Introduction
I microrganismi sono onnipresenti e svolgono ruoli essenziali nel cicli biogeochimici della Terra 1. Attualmente, ci sono numerosi approcci molecolari disponibili per caratterizzare la struttura comunità microbica e funzione. Più comune è l'analisi del gene 16S rRNA sequenze PCR-amplificato dal DNA ambientale 2-4. Uno svantaggio di analisi del gene 16S rRNA è che fornisce solo informazioni sull'identità filogenetica e struttura della comunità, con poche informazioni sulla funzione metabolica. Al contrario, approcci come metagenomica, metatranscriptomics e metaproteomica forniscono informazioni sulla struttura delle comunità e il metabolismo. Metagenomica o l'analisi del contenuto gene di un assemblaggio di organismi, fornisce informazioni sulla struttura e potenzialità funzionali della comunità 5 - 8. Anche se potente, questo potenziale funzionale potrebbe non corrispondere al metabolicaattività degli organismi. Genotipo di un organismo è rappresentata dai suoi geni, ognuno dei quali può essere trascritto RNA e in seguito tradotti alla proteina, causando un fenotipo. Così, per aiutare nella comprensione della attività funzionale microbica in un ambiente, l'analisi post-genomica deve essere eseguita 9. Metatranscriptomics, o l'analisi dei trascritti di RNA è utile perché rivela quali geni sono trascritti in un determinato ambiente. Tuttavia, i livelli di mRNA non sempre corrispondono ai livelli di proteina corrispondente a causa di regolazione traduzionale, RNA emivita, e il fatto che più copie della proteina possono essere generati per ogni mRNA 10.
Per questi motivi metaproteomica è ormai riconosciuta come un importante strumento per microbiologia ambientale. Metaproteomic comune analizza utilizzare un approccio di proteomica fucile da caccia dove la serie completa nei pressi di proteine in un campione complesso sono purificati e analizzati allo stesso tempo, di solito attraverso itdigestione enzimatico in peptidi e analisi su uno spettrometro di massa. Spettrometria di massa tandem successivo (MS / MS) "peptide fingerprinting" è utilizzato per determinare la sequenza di peptidi e proteine di origine potenziale da database di proteine ricerca (per una rassegna vedi 11). Lavoro proteomica ha fatto molta strada negli ultimi 25 anni grazie all'aumento di genomica disponibilità dei dati e l'aumento della sensibilità e la precisione di spettrometri di massa che consentano l'identificazione di proteine ad alto rendimento e la quantificazione 11,12. Poiché le proteine sono il prodotto finale di espressione genica, i dati metaproteomic può aiutare a determinare quali organismi sono attivi in un determinato ambiente e quali proteine stanno esprimendo. Questo è vantaggioso quando si cerca di determinare come un particolare insieme di variabili ambientali influenzerà il fenotipo di un organismo o di una comunità. All'inizio, gli studi metaproteomic basate su MS MS / nell'oceano sono stati usati per identificare le proteine specifiche in miratalignaggi microbici, con il primo studio incentrato sulla luce guidato protonica pompa proteorodopsina in SAR11 batteri marini 13. Più di recente, le analisi comparative metaproteomic hanno chiarito pattern di espressione proteica differenziali tra le comunità complesse. Gli esempi includono l'identificazione di variazioni temporali nel metabolismo del litorale nord-occidentale dell'Oceano Atlantico 14 o la Penisola Antartica 5. Altri studi hanno descritto variazioni dei pattern di espressione proteica attraverso scale spaziali, ad esempio, lungo un transetto geografica da un oceano bassa nutrienti gyre ad un sistema upwelling costiero altamente produttivo 15. Per ulteriori recensioni di metaproteomica si consiglia Schneider et al. (2010) 9 e Williams et al. (2014) 16. Proteomica mirate sono stati anche impiegati negli ultimi anni per quantificare l'espressione di specifiche vie metaboliche nell'ambiente 17,18.
There sono tre fasi principali nell'analisi metaproteomic. La prima fase è la preparazione del campione, che comprende la raccolta del campione, la lisi cellulare e la concentrazione di proteine. Raccolta dei campioni in microbiologia marina spesso comporta la filtrazione di acqua marina attraverso un pre-filtro per rimuovere le cellule eucariotiche grandi, particelle e batteri particelle-associata, seguita da filtrazione per la cattura di cellule microbiche vivere liberi, comunemente con l'uso di una cartuccia di 0,22 micron unità filtro 19,20. Questi filtri sono incased in un cilindro di plastica e una lisi cellulare e protocollo di estrazione proteina che può essere effettuata all'interno del gruppo filtro sarebbe uno strumento prezioso. Una volta ottenuta la biomassa, le cellule devono essere lisate per consentire l'estrazione delle proteine. Diversi metodi possono essere impiegati, compresi guanidina-HCl 21 lisi e sodio dodecil solfato (SDS) metodi basati lisi. Anche se i detersivi come SDS sono molto efficienti a distruggere le membrane e solubilizzando molti tipi di proteine, Concentrations partire da 0,1% a valle può interferire con la digestione delle proteine e MS analisi 22. Di grande preoccupazione è gli effetti negativi della SDS su tripsina efficienza digestione, potere risolutivo della retromarcia cromatografia liquida fase e soppressione ionica o l'accumulo all'interno della sorgente di ioni 23.
La seconda fase è frazionamento e analisi, in cui le proteine vengono sottoposti a digestione enzimatica seguita da analisi LC MS / MS, conseguente am / z modello frammentazione che può essere utilizzata per determinare la sequenza amminoacidica primaria del peptide triptico iniziale. Vari metodi di digestione può essere eseguita a seconda delle tipologie di detergenti utilizzati, nonché il workflow spettrometria di massa a valle. Nel nostro protocollo, 1-D elettroforesi PAGE seguita dalla rimozione di SDS dal gel viene utilizzato per eliminare eventuali contaminazioni detergente. L'analisi delle proteine che sono difficili da solubilizzare, come le proteine di membrana, richiede l'uso di alta concenzioni di SDS o altri detergenti. Questo porta a problemi di compatibilità con elettroforesi SDS-gel. Se l'obiettivo di uno studio richiede la solubilizzazione di questi difficile da solubilizzare le proteine, il sistema tubo-gel può essere usato 22,24. Il metodo del tubo-gel incorpora proteine all'interno della matrice gel senza l'uso di elettroforesi. Successivamente detergenti utilizzati per la solubilizzazione vengono rimossi prima di digestione delle proteine.
La terza fase è l'analisi bioinformatica. In questa fase i dati peptidici MS / MS vengono ricercati con un database di sequenze nucleotidiche tradotti per determinare quali sono presenti nel campione peptidi e proteine. L'identificazione di peptidi dipende database viene ricercato contro. Dati metaproteomic marini sono comunemente cercati nei database costituiti da genomi di riferimento, dati metagenomiche come il set di dati Global Ocean Sampling 25, così come cellulari amplificati genomi singoli da li incoltoneages 26,27. L'identificazione delle proteine può essere aumentato anche l'inclusione di sequenze metagenomiche dallo stesso campione come dati metaproteomic stato derivato 5.
Qui forniamo un protocollo per la generazione di peptidi adatti per l'analisi MS MS / da biomassa microbica raccolti per filtrazione e memorizzati in una soluzione di stabilizzazione RNA. Il protocollo qui descritto permette di DNA e proteine per essere isolati dallo stesso campione in modo che tutte le fasi che portano alla proteina e precipitazioni DNA sono identici. Dal punto di vista pratico, meno filtrazione è necessaria poiché solo filtro è necessario per proteine e estrazione del DNA. Vorremmo anche riconoscere che questo protocollo è stato creato attraverso la combinazione, l'adattamento e la modifica di due protocolli precedentemente pubblicati. I passi lisi cellulare sono adattati da Saito et al. (2011) 28 e la tripsina in-gel digerire componente è adattato da Shevchenko et al. (2007) 29.
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Protocol
1. Preparare Reagenti
- Preparare la soluzione SDS-estrazione: 0.1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% glicerolo, EDTA 10 mM e 1% SDS. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro e conservare 0,22 micron a 4 ° C.
- Preparare i reagenti azionari necessari per il gel di poliacrilammide.
- Preparare 1.5 M Tris-HCl pH 8.8. Filtro-sterilizzare con un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente.
- 0.5 M Tris-HCl pH 6.8. Filtro-sterilizzare con un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente.
- Preparare 10% SDS. Filtro sterilizzare usando un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente.
- Preparare soluzioni necessarie per in-gel tripsina digerire ed estrazione del peptide.
- Preparare 100 mM di bicarbonato di ammonio. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro e conservare 0,22 micron a 4 ° C.
- Preparare 1 scorte M DTT. Sospeso in 100 mM di bicarbonato di ammonio e conservare a -80 ° C.
- Preparare 550 mm scorte iodoacetamide. Sospeso in100 MM bicarbonato di ammonio e conservare a -80 ° C.
- Preparare 100 ng / ml scorte tripsina. Aliquota 60 ml in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -80 ° C.
- Preparare la soluzione di estrazione: 1% acido formico, 2% acetonitrile.
- Preparare la soluzione risospensione: 5% di acetonitrile e 0,1% di acido formico.
2. Eseguire cellulare Lysis in Unità Filtro a cartuccia con celle conservati in RNA Stabilizzazione Solution
- Espellere la soluzione di stabilizzazione RNA dall'unità filtro a cartuccia (1,5 ml) e in una provetta 2 ml con una siringa da 60 ml attaccata all'estremità luer-lock del filtro.
- Centrifugare la provetta 2 ml per 10 minuti a 17.000 xg per far sedimentare i detriti cellulari. Questo viene fatto in modo che il filtro a passaggio 2.3 non ostruisce.
- Trasferire il surnatante in un gruppo filtrante ultracentrifugo 10 K acquisire qualsiasi proteine provenienti da cellule che sono lisate dal congelamento / thaw del campione. Non gettare il pellet. Sarà utilizzato nel passo 2.5. Eseguire centrifugazione dell'unità filtro ultracentrifugo a 3.270 xg per 30 minuti o fino a quando il volume è ridotto a circa 600 ml.
- Sciogliere la punta di una punta di p10 e bloccare il lato non luer-lock dell'unità filtro cartuccia con l'estremità aperta della punta. Questo farà sì che nessun tampone di estrazione e biomassa scappa durante le fasi di 2,5-2,7.
- Sospendere il pellet in 1 ml di soluzione di SDS-estrazione e pipettare nella dell'unità filtro cartuccia originale. Il modo più semplice per pipetta all'interno dell'unità filtro a cartuccia è di impilare una punta p200 su una punta p1000 e utilizzare questa doppia punta per il pipettaggio.
- Aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione SDS all'unità filtro a cartuccia in modo che il volume totale è di circa 2 ml e incubare per 10 min a temperatura ambiente durante la rotazione in un fornetto. Inserire 3 laboratorio accartocciato asciuga in fondo a un tubo 50 ml. Parafilm entrambe le estremità dell'unità filtro a cartuccia chiusae mettere l'unità filtrante a cartuccia nel tubo 50 ml. Chiudere il coperchio e mettere il tubo nel forno di ibridazione.
- Dopo 10 min posto il filtro Sterivex su un galleggiante schiuma e fissarlo in posizione con una siringa da 5 ml all'estremità luer-lock. Float e incubare in un 95 ° C bagnomaria per 15 min.
- Sia l'unità filtrante a cartuccia fresco e ruotare a temperatura ambiente per 1 ora (come al punto 2.6).
- Espellere l'SDS lisato soluzione di estrazione / cellule dal filtro con una siringa da 60 ml nella stessa unità filtro ultracentrifugo come prima (passo 2.3). Aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione fresca SDS all'unità filtro a cartuccia e miscelare per 30 sec a mano, quindi espellere nell'unità filtro ultracentrifugo utilizzando la siringa 60 ml. Questo per risciacquare l'unità filtro cartuccia per assicurare tutte le proteine sono state rimosse.
- Eseguire centrifugazione sull'unità filtrante ultracentrifugo per 45 min a 3270 xg o finché il volume nell'unità filtro è inferiore a 600 microlitri.
- Gettare flusso continuo e rabboccare l'unità filtro ultracentrifugo con soluzione di SDS-estrattivo.
- Centrifugare il filtro per altri 45 min a 3270 x g.
- Ripetere i punti 2.11 e 2.12 altre due volte. Assicurarsi che il volume finale del gruppo filtro ultracentrifugo è al massimo 600 microlitri al termine della centrifuga finale.
- A questo punto, dividere il concentrato in due. Una frazione sarà usato per la precipitazione del DNA e l'altra per la precipitazione delle proteine.
Nota: La quantità frazionamento dipende dalla quantità di biomassa che viene filtrato e gli usi previsti dei prodotti. Nel nostro caso, abbiamo diviso il concentrato con il 10% verso la precipitazione del DNA e il 90% verso la precipitazione delle proteine.
3. Proteine Precipitazioni
- Aggiungere 4 volumi di metanolo: acetone (50:50) per un volume di concentrato e vortex per 10 sec. Incubare per una notte a -20 ° C.
- Spin down a 17.000 xg per 30 min. Decantare il surnatantee lasciare che il pellet (può essere invisibile) a secco in un speedvac per 1 ora (o fino a secco).
Nota: Non più di asciugare il pellet in quanto ciò potrebbe rendere difficile per sospendere di nuovo. - Sospendere il pellet in 25 ml di soluzione di SDS-estrazione. Lasciate riposare per un'ora poi risospendere pipettando su e giù.
- Quantificare proteina utilizzando un kit di analisi delle proteine e le istruzioni del produttore.
4. DNA Precipitazioni
- Aggiungere la soluzione SDS-estrazione alla frazione concentrato da utilizzare per la precipitazione del DNA finché il segno 500 microlitri. Questo passo è semplicemente quello di aumentare il volume della soluzione, rendendo più facile lavorare con.
- Aggiungere 0,583 volumi di un reagente precipitazione delle proteine (come la proteina MPC reagente precipitazione) e vortex per 10 sec. Si dovrebbe vedere una forma precipitato bianco.
Nota: Abbiamo usato anche fenolo: DNA metodi di estrazione del cloroformio, ma è più difficile a causa dei volumi bassi. Abbiamo ottenuto una migliore resa del DNA utilizzando ilMPC proteine Precipitazioni reagente. - Centrifugare a 17.000 xg e 4 ° C per 10 min.
- Trasferire il surnatante in un'altra provetta da 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere 0,95 volumi di isopropanolo. Invertire 30-40 volte.
- Centrifugare per 10 minuti a 4 ° C alla velocità massima.
- Decantare con cautela e scartare il surnatante.
- Risciacquare due volte con 750 ml di etanolo al 70%.
- Rimuovere il più etanolo possibile pipettando, quindi lasciare asciugare all'aria.
Nota: Non più di asciugare il DNA in quanto ciò potrebbe rendere difficile per sospendere di nuovo. - Risospendere in 25 pl di tampone TE bassa, pH 8 (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA).
- Quantificare il DNA utilizzando un kit test dsDNA e le istruzioni del produttore. Eseguire gel di agarosio (1%) elettroforesi su 3 ml di DNA per verificare la qualità.
5. SDS-PAGE gel di proteine
- Preparare tampone campione (950 microlitri tampone campione Laemmli e 50 microlitri β-mercaptoetanolo). </ li>
- Aggiungere il volume corrispondente per 15 mg di proteine, o un massimo di 20 microlitri di volume uguale di tampone campione e bollire per 4 min. I campioni possono essere conservati a -80 ° C fino a SDS-PAGE può essere eseguita.
- Preparare 10% acrilamide gel risolvere con un gel di acrilammide impilamento 5%.
- Caricare il gel con campioni e 4 ml di una scala di proteine. Attivare il gel a costante 120 V fino a 250 kDa marcatore scala ha appena raggiunto il gel risolvere.
- Colorare il gel con un Coomassie macchia base secondo le istruzioni del produttore.
6. In-gel tripsina Digest e Peptide Estrazione
Nota: Tutti i passi da qui fino a 6.10 vengono eseguiti in una cappa di sicurezza biologica per minimizzare la contaminazione.
- Tagliare il gel in eccesso sotto la soglia dei 10 kDa scala per ogni corsia. Ogni corsia verrà analizzata sulla MS / MS separatamente. Tagliare ogni corsia in 1 mm x 1 mm quadrati per aumentare la superficie e mettere tutti squares dalla corsia in un tubo a bassa legame micro-centrifuga. Ripetere questa operazione per tutte le corsie. (1% di acido acetico può essere utilizzata per impedire il gel si secchi e diventando difficile da tagliare).
Nota: Minimizzare la contaminazione è critico in questa fase, quindi affettare gel viene eseguita in una cappa di sicurezza biologica in SDS-PAGE gel stampo di vetro utilizzato per fare il gel. - De-macchia
- Pipettare 50 ml di 100 mM di bicarbonato di ammonio in ogni provetta bassa vincolante, vicino tappo e incubare a 37 ° C per 10 min.
- Pipettare 50 ml di acetonitrile, vicino tappo e incubare a 37 ° C per 5 min.
- Aspirare e scartare 150 ml.
- Ripetere i punti 6.2.1 e 6.2.2.
- Aspirare e scartare 95 microlitri.
- Disidratazione
- Dispensare 50 microlitri acetonitrile, vicino tappo ed attendere 5 min. Aspirare e scartare 45 microlitri e aspettare 10 min.
- Riduzione
- Pipettare 50 microlitri DTT (10 mM, diluito in 100 mM ammbicarbonato onium), vicino tappo e attendere 30 minuti a 37 ° C.
- Alchilazione
- Dispensare 50 microlitri iodoacetamide (55 mm, diluito in 100 mM di bicarbonato di ammonio), vicino tappo e attendere 20 minuti a 37 ° C.
- Dispensare 100 ml di acetonitrile, vicino berretto e incubare per 5 minuti a 37 ° C. Aspirare e scartare 195 ml.
- lavaggio
- Dispensare bicarbonato di ammonio 50 microlitri, vicino berretto e incubare per 10 minuti a 37 ° C.
- Pipettare 50 ml di acetonitrile, vicino tappo e incubare a 37 ° C per 5 min. Aspirare e scartare 120 ml.
- Disidratazione
- Dispensare 50 microlitri acetonitrile, vicino tappo ed attendere 5 min. Aspirare e scartare 45 microlitri.
- Dispensare 50 ml di acetonitrile, attendere 5 min.
- Aspirare e scartare il 75 microlitri e attendere 5 minuti.
- Digestione
- Dispensare 25-30 ml di 6 ng / mL tripsina (uino tutti i frammenti di gel sono coperti). Chiudere il tappo e attendere 30 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare per una notte (minimo 4,5 ore) a 37 ° C.
- Lasciate riposare a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Estrazione e Peptide Transfer
- Dispensare 30 ml di soluzione di estrazione e coprire con il coperchio per 30 minuti in ghiaccio.
- Aspirare 30 ml e dispensare il volume aspirato in un nuovo tubo a bassa legante marcato.
- Dispensare 12 ml di soluzione di estrazione e 12 ml di acetonitrile nella provetta originale (con il gel). Chiudere il tappo e incubare per 30 minuti in ghiaccio.
- Aspirare 15 ml e deposito nel nuovo tubo.
- Ripetere i passaggi (6.9.3 e 6.9.4).
- Mettere nuovi tubi in un SpeedVac fino a secco.
- Risospendere in 50 ml di soluzione di risospensione. Vortex sul medio per 10 minuti per risospendere.
- Soluzione peptide pipetta in entrambi nano / fiale LC o piastre a 96 pozzetti adatti per nano / LCLavoro MS / MS.
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Representative Results
A dimostrazione, abbiamo eseguito il protocollo su due campioni di acqua di mare prelevati dalla superficie e la clorofilla massima del mare costiera nel nord del Canada. Mentre in mare, 6-7 L di acqua di mare è stato passato attraverso un 3 micron GF / D prefiltro, quindi le cellule microbiche sono state raccolte su un filtro di 0,22 micron unità cartuccia seguendo il protocollo di Walsh et al. 20. Le cellule sono state immediatamente memorizzati in una soluzione di stabilizzatore RNA fino al procedimento. Al ritorno in laboratorio, abbiamo eseguito il protocollo in quanto è presentato qui. Il lisato cellulare è stato diviso concentrato; proteina è stata precipitata dal 90% del volume, mentre il DNA è stato precipitato dalla restante 10% del volume. Abbiamo recuperato 24-26 ug di proteine e 250-308 ng di DNA di alta qualità da questi campioni (Figura 1). Dopo l'in-gel tripsina digestione e l'estrazione peptide, abbiamo sottoposto ad analisi i peptidi MS / MS utilizzando un nano-LC accoppiato al Orbitrap Elite spettrometro di massa (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Dalle peptidi, abbiamo generato oltre 23.000 MS / MS per campione. Peptidi e proteine sono state poi identificate dalla ricerca questi spettri in un database personalizzato in-casa sequenza con lo strumento di bioinformatica picchi (BSI, Waterloo, ON, Canada). Il database è stato composto da proteine previsti da genomi di riferimento marine e metagenomi. La ricerca ha portato all'identificazione di circa 1.000 peptidi e proteine 700-800 per ogni campione. Naturalmente, questi risultati dipendono abbondanza microbica cellule, MS strumentazione e proteine database di ricerca e algoritmi. Tuttavia, questi risultati dimostrano che questo protocollo ha il potenziale per produrre adeguati peptidi triptici adatti per identificare centinaia di proteine nell'ambiente. Inoltre, poiché le librerie metagenomiche possono essere costruiti da un minimo di 100 ng di DNA 30, questo protocollo ha anche il potenziale per fornire quantità adeguate di DNAper generare abbinati dataset metagenomic-metaproteomic.
Composizione tassonomica e funzionale delle metaproteomes è stato analizzato utilizzando una combinazione di BLASTP e MEGAN (metagenoma analizzatore), pacchetto software 31,32 (Figura 2). Le proteine assegnati a Alpha-proteobacteria sono stati i più altamente rappresentato nel set di dati, la maggior parte delle quali sono stati assegnati per il clade SAR11. Il clade Rhododobacterales di Alpha-Proteobacteria è stato anche molto rappresentato e molto spesso individuata nelle acque superficiali. Proteine assegnate a Bacteroidetes sono stati equamente distribuiti tra il massimo di superficie e clorofilla, ma le proteine Flavobacteria sono stati identificati in misura maggiore in corrispondenza del massimo di clorofilla. Proteine Gamma-proteobacterial sono stati equamente distribuiti in tutta la colonna d'acqua mentre le proteine beta-proteobacterial sono stati trovati prevalentemente in superficie . Daun punto di vista funzionale, una vasta gamma di vie metaboliche sono state identificate. Strutturazione verticale di queste vie metaboliche era evidente. Ad esempio, proteine associate con il metabolismo degli amminoacidi, metabolismo dei carboidrati e percorsi fissazione del carbonio procariotico state identificate soprattutto sulla superficie, e il metabolismo dell'azoto è stato trovato solo in superficie. Proteine fissazione del carbonio fotosintetici sono state osservate principalmente al massimo clorofilla mentre proteine coinvolte nella fotosintesi sono stati identificati in modo uniforme tra la superficie e la clorofilla massima. Questi risultati dimostrano che una grande varietà di proteine da una diversità di taxa microbica può essere rilevato utilizzando il protocollo qui presentata.
Figura 1:. Il DNA genomico da 2 profondità alla stazione artica S633 La prima corsia contiene 4 ml di un 1 kb di DNA lvipera, corsia 2 contiene 3 ml di estrazione del DNA genomico da S633_2 m, corsia 3 contiene 3 ml di estrazione del DNA genomico da S633_20 m e corsie 4-6 contengono 0,5 ml (85 ng), 2 ml (333 ng) e 4 pl ( 667 ng) di HindIII digerito lambda DNA.
Figura 2:. Analisi tassonomica e funzionale di 2 profondità alla stazione artica S633 confronto diversità tassonomica degli Arctic stazione 633 acque di superficie e clorofilla massimo (A) creata usando MEGAN. Confronto diversità funzionale delle artiche stazione 633 acque di superficie e clorofilla massimo (B) creata usando MEGAN per interrogare sul database KEGG. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Conservazione del campione è fondamentale per gli studi metaproteomic e lavoro precedente ha dimostrato che una soluzione di stabilizzazione RNA è un buffer di archiviazione utile per conservare le cellule prima dell'estrazione delle proteine 28. Idealmente, i campioni dovrebbero essere conservati in situ di negare cambiamenti nell'espressione delle proteine durante la movimentazione 33,34. Infatti, in situ sono state sviluppate tecnologie di campionamento e di fissaggio, che consentono la raccolta e la conservazione autonoma di campioni da strumenti navali dispiegati. Tuttavia, l'accesso a queste tecnologie non è sempre possibile. Nel caso comune che non lo è, i campioni devono essere conservati più presto possibile dopo la raccolta.
Qui vi presentiamo un protocollo per l'estrazione di proteine da cellule Soluzione conservata stabilizzazione RNA raccolti su una unità filtrante a cartuccia, che è comunemente usato in microbiologia acquatica. Il protocollo comprende lisi cellulare utilizzando una soluzione di SDS-lisi e riscaldamento, seguito da un protein fase di concentrazione utilizzando unità filtranti ultracentrifugo che raddoppiato come un passo necessario dissalazione. Si deve notare che le fasi di concentrazione e dissalazione non possono essere trascurati. Abbiamo scoperto che un minimo di tre fasi di scambio tampone è stato richiesto di desalt nostro concentrato. Grazie alla alta concentrazione salina della soluzione di stabilizzazione RNA, se corretta dissalazione non si verifica, troppo sale sarà precipitato nel corso della fase di precipitazione della proteina durante la notte e il passo desalificazione e precipitazioni dovrà essere ripetuto. Inoltre, se la desalinizzazione non è stato eseguito correttamente la 1D-PAGE non funziona ei campioni andranno persi.
Successivamente, il lisato concentrato è stato diviso in modo che possano essere eseguite sia la precipitazione delle proteine e la precipitazione del DNA. Ciò è utile in quanto è spesso desiderabile che i dati metagenomic e metaproteomic essere generati dagli stessi campioni. Se una proteina non è rappresentato nel database di sequenze proteiche allora il peptide sarànon essere identificati. Compresi i dati genomici dallo stesso campione come dati proteomica riduce il rischio di non essere in grado di identificare una proteina a causa della sua assenza dal database.
Anche se questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso con unità filtranti cartuccia e convalidato per lavorare su oceano costiero comunità microbiche, può essere adattato per l'utilizzo con altri tipi di campioni ambientali e filtri. Tuttavia, dovrebbe essere chiaramente indicato che il successo di questo protocollo è dipendente da una quantità sufficiente di biomassa di partenza. Quindi in ecosistemi acquatici in cui la biomassa può essere molto bassa, si consiglia di aumentare il volume di acqua filtrata conseguenza.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2 ml ROBO vial 9 mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
References
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
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