Introduction
Los microorganismos son ubicuos y juegan un papel esencial en los ciclos biogeoquímicos de la Tierra 1. Actualmente, existen numerosos enfoques moleculares disponibles para la caracterización de estructura de la comunidad microbiana y función. El más común es el análisis de secuencias de genes de ARNr 16S amplificó por PCR a partir de ADN ambiental 2 - 4 de. Una desventaja de análisis de genes 16S rRNA es que sólo proporciona información sobre la identidad filogenética y estructura de la comunidad, con poca información sobre la función metabólica. En contraste, los enfoques tales como la metagenómica, metatranscriptomics y metaproteomics proporcionan información sobre la estructura de la comunidad y el metabolismo. La metagenómica, o el análisis del contenido de genes de un conjunto de organismos, incluye información sobre la estructura y el potencial funcional de la comunidad 5-8. Aunque potente, este potencial funcional no puede corresponder a la metabólicalas actividades de los organismos. El genotipo de un organismo está representada por sus genes, cada uno de los cuales puede ser transcrito a ARN y traducido además a la proteína, dando como resultado un fenotipo. Por lo tanto, para ayudar en la comprensión de la actividad funcional microbiana en un ambiente, el análisis post-genómica se debe realizar 9. Metatranscriptomics, o el análisis de las transcripciones de ARN es útil porque revela que los genes se transcriben en cualquier ambiente dado. Sin embargo, los niveles de mRNA no siempre coinciden con sus correspondientes niveles de proteína debido a la regulación de la traducción, la vida media del ARN, y el hecho de que varias copias de la proteína se pueden generar para cada mRNA 10.
Por estas razones metaproteomics ahora se reconoce como una herramienta importante para la microbiología ambiental. Metaproteomic Común analiza utilizar un enfoque proteómico escopeta donde el complemento completo cerca de las proteínas en una muestra compleja se purifican y analizan simultáneamente, por lo general a través de endigestión zymatic en péptidos y análisis sobre un espectrómetro de masas. Con posterioridad espectrometría de masas en tándem (MS / MS) "huellas dactilares péptido" se utiliza para determinar la secuencia del péptido y el potencial de proteínas de origen por la búsqueda de datos de proteínas (para una revisión ver 11). Trabajo proteómico ha recorrido un largo camino en los últimos 25 años gracias al aumento de la disponibilidad de datos genómica y el aumento de la sensibilidad y la precisión de los espectrómetros de masas que permitan la identificación de proteínas de alto rendimiento y cuantificación 11,12. Dado que las proteínas son el producto final de la expresión génica, los datos metaproteomic pueden ayudar a determinar qué organismos están activos en un entorno determinado y qué proteínas están expresando. Esto es una ventaja cuando se trata de determinar cómo un conjunto particular de variables ambientales afectará el fenotipo de un organismo o comunidad. Desde el principio, se utilizaron estudios metaproteomic basados en MS MS / en el océano para identificar proteínas específicas dirigidaslinajes microbianos, con el primer estudio se centra en la luz impulsado protones bomba proteorhodopsin en bacterias marinas SAR11 13. Más recientemente, los análisis comparativos metaproteomic han dilucidado los patrones de expresión de proteínas diferenciales entre comunidades complejas. Los ejemplos incluyen la identificación de los cambios temporales en el metabolismo de la costa noroeste del Océano Atlántico 14 o la Península Antártica 5. Otros estudios han descrito variaciones en los patrones de expresión de proteínas a través de escalas espaciales, por ejemplo, a lo largo de un transecto geográfico de un giro oceánico bajo de nutrientes a un sistema de surgencia costera altamente productiva 15. Para más críticas del metaproteomics recomendamos Schneider et al. (2010) 9 y Williams et al. (2014) 16. Proteómica dirigidos también se ha empleado en los últimos años para cuantificar la expresión de las vías metabólicas específicas en el entorno 17,18.
El Re son tres fases principales en el análisis metaproteomic. La primera fase es la preparación de muestras, que incluye la recogida de muestras, la lisis celular y la concentración de proteína. La recogida de muestras en microbiología marina a menudo implica la filtración de agua de mar a través de un pre-filtro para eliminar las células más grandes eucariotas, partículas y bacterias de partículas asociadas, seguido de filtración para la captura de células microbianas de estar libres, comúnmente con el uso de un cartucho de 0,22 micras unidad de filtro de 19,20. Estos filtros son incased en un cilindro de plástico y una lisis celular y el protocolo de extracción de proteínas que se pueden realizar dentro de la unidad de filtro sería una herramienta valiosa. Una vez que se obtiene la biomasa, las células deben ser lisadas para permitir la extracción de proteínas. Varios métodos pueden ser empleados, incluyendo guanidina-HCl sulfato de lisis 21 y sodio dodecil (SDS) basados en métodos de lisis. Aunque los detergentes como SDS son muy eficientes en la interrupción de las membranas y solubilizar muchos tipos de proteínas, concentrations precio tan bajo como 0.1% puede interferir con la digestión de proteínas aguas abajo y el análisis MS 22. De mayor preocupación es los efectos negativos de la SDS en la eficiencia digestión con tripsina, poder de resolución de la cromatografía líquida en fase inversa y la supresión de iones o la acumulación dentro de la fuente de iones 23.
La segunda fase es de fraccionamiento y análisis, donde las proteínas son sometidas a digestión enzimática seguida por análisis LC MS / MS, dando como resultado patrón de fragmentación am / z que se puede utilizar para determinar la secuencia primaria de aminoácidos del péptido tríptico inicial. Varios métodos de digestión se pueden realizar dependiendo de los tipos de detergentes utilizados, así como el flujo de trabajo aguas abajo espectrometría de masas. En nuestro protocolo, electroforesis PAGE 1-D seguido de la eliminación de SDS a partir del gel se utiliza con el fin de eliminar cualquier contaminación de detergente. El análisis de las proteínas que son difíciles de solubilizar, tales como proteínas de la membrana, requiere el uso de alta concentraciones de SDS u otros detergentes. Esto conduce a problemas de compatibilidad con electroforesis en SDS-gel. Si el objetivo de un estudio requiere la solubilización de estos duros para solubilizar las proteínas, el sistema de tubo de gel se puede utilizar 22,24. El método del tubo-gel incorpora proteínas dentro de la matriz de gel sin el uso de electroforesis. Posteriormente los detergentes utilizados para la solubilización se retiran antes de la digestión de proteínas.
La tercera fase es la análisis bioinformático. En esta fase los datos de péptidos MS / MS se busca en una base de datos de secuencias de nucleótidos traducidas para determinar que están presentes en la muestra de péptidos y proteínas. La identificación de péptidos depende de la base de datos es buscado en contra. Datos metaproteomic Marinos son comúnmente búsquedas en contra de las bases de datos compuestas de genomas de referencia, datos de metagenómica como el conjunto de datos Global Océano Muestreo 25, así como los genomas celulares amplificadas individuales de li sin cultivarneages 26,27. Identificación de proteínas también se puede aumentar mediante la inclusión de secuencias metagenomic de la misma muestra como los datos metaproteomic se derivó 5.
Aquí nos proporcionan un protocolo para la generación de péptidos adecuados para el análisis basado en MS MS / a partir de biomasa microbiana recogió por filtración y almacenados en una solución de estabilización de ARN. El protocolo descrito aquí permite ADN y proteínas para aislar a partir de la misma muestra para que todos los pasos que conducen a la proteína y las precipitaciones de ADN son idénticos. Desde una perspectiva práctica, se requiere menos de filtración ya que sólo se requiere un filtro para proteínas y extracción de ADN. También nos gustaría reconocer que este protocolo fue creado a través de la combinación, la adaptación y modificación de los dos protocolos previamente publicados. Los pasos de lisis celular son una adaptación de Saito et al. (2011) 28 y la tripsina en gel digerir componente se adapta de ShevcheNKO et al. (2007) 29.
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Protocol
1. Prepare Reactivos
- Preparar la solución de SDS-extracción: M Tris-HCl pH 0,1 7,5, 5% de glicerol, EDTA 10 mM y 1% de SDS. Filtro-esterilizar utilizando un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C.
- Preparar reactivos de valores necesarios para el gel de poliacrilamida.
- Preparar 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras y almacenar a temperatura ambiente.
- 0,5 M Tris-HCl pH 6,8. Filter-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras y almacenar a temperatura ambiente.
- Preparar 10% de SDS. Filtrar esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras y almacenar a temperatura ambiente.
- Preparar soluciones necesarias en gel tripsina digerir y extracción de péptidos.
- Preparar bicarbonato de amonio 100 mM. Filtro-esterilizar utilizando un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C.
- Preparar 1 stocks M de TDT. Suspendido en bicarbonato de amonio 100 mM y se almacena a -80 ° C.
- Preparar 550 mM acciones yodoacetamida. Suspendido en100 mM de bicarbonato de amonio y almacenar a -80 ° C.
- Preparar 100 ng / l existencias tripsina. Alícuota de 60 l en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga y se almacena a -80 ° C.
- Preparar la solución de extracción: ácido fórmico 1%, 2% de acetonitrilo.
- Preparar la solución de resuspensión: 5% de acetonitrilo y ácido fórmico al 0,1%.
2. Realice lisis celular en la Unidad de filtro de cartucho con células conservadas en el ARN solución Estabilización
- Expulsar la solución de estabilización de ARN a partir de la unidad de filtro de cartucho (1,5 ml) y en un tubo de microcentrífuga de 2 ml utilizando una jeringa de 60 ml se adjunta al final de cierre luer del filtro.
- Centrifugar el tubo de microcentrífuga de 2 ml durante 10 minutos a 17.000 xg para sedimentar los residuos celulares. Esto se hace para que el filtro en el paso 2.3 no obstruye.
- Transferir el sobrenadante a una unidad de filtro de ultracentrifugación 10 K para capturar cualquier proteínas procedentes de células que han lisadas de la congelación / thaw de la muestra. No deseche el pellet. Será utilizado en el paso 2.5. Realizar la centrifugación de la unidad de filtro de ultracentrifugación a 3.270 xg durante 30 min o hasta que el volumen se ha reducido a alrededor de 600 l.
- Derretir la punta de una punta de p10 y bloquear el lado no Luer de la unidad de filtro de cartucho con el extremo abierto de la punta. Esto asegurará que ningún tampón de extracción y la biomasa se escapa durante los pasos 2.5-2.7.
- Suspender el sedimento en 1 ml de solución de SDS-extracción y la pipeta en la unidad de filtro de cartucho original. La forma más fácil de pipeta en la unidad de filtro de cartucho es apilar una punta p200 en una punta p1000 y utilizar este doble punta para pipetear.
- Añadir 1 ml de solución de extracción SDS a la unidad de filtro de cartucho de modo que el volumen total es de aproximadamente 2 ml y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente rotando en un horno de hibridación. Coloque 3 laboratorio arrugado toallitas en el fondo de un tubo cónico de 50 ml. Parafilm ambos extremos de la unidad de filtro de cartucho cerradasy poner la unidad de filtro de cartucho en el tubo de 50 ml. Cierre la tapa y colocar el tubo en el horno de hibridación.
- Después de 10 min lugar filtrar la Sterivex en un flotador de espuma y seguro en su lugar con una jeringa de 5 ml en el extremo Luer. Flotador y se incuba en un baño de agua 95 ° C durante 15 minutos.
- Deje que la unidad de filtro de cartucho fresco y rotar a temperatura ambiente durante 1 hora (como en el paso 2.6).
- Expulsar el lisado solución de extracción / célula SDS fuera del filtro con una jeringa de 60 ml en la misma unidad de filtro de ultracentrifugación como antes (paso 2.3). Añadir 1 ml de solución fresca de extracción de SDS a la unidad de filtro de cartucho y se mezcla durante 30 seg a mano y luego expulsar en la unidad de filtro de ultracentrifugación utilizando la jeringa 60 ml. Esto es para enjuagar la unidad de filtro de cartucho para asegurar que todas las proteínas se han eliminado.
- Realizar centrifugación en la unidad de filtro de ultracentrifugación durante 45 minutos a 3270 xg o hasta que el volumen en la unidad de filtro es menor que 600 l.
- Deseche el filtrado y la parte superior de la unidad de filtro ultracentrífugo con solución de SDS-extracción fresco.
- Centrifugar la unidad de filtro durante otros 45 min a 3270 x g.
- Repita los pasos 2.11 y 2.12 veces más. Asegúrese de que el volumen final en la unidad de filtro de ultracentrifugación es como máximo de 600 l en el final de la vuelta final.
- En este punto, se dividió el concentrado en dos. Una fracción será utilizado para la precipitación del ADN y el otro para la precipitación de proteínas.
Nota: La cantidad de fraccionamiento depende de la cantidad de biomasa que se filtró y los usos previstos de los productos. En nuestro caso, nos dividimos el concentrado con 10% hacia la precipitación de ADN y el 90% hacia la precipitación de proteínas.
Precipitación 3. Proteína
- Añadir 4 volúmenes de metanol: acetona (50:50) a un volumen de concentrado y agitar durante 10 seg. Incubar toda la noche a -20 ° C.
- Centrifugar a 17000 xg durante 30 min. Decantar el sobrenadantey dejar que el pellet (puede ser invisible) seco en un SpeedVac durante 1 hora (o hasta que se seque).
Nota: No más de secar el sedimento ya que esto puede hacer que sea difícil para volver a suspender. - Suspender el precipitado en 25 l de solución de SDS-extracción. Deje reposar durante una hora y luego volver a suspender pipeteando arriba y abajo.
- Cuantificar la proteína usando un kit de ensayo de proteínas y las instrucciones del fabricante.
4. ADN Precipitación
- Añadir solución de SDS-extracción a la fracción de concentrado para ser utilizado para la precipitación del ADN hasta que la marca 500 l. Este paso es simplemente para aumentar el volumen de la solución, por lo que es más fácil trabajar con.
- Añadir 0.583 volúmenes de un reactivo de precipitación de proteínas (tales como la proteína MPC reactivo de precipitación) y agitar durante 10 seg. Usted debe ver una forma precipitado blanco.
Nota: También hemos utilizado fenol: cloroformo métodos de extracción de ADN, pero es más difícil debido a los bajos volúmenes. Se obtuvieron mejores rendimientos de ADN utilizando elMPC Protein Precipitación Reactivo. - Centrifugar a 17.000 xg y 4 ° C durante 10 min.
- Transferir el sobrenadante a otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 0,95 volúmenes de isopropanol. Invertir 30-40 veces.
- Centrifugar durante 10 min a 4 ° C a la velocidad máxima.
- Decantar con cuidado y desechar el sobrenadante.
- Enjuague dos veces con 750 l de etanol al 70%.
- Retire la mayor cantidad de etanol como sea posible con la pipeta, luego dejar secar al aire.
Nota: No más de secar el ADN ya que esto puede hacer que sea difícil para volver a suspender. - Resuspender en 25 l de tampón TE bajo, pH 8 (10 mM Tris-HCl, EDTA 0,1 mM).
- Cuantificar el ADN utilizando un kit de ensayo de ADN de doble cadena y las instrucciones del fabricante. Realizar gel de agarosa (1%) electroforesis en 3 l de la ADN para comprobar su calidad.
5. SDS-PAGE gel de proteínas
- Preparar tampón de muestra (950 l de tampón de muestra Laemmli y 50 l β-mercaptoetanol). </ li>
- Añadir el volumen correspondiente de 15 g de proteína, o un máximo de 20 l a un volumen igual de tampón de muestra y hervir durante 4 min. Las muestras se pueden almacenar a -80 ° C hasta el SDS-PAGE se puede realizar.
- Preparar 10% de acrilamida gel de resolución con un gel de apilamiento de acrilamida al 5%.
- Cargar el gel con muestras y 4 l de una escalera de proteínas. Correr el gel a 120 V constante hasta que el 250 kDa marcador escalera solo ha alcanzado el gel de resolución.
- Tinción del gel usando una tinción de Coomassie basado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
6. En-gel tripsina Digest y Péptido Extracción
Nota: Todos los pasos de aquí hasta 6,10 se realizan en una cabina de seguridad biológica para minimizar la contaminación.
- Corte el exceso de gel bajo la marca de 10 kDa escalera para cada carril. Cada carril se analizará en el MS / MS por separado. Cortar cada carril en 1 mm x 1 mm cuadrados para aumentar la superficie y colocar todos squares de la vía en un tubo de baja unión a micro-centrífuga. Repita esto para todos los carriles. (Ácido acético al 1% se puede utilizar para evitar que el gel se seque y convertirse en difícil de cortar).
Nota: Reducir al mínimo la contaminación es crítica en esta etapa, por lo que el corte en lonchas gel se realiza en una cabina de seguridad biológica en el molde de gel SDS-PAGE de vidrio usado para hacer el gel. - De-mancha
- Dispensar 50 l de bicarbonato de amonio 100 mM en cada tubo de baja vinculante, cerca de la tapa y se incuba a 37 ° C durante 10 minutos.
- Dispensar 50 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y se incuba a 37 ° C durante 5 min.
- Aspirar y desechar de 150 l.
- Repita los pasos 6.2.1 y 6.2.2.
- Aspirar y desechar 95 l.
- Deshidratación
- Dispensar 50 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y espere 5 minutos. Aspirar y desechar 45 l y esperar 10 min.
- Reducción
- Dispensar 50 l de DTT (10 mM, diluido en amm 100 mMbicarbonato de onio), cerca de la tapa y espere 30 minutos a 37 ° C.
- Alquilación
- Dispensar 50 l yodoacetamida (55 mM, diluido en bicarbonato de amonio 100 mM), cerca de la tapa y espere 20 minutos a 37 ° C.
- Prescindir de 100 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y se incuba durante 5 minutos a 37 ° C. Aspirar y desechar de 195 l.
- lavar
- Prescindir de bicarbonato de amonio 50 l, cerca de la tapa y se incuba durante 10 minutos a 37 ° C.
- Dispensar 50 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y se incuba a 37 ° C durante 5 min. Aspirar y desechar de 120 l.
- Deshidratación
- Dispensar 50 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y espere 5 minutos. Aspirar y desechar 45 l.
- Dispensar 50 l de acetonitrilo, espere 5 min.
- Aspirar y desechar 75 l y espere 5 minutos.
- Digestión
- Prescindir de 25 a 30 l de 6 ng / l tripsina (uasta todos los fragmentos de gel están cubiertos). Cerrar la tapa y espere 30 minutos a temperatura ambiente.
- Incubar durante la noche (mínimo 4,5 horas) a 37 ° C.
- Deje reposar a temperatura ambiente durante 30 min.
- Extracción y Péptido Transferencia
- Dispensar 30 l de solución de extracción y cubrir con tapa durante 30 min en hielo.
- Aspirar 30 l y dispensar el volumen aspirado en un nuevo tubo de baja unión marcado.
- Dispensar 12 l de solución de extracción y 12 l de acetonitrilo en el tubo original (con gel). Cerrar la tapa y se incuba durante 30 minutos en hielo.
- Aspirar 15 l y depositará en el nuevo tubo.
- Repita los pasos (6.9.3 y 6.9.4).
- Coloque nuevos tubos en un SpeedVac hasta que se seque.
- Resuspender en 50 l de solución de resuspensión. Vortex en medio durante 10 min para volver a suspender.
- Solución de péptido Pipetear en cualquiera de nano / viales LC o placas de 96 pocillos adecuados para nano / LCTrabajo MS / MS.
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Representative Results
Como demostración, se realizó el protocolo en dos muestras de agua de mar recogidas de la superficie y el máximo de clorofila del océano costero en el norte de Canadá. Mientras que en el mar, 6-7 de L de agua de mar se pasó a través de un GF / D prefiltro 3 micras, a continuación, se recogieron las células microbianas en una unidad de filtro de cartucho de 0,22 micras siguiendo el protocolo de Walsh et al. 20. Las células se almacenan inmediatamente en una solución de estabilización de ARN hasta su posterior procesamiento. Al regresar al laboratorio, se realizó el protocolo, ya que se presenta aquí. El lisado celular concentrado se dividió; proteína se precipitó a partir de 90% del volumen, mientras que el ADN se precipitó de la 10% restante del volumen. Recuperamos 24-26 g de proteína y 250-308 ng de ADN de alta calidad a partir de estas muestras (Figura 1). Después de la in-gel digestión con tripsina y extracción de péptidos, los péptidos sometimos a análisis de MS / MS utilizando un nano-LC acoplado a la Orbitrap Eliespectrómetro de masas te (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). A partir de los péptidos, se generaron más de 23.000 espectros MS / MS por muestra. Los péptidos y proteínas se identificaron mediante la búsqueda en estos espectros contra una base de datos de secuencia en la aduana con la herramienta bioinformática picos (BSI, Waterloo, ON, Canadá). La base de datos se compone de proteínas predichas de genomas de referencia marinos y metagenomes. La búsqueda resultó en la identificación de alrededor de 1000 péptidos y proteínas 700-800 para cada muestra. Naturalmente, estos resultados son dependientes de abundancia microbiana celular, MS instrumentación, y base de datos de búsqueda de proteínas y algoritmos. No obstante, estos resultados demuestran que este protocolo tiene el potencial para producir péptidos trípticos adecuados adecuados para identificar cientos de proteínas en el medio ambiente. Además, dado que las bibliotecas de metagenómica se pueden construir a partir de tan poco como 100 ng de ADN 30, este protocolo también tiene potencial para proporcionar cantidades adecuadas de DNApara generar conjuntos de datos de metagenómica metaproteomic emparejados.
Composición taxonómica y funcional de los metaproteomes se analizó usando una combinación de BLASTp y la MEGAN (Metagenoma analizador) paquete de software 31,32 (Figura 2). Proteínas asignados a alfa-proteobacterias fueron el, la gran mayoría de los cuales fueron asignados más altamente representado en el conjunto de datos para el clado SAR11. El clado Rhododobacterales de alfa-proteobacterias también fue altamente representado e identificado con mayor frecuencia en las aguas superficiales. Las proteínas asignados a Bacteroidetes se distribuyeron de manera uniforme entre la superficie y la clorofila máxima, pero las proteínas Flavobacterias se identificaron en un mayor grado en el máximo de clorofila. Proteínas Gamma-proteobacterial se distribuyeron uniformemente a través de la columna de agua mientras que las proteínas beta-proteobacterial se encontraron predominantemente en la superficie . Deuna perspectiva funcional, se identificaron una amplia gama de rutas metabólicas. Estructuración vertical de estas vías metabólicas era evidente. Por ejemplo, las proteínas asociadas con el metabolismo de aminoácidos, metabolismo de los carbohidratos y las vías de fijación de carbono procariota se identificaron principalmente en la superficie, y el metabolismo de nitrógeno, se encuentran exclusivamente en la superficie. Proteínas de fijación de carbono fotosintéticos se observaron principalmente en el máximo de clorofila mientras que las proteínas que participan en la fotosíntesis se identificaron de manera uniforme entre la superficie y el máximo de clorofila. Estos resultados demuestran que una amplia variedad de proteínas a partir de una diversidad de taxones microbiana puede detectarse utilizando el protocolo presentado aquí.
Figura 1:. El ADN genómico de 2 profundidades en la estación ártica S633 El primer carril contiene 4 l de un ADN l 1 kbsumador, carril 2 contiene 3 l de extracción de ADN genómico de S633_2 m, carril 3 contiene 3 l de extracción de ADN genómico de S633_20 m y los carriles 4-6 contienen 0,5 l (85 ng), 2 l (333 ng) y 4 l ( 667 ng) de ADN digerido con HindIII lambda.
Figura 2:. Análisis taxonómica y funcional de 2 profundidades en la estación ártica S633 comparación diversidad taxonómica de las estación de 633 aguas superficiales y clorofila máximos árticas (A) ha creado usando MEGAN. Comparación de la diversidad funcional de las estación de 633 aguas superficiales y clorofila máximos árticas (B) creado usando MEGAN para consultar la base de datos KEGG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La preservación de la muestra es clave para estudios metaproteomic y el trabajo previo demostró que una solución de estabilización de ARN es un tampón de almacenamiento útil para almacenar las células antes de la extracción de proteínas 28. Idealmente, las muestras se conservan in situ para negar los cambios en la expresión de la proteína durante la manipulación 33,34. De hecho, in situ se han desarrollado tecnologías de muestreo y fijación, que permiten la colección autónomo y conservación de las muestras por los instrumentos de la nave-desplegado. Sin embargo, el acceso a estas tecnologías no siempre es factible. En el caso común de que no es así, las muestras deben ser conservados tan pronto como sea posible después de la recolección.
Aquí se presenta un protocolo para la extracción de proteína a partir de células de la solución almacenada de estabilización de ARN recogidas en una unidad de filtro de cartucho, que se utiliza comúnmente en microbiología acuática. El protocolo incluye la lisis celular utilizando una solución de SDS-lisis y calefacción, seguido de un pretapa de concentración Otein utilizando unidades de filtro ultracentrífugo que duplicando como una etapa de desalación necesario. Debe tenerse en cuenta que los pasos de concentración y desalación no pueden pasarse por alto. Hemos encontrado que se requiere un mínimo de tres etapas de intercambio de tampón para desalar nuestro concentrado. Debido a la alta concentración de sal de la solución de estabilización de ARN, si no se produce de desalado adecuada, demasiada sal se precipita durante la etapa de precipitación de la proteína durante la noche y la etapa de desalación y la precipitación tendrá que ser repetida. Además, si la desalación no se realiza adecuadamente la 1D-PAGE al no funcionará y se perderán las muestras.
A continuación, el lisado concentrado se dividió de modo que podrían llevarse a cabo tanto la precipitación de proteínas y precipitación del ADN. Esto es útil ya que a menudo es deseable que los datos de metagenómica y metaproteomic generarse a partir de las mismas muestras. Si una proteína no está representado en la base de datos de secuencias de proteínas a continuación, el péptido seno ser identificado. Incluyendo los datos genómicos a partir de la misma muestra como los datos proteómicos reduce el riesgo de no ser capaz de identificar una proteína debido a su ausencia de la base de datos.
Aunque este protocolo se ha optimizado para su uso con unidades de filtro de cartucho y validado para trabajar en las comunidades microbianas del océano costero, puede ser adaptado para su uso con otros tipos de muestras ambientales y filtros. Sin embargo, debe quedar claro que el éxito de este protocolo es dependiente de una cantidad adecuada de biomasa de partida. Por lo tanto en los ecosistemas acuáticos donde la biomasa puede ser muy baja, se recomienda aumentar el volumen de agua filtrada en consecuencia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2 ml ROBO vial 9 mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
References
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