Summary

Single-kanal Analyse og Kalsium Imaging i Podocytes av nyisolerte glomeruli

Published: June 27, 2015
doi:

Summary

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Abstract

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Introduction

Nyrene opprett homeostatisk balanse for forskjellige stoffer og regulere blodvolum på en måte som bestemmer det totale blodtrykket. Forstyrrelser i nyrefiltrasjon, reabsorpsjon eller sekresjon føre til eller følge patologiske tilstander, alt fra hyper- eller hypotensjon å ende nyresykdom som etter hvert trenger nyretransplantasjon. Nyre filtrering enhet (glomerulus) består av tre lag – kapillære endotel, kjeller membran og en encellet lag av epitelceller – podocytes, som spiller en viktig rolle i vedlikehold av spaltegulvet integritet og funksjon 1. Dysfunksjon i det permselektive glomerulær filteret forårsaker tap av urin makromolekyler, slik som proteinuri. Forskjellige midler kan påvirke strukturen av podocytes og deres fot prosesser, som bestemmer integriteten av glomeruli filtreringsbarriere.

De podocytes er involvert i vedlikehold av glomeruli filtrering funksjon. Det har blitt fastslått at kalsium uriktig håndtering av podocyte leder til celleskade og spiller en viktig rolle i progresjonen av forskjellige former av nefropatier 2,3. Derfor er utvikling av en modell som tillater direkte måling av intracellulære kalsiumkonsentrasjonen endringer vil være medvirkende for studier av podocyte funksjon. Isolerte glomeruli ble tidligere brukt i en rekke studier, inkludert måling av albumin refleksjonskoeffisienten endrer 4 og vurdering av integrerte mobil strømninger i hel-celle elektro patch-clamp målinger 5,6. I den foreliggende beskrivelsen beskriver vi den protokoll som tillater forskeren til å måle intracellulære kalsiumkonsentrasjonen endres som reaksjon på anvendelser av farmakologiske midler, estimere basale nivåer av kalsium i cellene og vurdere individuell kalsiumkanaler aktivitet. Ratometric kalsium konsentrasjonsmålinger og patch-clamp electrophysiology ble anvendt for å bestemme endringer i den intracellulære kalsiumkonsentrasjon innenfor podocyte og kanalaktivitet, respektivt.

Protocol

Animal bruk og velferd bør følge NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr følgende protokoller gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). 1. Nyre Flush Bruk 8 til 12 uker gamle hannrotter (antydet er en Sprague Dawley stamme, men andre stammer av forskjellig alder og kjønn kan brukes med passende endringer). Bedøve dyret i henhold til prosedyren som tillates av IACUC protokoll; overvåke anestesidybden og inspisere dyret. Den…

Representative Results

Her har vi løst problemet med å måle akutte endringer i kalsiumnivået i podocytes. Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av den eksperimentelle protokoll utviklet for å utføre høy oppløsning levende fluorescens konfokal avbildning og enkelt ion kanalaktivitet opptak i podocytes av ferskt isolerte gnager glomeruli. I korthet, etter at rotten bedøvet, nyrene skal skylles med PBS for å fjerne dem fra blod. Deretter blir skåret ut og nyrer Decapsulated, og glomeruli er isolert fra nyrebark ved…

Discussion

Den metode som er beskrevet her gjør det mulig for analyse av kalsium håndtering av podocytes av gnager glomeruli. Denne teknikken tillater bruk av patch-clamp enkelt kanal elektrofysiologi og fluorescens proporsjonal confocal bildebehandling. Imidlertid kan begge tilnærminger brukes separat, på egen hånd. Den foreslåtte protokollen har flere relativt enkle grep, inkludert 1) nyre flush; 2) isolering av glomeruli ved differensial sikting; 3) utføre patch-clamp elektrofysiologiske eksperimenter, eller inkubasjon a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å takke Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) og Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) for utmerket teknisk assistanse med mikroskopi eksperimenter. Gregory Blass er anerkjent for kritisk korrekturlesing av manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health tilskudd HL108880 og American Diabetes Association gi 1-15-BS-172 (til AS) og Ben J. Lipps Stipendiat fra American Society of Nefrologi (til DVI).

Materials

Fluo4 AM Life Technologies F14217 500µl in DMSO
FuraRed AM Life Technologies F-3020
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Pluronic acid Sigma-Aldrich F-68  solution
Ionomycin Sigma-Aldrich I3909-1ML
Tube rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753 Germany
Nikon confocal microscope (inverted) Nikon Nikon A1R  Laser exitation 488nm. Emission filters 500-550nm and 570-620nm
Objective Nikon Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil
Cover Glass Thermo Scientific 6661B52
High vacuum grease Dow Corning Silicone Compound
Software Nikon Nikon NIS-Elements 
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Patch Clamp amplifier Molecular Devices MultiClamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices Digidata 1440A Axon Digidata® System
Low Pass Filter Warner Instruments LPF-8 8 pole Bessel
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150F-4
Micropipette Puller Sutter Instrument Co P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microforge Narishige MF-830 Japan
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-225
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti
Microvibration isolation table TMC equipped with Faraday cage
Multichannel valve perfusion system AutoMake Scientific Valve Bank II
Recording/perfusion chamber Warner Instruments RC-26
Software Molecular Devices pClamp 10 . 2
Nicardipine Sigma-Aldrich N7510
Iberiotoxin Sigma I5904-5UG
Niflumic acid Sigma-Aldrich N0630
DIDS Sigma-Aldrich D3514-25MG
TEA chloride Tocris T2265
RPMI 1640 Life Technologies 11835030 without antibiotics
BSA Sigma-Aldrich A8327 30% albumin solution
Temperature controlled surgical table  MCW core for rodents
Steel sieves: #100 (150 μm), 140 (106 μm)
Gilson, Inc  SIEVE 3 SS FH NO200 Fisher Sci 50-871-316
Gilson, Inc  SIEVE 3 SS FH NO270 Fisher Sci 50-871-318
Gilson, Inc  SIEVE 3 SS FH NO400 Fisher Sci 50-871-320
 mesh 200  Sigma-Aldrich s4145 screen for CD-1
Binocular microscope Nikon Eclipse TS100
Binocular microscope Nikon SMZ745
Syringe pump-based perfusion system Harvard Apparatus
polyethylene tubing Sigma-Aldrich PE50
Isofluorane anesthesia http://www.vetequip.com/ 911103
Other basic reagents Sigma-Aldrich

References

  1. Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
  2. Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
  3. Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
  4. Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
  5. Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
  6. Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
  7. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
  8. Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
  9. Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
  10. Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
  11. Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771 (2009).
  12. Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
  13. Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
  14. Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
  15. Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
  16. Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
  17. Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
  18. Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
  19. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
  20. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
  21. Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
  22. Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
  23. Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).

Play Video

Cite This Article
Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli. J. Vis. Exp. (100), e52850, doi:10.3791/52850 (2015).

View Video