Summary

Single-channel Análise e cálcio Criação de imagem do Podócitos do recentemente isolados glomérulos

Published: June 27, 2015
doi:

Summary

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Abstract

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Introduction

Rins manter o equilíbrio homeostático para várias substâncias e regular o volume de sangue de uma forma que determina a pressão arterial total. Distúrbios no filtração renal, reabsorção ou secreção de causar ou acompanham os estados patológicos, que variam de hiper ou hipotensão para a doença renal terminal que eventualmente exige transplante renal. A unidade de filtração renal (glomérulo) consiste em três camadas – o endotélio capilar, membrana basal e uma camada de célula única de células epiteliais – podócitos, que desempenham um papel importante na manutenção da integridade e função de um diafragma de fenda. Disfunção no filtro de permeabilidade selectiva glomerular provoca perda urinária de macromoléculas, tais como proteinúria. Vários agentes podem afectar a estrutura das podócitos e os seus processos de pé, que determinam a integridade da barreira de filtração glomérulos.

Os podócitos estão envolvidos na manutenção do glomfunção de filtração eruli. Foi estabelecido que a manipulação imprópria de cálcio pelo podócitos leva a lesão celular e desempenha um papel importante na progressão de várias formas de nefropatias 2,3. Portanto, o desenvolvimento de um modelo que permite a medição direta da variação da concentração de cálcio intracelulares será fundamental para estudos de função podocyte. Isolado glomérulos foram anteriormente utilizados em um numerosos estudos, incluindo medição do coeficiente de reflexão albumina muda 4 e avaliação das correntes celulares integral na de células inteiras eletrofisiológicos medições de patch-clamp 5,6. No presente artigo descrevemos o protocolo que permite ao pesquisador para medir as mudanças de concentração de cálcio intracelular em resposta aos pedidos de agentes farmacológicos, estimar os níveis basais de cálcio dentro das células, e avaliar indivíduo atividade canais de cálcio. Medições da concentração de cálcio Ratometric e patch-clamp electrophysiology foram usadas para determinar as alterações na concentração intracelular de cálcio no seio da actividade podócitos e canal, respectivamente.

Protocol

O uso de animais e bem-estar devem aderir ao Manual do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório seguindo protocolos revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC). 1. Lave rim Use 8 a 12 semanas de idade de ratos macho (sugerido é uma estirpe Sprague Dawley, no entanto outras estirpes de idade e sexo diferente pode ser utilizado com modificações apropriadas). Anestesiar o animal de acordo com o procedimento permitido pelo…

Representative Results

Aqui abordamos o problema de medir alterações agudas nos níveis de cálcio nos podocytes. A Figura 1 mostra uma representação esquemática do protocolo experimental projetado para realizar alta resolução de imagem confocal de fluorescência ao vivo e gravações de atividade de canais iônicos individuais nos podocytes do recém- glomérulos isolados de roedores. Resumidamente, após o rato é anestesiados, os rins devem ser lavados com PBS para limpá-las de sangue. Em seguida, os rins são exci…

Discussion

A abordagem aqui descrita permite a análise de manuseamento de cálcio pelos podócitos dos glomérulos de roedores. Esta técnica permite a aplicação de patch-clamp eletrofisiologia canal único e fluorescência confocal ratiometric imagem. No entanto, ambas as abordagens podem ser utilizadas separadamente, por conta própria. O protocolo proposto tem várias etapas relativamente simples, incluindo rubor 1) rim; 2) isolamento dos glomérulos por peneiração diferencial; 3) realização de patch-clamp experimentos e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) e Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) para a assistência técnica excelente, com experimentos de microscopia. Gregory Blass é reconhecida pela revisão crítica do manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada pelos Institutos Nacionais de Saúde HL108880 concessão e American Diabetes Association conceder 1-15-BS-172 (para AS), eo Ben J. Lipps Research Fellowship da Sociedade Americana de Nefrologia (para DVI).

Materials

Fluo4 AM Life Technologies F14217 500µl in DMSO
FuraRed AM Life Technologies F-3020
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Ionomycin Sigma-Aldrich I3909-1ML
Tube rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753 Germany
Nikon confocal microscope (inverted) Nikon Nikon A1R  Laser exitation 488nm. Emission filters 500-550nm and 570-620nm
Objective Nikon Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
High vacuum grease Dow Corning Silicone Compound
Software Nikon Nikon NIS-Elements 
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Nicardipine Sigma-Aldrich N7510
Iberiotoxin Sigma I5904-5UG
Niflumic acid Sigma-Aldrich N0630
DIDS Sigma-Aldrich D3514-25MG
TEA chloride Tocris T2265
RPMI 1640 Life Technologies 11835030 without antibiotics
BSA Sigma-Aldrich A8327 30% albumin solution
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Steel sieves: #100 (150 μm), 140 (106 μm)
Gilson, Inc  SIEVE 3 SS FH NO200 Fisher Sci 50-871-316
Gilson, Inc  SIEVE 3 SS FH NO270 Fisher Sci 50-871-318
Gilson, Inc  SIEVE 3 SS FH NO400 Fisher Sci 50-871-320
 mesh 200  Sigma-Aldrich s4145 screen for CD-1
Binocular microscope Nikon Eclipse TS100
Binocular microscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

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Cite This Article
Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli. J. Vis. Exp. (100), e52850, doi:10.3791/52850 (2015).

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