Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.
Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.
Nieren handhaven homeostatische balans voor diverse stoffen en reguleren bloedvolume op een manier die totaal bloeddruk bepaald. Verstoringen in de renale filtratie, reabsorptie of secretie leiden of begeleiden pathologische toestanden, gaande van hyper- of hypotensie tot eind nierziekte die uiteindelijk nodig niertransplantatie. De renale filtereenheid (glomerulus) bestaat uit drie lagen – de capillaire endotheel, basaalmembraan en een eencellige laag van epitheelcellen – podocytes, die een belangrijke rol in de handhaving van het spleetvormige diafragma integriteit en functie 1 zijn. Disfunctie in de permselectief glomerulaire filter veroorzaakt urine verlies van macromoleculen, zoals proteïnurie. Verschillende middelen kunnen de structuur van de podocytes en hun voeten processen die de integriteit van de glomeruli filtratie barrière bepalen beïnvloeden.
De podocytes zijn betrokken bij het onderhoud van de Glomeruli filtratie functie. Vastgesteld is dat incorrect calciumhuishouding van de podocyte leidt tot celbeschadiging en speelt een belangrijke rol bij de progressie van verschillende vormen van nefropathie 2,3. Daarom is ontwikkeling van een model waarmee directe meting van intracellulaire calciumconcentratie veranderingen instrumentele voor onderzoek podocyte functie zijn. Geïsoleerde glomeruli werden eerder gebruikt in een groot aantal studies, waaronder het meten van albumine reflectiecoëfficiënt verandert 4 en evaluatie van de integrale cellulaire stromingen in de whole-cell elektrofysiologische patch-clamp metingen 5,6. In dit artikel beschrijven we het protocol dat de onderzoeker mogelijk maakt om intracellulaire calciumconcentratie verandert in reactie op verzoeken van farmacologische middelen te meten, schatten basale niveaus van calcium in de cellen, en beoordeelt afzonderlijke calciumkanalen activiteit. Ratometric calciumconcentratie metingen en patch-clamp electrophysiology werden gebruikt om veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie in het podocyte en kanaalactiviteit respectievelijk bepalen.
De hier beschreven benadering maakt voor de analyse van calciumhuishouding door podocytes van het knaagdier glomeruli. Deze techniek maakt het mogelijk de toepassing van de patch-clamp single channel elektrofysiologie en fluorescentie ratiometrische confocale beeldvorming. Echter, beide werkwijzen afzonderlijk worden gebruikt, als zodanig. De voorgestelde protocol heeft een aantal relatief eenvoudige stappen, waaronder 1) de nieren spoelen; 2) het isoleren van de glomeruli door differentiële zeven; 3) het uitvoeren van…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag naar Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) en Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) bedanken voor de uitstekende technische hulp bij microscopie experimenten. Gregory Blass is erkend voor kritische revisie van het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door de National Institutes of Health subsidie HL108880 en American Diabetes Association verlenen 1-15-BS-172 (AS), en de Ben J. Lipps Research Fellowship van de American Society of Nephrology (DVI).
Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
Tube rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Germany |
Nikon confocal microscope (inverted) | Nikon | Nikon A1R | Laser exitation 488nm. Emission filters 500-550nm and 570-620nm |
Objective | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
High vacuum grease | Dow Corning | Silicone Compound | |
Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
TEA chloride | Tocris | T2265 | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | without antibiotics |
BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% albumin solution |
Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
Steel sieves: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | screen for CD-1 |
Binocular microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
Binocular microscope | Nikon | SMZ745 | |
Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
Other basic reagents | Sigma-Aldrich |