteomic נגזר 5.
כאן אנו מספקים פרוטוקול עבור הדור של פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס MS MS / ביומסה חיידקים שנאספו על ידי סינון ומאוחסנים בפתרון ייצוב RNA. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לדנ"א וחלבון להיות מבודדים מאותו המדגם, כך שכל הצעדים שהובילו לחלבון ומשקעי DNA זהים. מנקודת מבט מעשית, נדרש פחות סינון שכן רק אחד מסנן נדרש לחלבון וגם מיצוי DNA. אנחנו רוצים גם להודות שפרוטוקול זה נוצר באמצעות שילוב, עיבוד והשינוי של שני פרוטוקולים שפורסמו בעבר. צעדי תמוגה התא מותאמים מאל סאיטו et. (2011) 28 וטריפסין ב- ג'ל לעכל רכיב מותאם ShevcheNKO et al. (2007) 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכן ריאגנטים
- הכן פתרון SDS-חילוץ: 0.1 M טריס- HCl pH 7.5, גליצרול 5%, 10 mM EDTA ו -1% SDS. מסנן לעקר באמצעות מסנן וחנות 0.22 מיקרומטר על 4 מעלות צלזיוס.
- הכן ריאגנטים מניות דרושים לג'ל polyacrylamide.
- הכן 1.5 M טריס-HCl pH 8.8. מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורת חדר.
- 0.5 M טריס-HCl pH 6.8. מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורת חדר.
- הכן 10% SDS. סנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורת חדר.
- הכן את הפתרונות דרושים בג'ל טריפסין לעכל ומיצוי פפטיד.
- הכן 100 אמוניום ביקרבונט מ"מ. מסנן לעקר באמצעות מסנן וחנות 0.22 מיקרומטר על 4 מעלות צלזיוס.
- הכן 1 מניות M DTT. מושעה באמוניום ביקרבונט 100 מ"מ ולאחסן ב -80 ° C.
- הכן 550 מ"מ מניות iodoacetamide. מושעה ב100 מ"מ אמוניום ביקרבונט ולאחסן ב -80 ° C.
- הכן 100 ng / μl מניות טריפסין. Aliquot 60 μl לתוך צינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge וחנות ב -80 ° C.
- הכן פתרון חילוץ: 1% חומצה פורמית, אצטוניטריל 2%.
- הכן פתרון resuspension: אצטוניטריל 5% ושל 0.1% חומצה פורמית.
.2 בצע תא תמוגה ביחידת מסנן מחסנית עם תאים משומרים בRNA ייצוב הפתרון
- לגרש את פתרון ייצוב RNA מיחידת מסנן מחסנית (1.5 מיליליטר) ולתוך צינור microcentrifuge 2 מיליליטר באמצעות מזרק 60 מיליליטר המצורף בסוף luer נעילה של המסנן.
- צנטריפוגה צינור microcentrifuge 2 מיליליטר במשך 10 דקות ב 17,000 XG כדי גלולה כל פסולת סלולרית. זה נעשה כך שהמסנן בשלב 2.3 לא לסתום.
- העברת supernatant ליחידת 10 K מסנן ultracentrifugal כדי ללכוד כל חלבונים שמקורם מהתאים שlysed מההקפאה / thaw של המדגם. לא זורק את הכדור. זה ישמש בשלב 2.5. בצע צנטריפוגה של יחידת מסנן ultracentrifugal ב3,270 XG למשך 30 דקות או עד שהנפח מופחת לכ -600 μl.
- ממסים את קצה קצה P10 ולחסום את צד luer הנעילה שאינה של יחידת מסנן מחסנית עם הסוף הפתוח של הקצה. הפעולה זו תבטיח כי אין חיץ חילוץ וביומסה נמלט במהלך שלבים 2.5-2.7.
- להשעות את גלולה ב 1 מיליליטר פתרון SDS-חילוץ ופיפטה אותו ליחידת מסנן מחסנית המקורית. הדרך הקלה ביותר פיפטה ליחידת מסנן המחסנית היא מחסנית קצה p200 על קצה P1000 ולהשתמש הקצה הכפול הזה לpipetting.
- הוסף 1 מיליליטר של תמיסת מיצוי SDS ליחידת מסנן מחסנית כך הנפח הכולל הוא כ 2 מיליליטר ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר תוך סיבוב בתנור הכלאה. מניחים 3 מעבדה מקומטת מגבונים בחלק התחתון של צינור חרוטי 50 מיליליטר. Parafilm שני הקצוות של יחידת מסנן מחסנית הסגורולשים את יחידת מסנן מחסנית לתוך שפופרת 50 מיליליטר. סגור את המכסה ולשים את הצינור לתנור ההכלאה.
- לאחר 10 דקות מקום Sterivex לסנן על מצוף קצף ולאבטח אותו במקום עם מזרק 5 מיליליטר בסוף luer נעילה. לצוף ודגירה במי אמבטיה 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- בואו יחידת מסנן מחסנית מגניב ולסובב בטמפרטורת חדר במשך שעה 1 (כמו בשלב 2.6).
- לגרש את lysate פתרון חילוץ / תא SDS מתוך המסנן עם מזרק 60 מ"ל לאותה יחידת מסנן ultracentrifugal כמו קודם (שלב 2.3). הוסף 1 מיליליטר של תמיסת מיצוי הטרי SDS ליחידת מסנן מחסנית ולערבב למשך 30 שניות ביד, אז לגרש לתוך יחידת מסנן ultracentrifugal באמצעות מזרק 60 מיליליטר. זה לשטוף את יחידת מסנן מחסנית כדי להבטיח את כל החלבונים הוסרו.
- בצע צנטריפוגה על יחידת מסנן ultracentrifugal במשך 45 דקות ב 3,270 XG או עד הנפח ביחידת המסנן הוא פחות מ -600 μl.
- זרימה דרך מחק ועליון את יחידת מסנן ultracentrifugal עם פתרון SDS-מיצוי טרי.
- צנטריפוגה יחידת המסנן לעוד 45 דקות ב3,270 x גרם.
- חזור על שלבים 2.11 2.12 ועוד פעמיים. להבטיח את הנפח הסופי ביחידת מסנן ultracentrifugal הוא לכל היותר 600 μl בסוף הסיבוב האחרון.
- בשלב זה, לפצל את התרכיז בשני. חלק אחד ישמש למשקעי DNA ואחר למשקעי חלבון.
הערה: סכום חלוקה תלוי בכמות של ביומסה שהיה מסוננת והשימושים המיועדים של המוצרים. במקרה שלנו, אנו לפצל את התרכיז עם 10% כלפי המשקעים DNA ו- 90% למשקעי חלבון.
רטיבות 3. חלבון
- להוסיף מתנול 4 כרכים: אצטון (50:50) לכרך אחד של תרכיז ומערבולת למשך 10 שניות. דגירה הלילה ב -20 ° C.
- ספין למטה ב17,000 XG למשך 30 דקות. למזוג supernatantולתת גלולה (עשויה להיות בלתי נראה) יבשה בspeedvac עבור שעה 1 (או עד יבש).
הערה: אל מעל לייבש את גלולה כמו זה עלול להקשות על resuspend. - להשעות את גלולה ב 25 μl של פתרון SDS-חילוץ. בואו לשבת במשך שעה אחת לאחר מכן resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה.
- לכמת חלבון באמצעות ערכת assay חלבון והוראות יצרנים.
4. DNA רטיבות
- להוסיף פתרון SDS-חילוץ לשבריר להתרכז לשמש למשקעי DNA עד סימן 500 μl. צעד זה הוא פשוט להגביר את עוצמת הקול של הפתרון, מה שהופך את זה יותר קל לעבוד עם.
- להוסיף .583 כרכים של מגיב משקעים חלבון (כגון מגיב MPC חלבון המשקעים) ומערבולת למשך 10 שניות. אתה צריך לראות את צורת משקע לבנה.
הערה: יש לנו גם משמשים פנול: שיטות מיצוי DNA כלורופורם, אבל זה קשה יותר בשל ההיקפים הנמוכים. השגנו תשואות טובות יותר באמצעות DNAחלבון MPC רטיבות מגיב. - צנטריפוגה ב 17,000 XG ו4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- העברת supernatant לעוד צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולהוסיף 0.95 כרכים של isopropanol. היפוך 30-40 פעמים.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס במהירות המרבית.
- למזוג בזהירות וזורקים supernatant.
- יש לשטוף פעמיים עם 750 μl של 70% אתנול.
- להסיר כמה שיותר אתנול ככל האפשר על ידי pipetting, אז תן אוויר יבש.
הערה: אל מעל לייבש את ה- DNA שכן דבר עלול להקשות על resuspend. - Resuspend ב 25 μl של חיץ נמוך TE, pH 8 (10 מ"מ טריס-HCl, 0.1 מ"מ EDTA).
- לכמת את ה- DNA באמצעות ערכת assay dsDNA והוראות יצרנים. בצע agarose ג'ל (1%) אלקטרופורזה על 3 μl של ה- DNA כדי לבדוק את האיכות שלה.
5. SDS-PAGE ג'ל של חלבונים
- הכן חיץ מדגם (חיץ מדגם Laemmli 950 μl ו -50 β-mercaptoethanol μl). </ Li>
- להוסיף הנפח המתאים במשך 15 מיקרוגרם של חלבון, או מקסימום של 20 μl לנפח שווה של חיץ מדגם ולהרתיח במשך 4 דק '. כעת ניתן לאחסן דגימות ב -80 ° C עד יכול להתבצע SDS-PAGE.
- הכן ג'ל פתרון 10% acrylamide עם 5% ג'ל לערום acrylamide.
- טען את הג'ל עם דגימות ו -4 μl של סולם חלבון. הפעל את הג'ל על 120 קבועים V עד סמן סולם kDa 250 יש רק הגעתי לג'ל הפתרון.
- כתם ג'ל באמצעות Coomassie כתם על פי הוראות יצרנים מבוססים.
6. בג'ל טריפסין לעכל ופפטיד הפקה
הערה: כל צעדים מכאן עד 6.10 מבוצעים בארון בטיחות ביולוגי כדי למזער זיהום.
- חותך את הג'ל עודף תחת סימן סולם kDa 10 לכל מסלול. כל מסלול ינותח על MS / MS בנפרד. חותך כל נתיב למ"מ x ריבועי 1 מ"מ 1 להגדיל שטח פנים ולמקם את כל squaמיל מהנתיב לתוך צינור מיקרו צנטריפוגות מחייב נמוך. חזור על פעולה זו עבור כל הנתיבים. (1% חומצה אצטית יכולה לשמש כדי למנוע את הג'ל מהתייבשות והופך קשה לחתוך).
הערה: מזעור זיהום הוא קריטי בשלב זה, כך חיתוך ג'ל מתבצע בארון בטיחות ביולוגי בתבנית ג'ל זכוכית SDS-PAGE משמש כדי להפוך את הג'ל. - דה-כתם
- לוותר 50 μl של 100 אמוניום ביקרבונט מ"מ לתוך צינור אחד מחייב נמוך, כובע קרוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לוותר 50 μl של אצטוניטריל, כובע קרוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- לשאוב ולזרוק 150 μl.
- חזור על שלבים 6.2.1 ו6.2.2.
- לשאוב ולזרוק 95 μl.
- התייבשות
- לוותר 50 אצטוניטריל μl, קרוב כובע ולחכות 5 דקות. לשאוב ולזרוק 45 μl ולחכות 10 דקות.
- הפחתה
- לוותר 50 μl DTT (10 מ"מ, בדילול מלא 100 מ"מ AMMביקרבונט onium), קרוב כובע ולחכות 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- אלקילציה
- לוותר iodoacetamide 50 μl (55 מ"מ, בדילול מלא 100 אמוניום ביקרבונט מ"מ), קרוב כובע ולחכות 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- לוותר של אצטוניטריל, כובע קרוב 100 μl ודגירה של 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לשאוב ולזרוק 195 μl.
- לשטוף
- לוותר אמוניום ביקרבונט 50 μl, קרוב כובע ודגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- לוותר 50 μl של אצטוניטריל, כובע קרוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לשאוב ולזרוק 120 μl.
- התייבשות
- לוותר 50 אצטוניטריל μl, קרוב כובע ולחכות 5 דקות. לשאוב ולזרוק 45 μl.
- לוותר 50 μl של אצטוניטריל, לחכות 5 דקות.
- לשאוב ולזרוק 75 μl ולחכות 5 דקות.
- עיכול
- לוותר 25-30 μl של 6 ng / μl טריפסין (until כל שברי ג'ל מכוסים). כובע ולסגור לחכות 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- דגירה הלילה (מינימום 4.5 שעות) על 37 מעלות צלזיוס.
- בואו לשבת בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
- חילוץ והעברת פפטיד
- לוותר 30 μl של פתרון חילוץ ולכסות עם מכסה למשך 30 דקות על קרח.
- לשאוב 30 μl ולוותר נפח aspirated בצינור מחייב נמוך שכותרתו חדש.
- לוותר 12 μl של פתרון חילוץ ו -12 μl של אצטוניטריל לתוך הצינור המקורי (עם ג'ל). כובע ולסגור דגירה במשך 30 דקות על קרח.
- μl לשאוב 15 והפקדה לתוך הצינור החדש.
- חזרו על שלבים (6.9.3 ו6.9.4).
- מניחים צינורות חדשים בSpeedVac עד יבש.
- Resuspend ב 50 μl של פתרון resuspension. מערבולת במדיום במשך 10 דקות כדי resuspend.
- פתרון פפטיד פיפטה לאו ננו בקבוקונים / LC או 96-גם צלחות מתאימים לננו / LCעבודת MS / MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כהפגנה, שבצענו את הפרוטוקול בשתי דגימות מי ים שנאספו מפני השטח ומקסימום כלורופיל של אוקיינוס החוף בצפון קנדה. בעוד בים, 6-7 ליטר של מי ים עבר דרך prefilter / GF D 3 מיקרומטר, אז תאי חיידקים נאספו על יחידת מסנן מחסנית 0.22 מיקרומטר הבא הפרוטוקול של et al וולש. 20. תאים אוחסנו באופן מיידי בפתרון ייצוב RNA עד עיבוד נוסף. לאחר חזרתו למעבדה, ביצענו הפרוטוקול כפי שהוא מוצג כאן. Lysate התא המרוכז היה מחולק; חלבון זירז מ -90% מהנפח, ואילו ה- DNA היה זירז משאר 10% מההיקף. אנחנו התאוששתי 24-26 מיקרוגרם של חלבון ו250-308 ng של DNA באיכות גבוהה מדגימות אלה (איור 1). לאחר, שנתון ב- ג'ל עיכול טריפסין ומיצוי פפטיד פפטידים לניתוח MS / MS באמצעות ננו-LC מצמידים אלי Orbitrapספקטרומטר מסת te (תרמו פישר סיינטיפיק, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב). מפפטידים, אנחנו שנוצרנו מעל 23,000 ספקטרום MS / MS לדגימה. פפטידים וחלבונים זוהו לאחר מכן על ידי חיפוש ספקטרום אלה מול מסד נתוני רצף בבית מותאם אישית באמצעות כלי ביואינפורמטיקה הפסגות (BSI, ווטרלו, ON, קנדה). מסד הנתונים מורכבים מחלבונים חזו מהגנום התייחסות ימי וmetagenomes. החיפוש הביא לזיהוי של כ -1,000 פפטידים וחלבונים 700-800 לכל דגימה. באופן טבעי, תוצאות אלה תלויות בשפע חיידקי תא, מכשור MS, ובסיס נתוני חיפוש חלבון ואלגוריתמים. עם זאת, תוצאות אלו מראות כי יש פרוטוקול זה הפוטנציאל לייצר פפטידים tryptic הולמים מתאימים ללזהות מאות חלבונים בסביבה. יתר על כן, מאז ניתן לבנות ספריות metagenomic מ קטן כמו 100 ננוגרם של 30 DNA, פרוטוקול זה יש גם פוטנציאל לספק כמות מספקת של ה- DNAכדי ליצור מערכי נתונים metagenomic-metaproteomic מתאים.
הרכב הטקסונומי ופונקציונלי של metaproteomes נותח באמצעות שילוב של BLASTp ומייגן 31,32 חבילת תוכנה (Metagenome המנתח) (איור 2). חלבונים שהוקצו לאלפא-proteobacteria היו, רובם המכריע של אשר חולקו מיוצג בבסיס הנתונים גבוה ביותר לclade SAR11. Clade Rhododobacterales של אלפא-proteobacteria גם מיוצג ביותר ומזוהה ביותר לעתים קרובות במים עיליים. חלבונים שהוקצו לBacteroidetes חולקו באופן שווה בין מקסימום השטח וכלורופיל, אבל חלבוני Flavobacteria זוהו במידה רבה יותר במקסימום כלורופיל. חלבוני Gamma-proteobacterial חולקו באופן שווה בכל עמודת המים תוך חלבוני ביתא-proteobacterial נמצאו ברובה בשטח . מנקודת מבט פונקציונלית, מגוון רחב של מסלולי מטבוליים זוהו. מבנה אנכי של מסלולים מטבוליים אלה היה ברור. לדוגמא, חלבונים הקשורים לחילוף חומרים של חומצות אמינו, מטבוליזם של פחמימות ומסלולי קיבוע פחמן פרוקריוטים זוהו בעיקר על פני השטח, וחילוף חומרי חנקן נמצא באופן בלעדי על פני השטח. חלבוני קיבוע פחמן פוטוסינתזה נצפו בעיקר במקסימום כלורופיל ואילו חלבונים מעורבים בתהליך הפוטוסינתזה זוהו באופן שווה בין המשטח ומקסימום כלורופיל. תוצאות אלו מראות כי מגוון רחב של חלבונים ממגוון של מיני חיידקים יכול להיות מזוהה באמצעות הפרוטוקול שהוצג כאן.
איור 1:. הדנ"א הגנומי ממעמקים 2 בתחנה הארקטי S633 הנתיב הראשון מכיל 4 μl של l DNA KB 1האפעה, מסלול 2 מכיל 3 μl של מיצוי DNA גנומי ממ 'S633_2, מסלול 3 מכיל 3 μl של מיצוי DNA גנומי ממ' S633_20 ונתיבים 4-6 מכילים 0.5 μl (85 ng), 2 μl (333 ng) ו -4 μl ( 667 ng) של HindIII מתעכל DNA למבדה.
איור 2:. ניתוח טקסונומי ופונקציונלי של 2 מעמקים בתחנה הארקטי S633 השוואת גיוון טקסונומי של תחנת 633 מים מרבי משטח וכלורופיל הארקטי () שנוצר באמצעות מייגן. השוואת גיוון פעילות של תחנת 633 מים מרבי משטח וכלורופיל הארקטי (ב ') שנוצרו באמצעות מייגן שאילתה מול מסד נתוני KEGG. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שימור דגימה הוא מפתח ללימודי metaproteomic והעבודה קודמת הוכיחה כי פתרון ייצוב RNA הוא חיץ אחסון שימושי לאחסון תאים לפני מיצוי חלבון 28. באופן אידיאלי, דגימות תישמרנה באתר לשלול משמרות בביטוי חלבון במהלך טיפול 33,34. למעשה, באתר טכנולוגיות דגימה וקיבעון פותחו, המאפשרות לאוסף האוטונומי והשימור של דגימות על ידי מכשירים לפרוס ספינה. עם זאת, גישה לטכנולוגיות אלה היא לא תמיד אפשרית. במקרה השכיח שזה לא, יש לשמר דגימות בהקדם האפשרי לאחר איסוף.
כאן אנו מציגים פרוטוקול לחילוץ חלבון מתאי פתרון מאוחסן ייצוב RNA שנאספו על יחידת מסנן מחסנית, המשמשת בדרך כלל במיקרוביולוגיה הימית. הפרוטוקול כולל תמוגה תא באמצעות פתרון SDS-תמוגה וחימום, ואחריו יחסי ציבורצעד ריכוז otein באמצעות יחידות מסנן ultracentrifugal שהוכפלו כצעד הכרחי desalting. יש לציין כי לא ניתן להתעלם צעדי הריכוז וdesalting. מצאנו כי מינימום של שלושה שלבי חילופי חיץ נדרש desalt התרכיז שלנו. בשל ריכוז מלח הגבוה של פתרון ייצוב RNA, אם desalting הנכון אינו מתרחש, יותר מדי מלח יהיה זירז במהלך שלב משקעים חלבון הלילה וצעד desalting והמשקעים יצטרך לחזור. בנוסף, אם התפלה אינה מבוצעת כראוי 1D-עמוד לא יעבוד והדגימות יאבדו.
בשלב הבא, lysate המרוכז היה מחולק כך ששניהם משקעים חלבון ומשקעים DNA יכולים להתבצע. זה שימושי כפי שהוא לעתים קרובות רצוי שנתוני metagenomic וmetaproteomic להיות שנוצרו מאותו הדגימות. אם חלבון אינו מיוצג באתר רצף חלבון פפטיד יהיהלא להיות מזוהה. כולל את הנתונים הגנומי מאותו המדגם נתונים proteomic מפחיתים את הסיכון של לא להיות מסוגל לזהות חלבון בשל היעדרותו מבסיס הנתונים.
למרות שפרוטוקול זה מותאם לשימוש עם יחידות מסנן מחסנית ומאומתים לעבוד על קהילות חיידקי אוקיינוס החוף, זה יכול להיות מותאם לשימוש עם סוגים אחרים של דגימות ומסננים סביבתיים. עם זאת, זה צריך להיות ברור כי ההצלחה של פרוטוקול זה תלויה בכמות מספקת של מתחיל ביומסה. לכן במערכות אקולוגיות ימיות שבו ביומסה עשויה להיות נמוכה מאוד, אנו ממליצים להגדיל את נפח מים המסוננים בהתאם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2 ml ROBO vial 9 mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
References
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
- Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).
- Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972 (1986).
- Williams, T. J., Long, E., et al. A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters. The ISME journal. 6 (10), (2012).
- Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics. Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).
- Venter, J. C., Remington, K., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).
- Tyson, G. W., Chapman, J., et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 428, 37-43 (2004).
- Schneider, T., Riedel, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities. Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).
- Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology. The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).
- Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al.
- Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton. The ISME journal. , 1-13 (2014).
- Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).
- Williams, T. J., Cavicchioli, R. Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web. Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).
- Saito, M. a, McIlvin, M. R., et al. Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers. Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).
- Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton. Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).
- Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. Methods in enzymology. 531, Elsevier Inc. 305-329 (2013).
- Da Walsh,, Zaikova, E., Hallam, S. J. Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples. Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).
- Thompson, M., Chourey, K. Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples. Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).
- Lu, X., Digestion Zhu, H. Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).
- Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization. Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).
- Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. Genomic and proteomic characterization of "Candidatus Nitrosopelagicus brevis": An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).
- Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS biology. 5 (3), e77 (2007).
- Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean. Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).
- Rinke, C., Schwientek, P., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection. Frontiers in microbiology. 2, 215 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).
- Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. Metagenomics - a guide from sampling to data analysis. Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).
- Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C.
- Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4. Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).
- Ea Ottesen,, Marin, R., et al. Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton. The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).
- Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system. The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).
